运用组织培养获得龙须菜优良种苗的方法

摘要

本发明涉及海藻组织培养、海藻遗传选育及养殖，运用组织培养技术获得龙须菜优良种苗的方法。本发明通过龙须菜野生种的筛选，对其不同组织部位进行筛选及培养；在适宜的光照、温度及培养基条件下，获得具有优良性状的龙须菜，步骤为：1)通过龙须菜藻体不同部位的筛选及处理，获得顶端及分枝部的藻体组织，可用于龙须菜的快速繁殖及种苗培养；2)在光照培养箱内进行组织培养；3)培养基组分：半固体培养基及液体ES富营养培养基；4)夹苗及海上养殖；5)生长速率的测定；6)琼胶的提取及凝胶强度的测定。采用本发明获得优良性状的龙须菜，用于养殖生产，龙须菜的日生长率为10－13％，凝胶强度为800～1000g/cm

说明书

技术领域

本发明涉及海藻组织培养、海藻遗传选育及养殖，具体来讲是通过龙须菜野生种的筛选，对其不同组织部位进行筛选及培养；在适宜的光照、温度及培养基的条件下，获得具有优良性状的龙须菜；用于养殖生产，主要生产性状是龙须菜的日生长率为10-13％，凝胶强度为800-1000g/cm²。

背景技术

龙须菜含有琼胶(琼脂)，是制备琼胶素(Agarose)的主要原料之一。目前已在食品、医药、化工、科研等领域中得到广泛应用，全世界琼胶的年产量有6000吨，其中江蓠属产琼胶的产量达到60％。随着世界经济等各方面的发展，世界各国对琼胶的需求量会日益增大。

我国自50年代起，就开始进行江蓠(龙须菜)、石花菜栽培的研究，取得半人工养殖技术的成功，但江蓠、石花菜养殖规模仍停留在试验阶段，离规模化生产还有相当的距离。另外，关键技术在于江篱优良品种的选育及种苗来源依然没有得到根本的解决，种苗生长速度较慢。另外有的单位采集野生种菜，进行人工养殖，但其生产性状表现不稳定。因此要从组织培养角度，进行龙须菜的组织培养及遗传选育，培养出具有生产上可以应用的品种，即生长速度快，凝胶强度高的品种，以满足我国江篱养殖及加工的需要。

国外智利、委内瑞拉、墨西哥等国进行了江篱的人工栽培试验，但养殖技术等依然存在许多问题。菲律宾、南非等国主要靠采集野生江篱用于生产琼胶，但这种靠开采野生资源的开发方式，必然会在将来导致了其海藻资源量的下降，破坏藻类的生物多样性以及沿海的生态环境，导致江蓠自然资源难以恢复。因此，建立龙须菜优良种苗繁育的核心技水，结合不同的养殖环境，开展龙须菜优良品种的选育及人工栽培，是解决琼胶原料短缺的有效途径。

龙须菜优良品种的选育及繁殖的研究课题，早在国家“八五”期间，我们在山东省科委立项“龙须菜全人工养成技术的中间试验”的基础上，结合组织培养技术，进一步开展遗传选育技术。筛选出生长速率快，凝胶强度高的优良苗。在此基础上，与国内许多家养殖单位合作及协作，进行了龙须菜优良品种生产推广，所表现的生产性状，达到了预期的目的，在养殖生产中取得良好的经济效益及社会效益。

龙须菜优良品种的选育及繁育，不仅为藻类人工养殖提供了新品种，也为生态养殖提供了良好的养殖对象。近年来，我国鱼、虾、贝人工养殖业发展较快，局部海域环境恶化，导致病害发生，现在已经开展了龙须菜与鱼、扇贝等混养，这可以改善沿海的养殖生态环境，缓解病害的发生。另外，鲍鱼等需要一定活鲜植物饵料，如果以龙须菜喂养，可以缓解在夏季高温期因海藻饵料短缺难以保证鲍鱼饵料需求，这项工作在我国南方福建、海南等地区已经推广，因此，开展龙须菜优良品种的选育及规模养殖具有明显的经济及社会效益。

发明内容

本发明目的是提供一种运用组织培养获得龙须菜优良种苗的方法，通过选择龙须菜藻体不同部位筛选，进行组织培养，在适宜的光、温及营养盐条件下，获得龙须菜快速繁育的优良种苗，进行夹苗及快繁，并用于生产性养殖。其生产性状表现为：日生长率达到10-13％，凝胶强度为800-1000g/cm²，在我国南、北方沿海适宜的海区条件下，在温度范围内15-25℃，均表现为连续快速生长，并实现多茬养殖。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种运用组织培养获得龙须菜优良种苗的方法，通过龙须菜野生种的筛选，对藻体不同组织部位进行取材及处理、组织培养，在光照、温度及培养基的条件下，获得具有优良性状的龙须菜；具体步骤如下：

1)通过对龙须菜藻体顶端、中部、分枝部及基部的剪切，先去除藻体表面的附着物及杂藻，进行灭菌处理；然后在琼脂半固体培养基上培养，待生长出幼芽后，将生长出的幼苗转移到液体ES富营养培养基上培养，经过30-40天培养，获得顶端及分枝部的龙须菜组织；

其中，半固体培养基的制备过程为：将琼脂1-1.5％(w/v)制成平板培养基，加过滤消毒海水，该海水中含1-1.5ppm NO₃^-、0.1-0.3ppm PO₄^3-，液体ES富营养培养基按以下配方混制而成：

按重量份数计，蒸馏水，90-110份；NaNO₃，300-400份；甘油磷酸钠，45-55份；乙二胺四己乙酸铁，2.0-2.8份，其中铁与乙二胺四己乙酸的摩尔比为1∶1；PII金属元素溶液20-30份；PII金属元素溶液的制备是在100份蒸馏水中溶解350-360份Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O和280-320份乙二胺四己乙酸二钠，维生素B₁₂，0.01-0.03份；维生素B1，0.2-0.7份；生物素，0.005-0.008份；三羟甲氨基甲烷钠，500-550份；H₃BO₃，110-120份；FeCl₃·6H₂O，4.0-5.0份；MnSO₄·4H₂O，15.0-17.0份；ZnSO₄·7H₂O，1.5-2.5份；CoSO₄·7H₂O，0.40-0.50份；乙二胺四己乙酸二钠，90-110份，调节pH到7.5-8.0，每100mL消毒海水中加ES加富营养液2-5mL的培养液，然后再用于组织培养；

2)在光照培养箱内进行组织培养：培养液采用液体ES富营养培养基，光照强度18-25 uE.m^-2.s^-1；温度20-25℃；光周期L∶D＝12∶12，培养液每4-5天更换1次，培养时间为35-40天；

3)夹苗及海上养殖：生长出的小幼苗，在室内夹苗于维尼龙绳上，培养温度20-25℃，使用过滤消毒海水，并在其中加入含1ppm NO₃^-、0.1ppm PO₄^3-的氮磷营养盐，经过40-50天的培养，再将藻体取下，转移到养殖用的苗上，转移到海上养殖。

所述步骤3)之后进行龙须菜生长速率的测定，将放养的龙须菜分别夹苗在苗绳上，经过30-40天的海上养殖，测定龙须菜重量；再经过分苗及海上养殖，经过30-40天的养殖，测定龙须菜重量，从而获得龙须菜的生长速率。

所述步骤3)之后进行琼胶的提取及凝胶强度的测定。

所述凝胶强度的测定，用1.2-1.5％(w/v)琼胶溶液制成凝胶，放置18-24小时后，测定琼胶强度。采用该方法获得的龙须菜，在温度范围为15-25℃范围内，其主要生产性状是龙须菜的日生长率为10-13％，琼胶的凝胶强度为800-1000g/cm²。

本发明的有益效果是：

1、本发明通过龙须菜野生种的筛选，对藻体不同组织部位进行取材及处理，组织培养，在适宜的光照、温度及培养基的条件下，获得具有优良性状的龙须菜，可用于养殖生产，采用本发明获得龙须菜优良种苗，在中国南方及北方的适宜养殖海区，在温度范围为15-25℃范围内，所表现的生产性状为：日生长率为10-13％，琼胶的凝胶强度为800-1000g/cm²。

2、本发明通过龙须菜藻体不同部位(藻体顶端、中部、分枝部及基部等)的剪切，经过筛选及处理，在适宜的培养基上培养，获得顶端及分枝部的龙须菜组织，可以快速繁殖，并能用于龙须菜种苗的规模培养。

附图说明

图1是经组织培养选育室内培养35天后龙须菜生长状况图片。

图2是经过30天养殖后龙须菜选育品种的生长状况图片。

图3是实施例1现场养殖状况图片。

图4是实施例2现场养殖状况图片。

图5是采集的野生龙须菜照片及经过35天养殖后的龙须菜的生长状况。

图6是本发明的工艺流程图。

具体实施方式

实施例1

本发明运用组织培养获得龙须菜优良种苗的方法，通过龙须菜野生种的筛选，对藻体不同组织部位进行取材及处理、组织培养，在适宜的光照、温度及培养基的条件下，获得具有优良性状的龙须菜；其工艺流程如图6所示，所涉及的步骤如下：

1)龙须菜藻体不同部位的筛选：从青岛海边采集野生的龙须菜，经过3年以上的海上养殖驯化，再从中挑选新鲜的藻体，进行室内人工选育。先进行常规处理，用灭菌毛笔进行藻体的洗刷，去除藻体表面的附着物及杂藻，然后用70％酒精处理5-15秒，灭菌海水冲洗4-5遍。再剪取藻体顶端、中部、分枝部及基部，每段藻枝段长度2cm，在适宜的培养基上培养，先在琼脂半固体培养基上培养，待生长出幼苗后，将生长出幼苗转移到液体ES(Enrichment solution)富营养培养基上培养，每三角烧瓶(100ml)装有液体ES富营养培养基50ml，经过30天培养，获得顶端及分枝部的藻体组织，可用于龙须菜的快速繁殖及种苗培养。

龙须菜组织培养条件：在光照培养箱内进行组织培养，培养条件：光照强度20uE.m^-2.s^-1；温度20℃；光周期12∶12(L∶D)，培养液每5天更换1次，培养时间为35天。

2)培养基组分：半固体培养基是将琼脂1％(w/v)制成平板培养基，凝固以后，再加过滤消毒海水(含1ppm NO^3-，0.1ppm PO₄^3-)。液体ES(Enrichmentsolution)富营养液配方：蒸馏水，100mg；NaNO₃，350mg；甘油磷酸钠(Na₂glycerophosphate)，50mg；乙二胺四己乙酸铁(Fe-EDTA，Fe与EDTA的摩尔比为1∶1)，2.5mg；PII金属元素(metals)溶液25mg(其中PII金属元素溶液是在100mg蒸馏水中溶解351mg Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O和300mg Na₂EDTA)，维生素B₁₂，10μg；维生素B1(Thiamine)，0.5mg；生物素(维生素H)，5μg；三羟甲氨基甲烷钠(Tris.Na)，500mg；H₃BO₃，114mg；FeCl₃·6H₂O，4.9mg；MnSO₄·4H₂O，16.4mg；ZnSO₄·7H₂O，2.2mg；CoSO₄·7H₂O，0.48mg；乙二胺四己乙酸二钠(Na₂EDTA)，100mg，调节pH到7.8)。PII金属元素溶液按体积100mL贮存备用。配制好液体ES(Enrichment solution)富营养液后，使用时每100mL消毒海水中加2mL ES(Enrichment solution)富营养液。

3)夹苗及海上养殖：生长出的小幼苗，在室内夹苗于维尼龙绳上，每根绳(15cm)，夹苗10棵，在室内塑料箱内培养，培养温度20℃，使用过滤消毒海水，加氮磷营养盐(含NO₃^-，1ppm，PO₄^3-0.1ppm)，每5天更换1次培养海水。培养50天，龙须菜长成7cm左右的藻体。再将藻体取下，转移到养殖用的苗上，转移到海上养殖。

4)生长速率的测定：从放养龙须菜总重量1000g，分别夹苗在苗绳(维尼龙绳)上，经过30天(一茬养殖)的海上养殖，累计达到1300g。再经过分苗及海上养殖，经过30天的养殖，增加到1500g。

琼胶的提取及凝胶强度的测定，采用以下常规的方法：称取一定重量的龙须菜，加入10-12倍重量的人工海水(ASW，artificial seawater)溶液(酒精95％∶水∶NaOH＝400∶100∶15，v/v/w)，室温条件下保温3小时，倒出残液，用自来水反复冲洗藻体6-10次，再于淡水中浸泡24变成中性。另取20倍量的0.5％HCl溶液放入烧杯中，加入定量的固体亚氯酸钠，使溶解起反应，将洗好的龙须菜到入，搅拌5分钟，使藻体退色并变成软滑为止。倒去液体，换水，在其中加入0.5％硫代硫酸钠并搅拌10分钟。水洗5次使之变成中性。24小时后，取比干原料重30-40倍的自来水，加热至沸，再加漂白好的龙须菜，煮沸15分钟，中间搅拌，待大量胶溶出，用四层纱布过滤，放入搪瓷盘内，冷凝后放入冰箱，在-15℃以下冷冻1-2天，然后取出，放在铁丝网上晒干(1天)，得到琼胶。

用1.5％(w/v)琼胶溶液制成凝胶，24小时后，用凝胶强度测定仪器测定琼胶强度。

如图1所示经组织培养选育室内培养35天后龙须菜生长状况，如图2所示经过30天养殖后龙须菜选育品种的生长状况。从2001年到2003年，在福建蒲田地区沿海，在水温17-24℃的养殖季节内，开展了100亩中试，经过多茬分苗及养殖，从原来的夹苗1000kg，增加到5000kg。日生长速率为11％，凝胶强度为910g/cm²。如图3所示现场养殖状况。

实施例2

与实施例1不同之处在于：

1)通过对龙须菜藻体顶端、中部、分枝部及基部的剪切，先按常规方法去除藻体表面的附着物及杂藻，进行灭菌处理；然后在琼脂半固体培养基上培养，待生长出幼芽后，将生长出的幼苗转移到液体ES富营养培养基上培养，经过35天培养，获得顶端及分枝部的龙须菜组织；

其中，半固体培养基的制备过程为：将琼脂1.5％(w/v)制成平板培养基，加过滤消毒海水，该海水中含1.5ppm NO₃^-、0.2ppm PO₄^3-，液体ES富营养培养基按以下配方混制而成：

蒸馏水，110mg；NaNO₃，300mg；甘油磷酸钠，55mg；乙二胺四己乙酸铁，2.0mg，其中铁与乙二胺四己乙酸的摩尔比为1∶1；PII金属元素溶液20mg；PII金属元素溶液的制备是在100mg蒸馏水中溶解355mg Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O和280mg乙二胺四己乙酸二钠，维生素B₁₂，0.02mg；维生素B1，0.2mg；生物素，0.008mg；三羟甲氨基甲烷钠，520mg；H₃BO₃，110mg；FeCl₃·6H₂O，4.0mg；MnSO₄·4H₂O，17.0mg；ZnSO₄·7H₂O，1.5mg；CoSO₄·7H₂O，0.50mg；乙二胺四己乙酸二钠，110mg，调节pH到7.5，每100mL消毒海水中加ES加富营养液3mL的培养液，然后再用于组织培养；

2)在光照培养箱内进行组织培养：培养液采用液体ES富营养培养基，光照强度18uE.m^-2.s^-1；温度22℃；光周期L∶D＝12∶12，培养液每5天更换1次，培养时间为40天；

3)夹苗及海上养殖：生长出的小幼苗，在室内夹苗于维尼龙绳上，培养温度25℃，使用过滤消毒海水，并在其中加入含1ppm NO₃^-、0.1ppm PO₄^3-的氮磷营养盐，经过40天的培养，再将藻体取下，转移到养殖用的苗上，转移到海上养殖。

4)龙须菜生长速率的测定，将放养的龙须菜分别夹苗在苗绳上，经过40天的海上养殖，测定龙须菜重量；再经过分苗及海上养殖，经过40天的养殖，测定龙须菜重量，从而获得龙须菜的生长速率。

5)琼胶的提取及凝胶强度的测定。用12％(w/v)琼胶溶液制成凝胶，放置20小时后，测定琼胶强度。

2002年到2003年，在山东荣成地区沿海，在水温15-21℃的养殖季节内，开展了50亩的中试，经过多茬分苗及养殖，从原来的夹苗500kg，增加到1300kg。日生长速率达到12.5％，琼胶的凝胶强度达到923g/cm²。如图4所示现场养殖状况。

实施例3

与实施例1不同之处在于：

1)通过对龙须菜藻体顶端、中部、分枝部及基部的剪切，先按常规方法去除藻体表面的附着物及杂藻，进行灭菌处理；然后在琼脂半固体培养基上培养，待生长出幼芽后，将生长出的幼苗转移到液体ES富营养培养基上培养，经过40天培养，获得顶端及分枝部的龙须菜组织；

其中，半固体培养基的制备过程为：将琼脂1.2％(w/v)制成平板培养基，加过滤消毒海水，该海水中含1.2ppm NO₃^-、0.3ppm PO₄^3-，液体ES富营养培养基按以下配方混制而成：

蒸馏水，90mg；NaNO₃，400mg；甘油磷酸钠，45mg；乙二胺四己乙酸铁，2.gmg，其中铁与乙二胺四己乙酸的摩尔比为1∶1；PII金属元素溶液30mg；PII金属元素溶液的制备是在100mg蒸馏水中溶解360mgFe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O和320mg乙二胺四己乙酸二钠，维生素B₁₂，0.03mg；维生素B1，0.7mg；生物素，0.006mg；三羟甲氨基甲烷钠，550mg；H₃BO₃，120mg；FeCl₃·6H₂O，4.5mg；MnSO₄·4H₂O，15.0mg；ZnSO₄·7H₂O，2.5mg；CoSO₄·7H₂O，0.40mg；乙二胺四己乙酸二钠，90mg，调节pH到8.0，每100mL消毒海水中加ES加富营养液5mL的培养液，然后再用于组织培养；

2)在光照培养箱内进行组织培养：培养液采用液体ES富营养培养基，光照强度25uE.m^-2.s^-1；温度25℃；光周期L∶D＝12∶12，培养液每4天更换1次，培养时间为36天；

3)夹苗及海上养殖：生长出的小幼苗，在室内夹苗于维尼龙绳上，培养温度22℃，使用过滤消毒海水，并在其中加入含1ppm NO₃^-、0.1ppm PO₄^3-的氮磷营养盐，经过45天的培养，再将藻体取下，转移到养殖用的苗上，转移到海上养殖。

4)龙须菜生长速率的测定，将放养的龙须菜分别夹苗在苗绳上，经过35天的海上养殖，测定龙须菜重量；再经过分苗及海上养殖，经过35天的养殖，测定龙须菜重量，从而获得龙须菜的生长速率。

5)琼胶的提取及凝胶强度的测定。用1.3％(w/v)琼胶溶液制成凝胶，放置18小时后，测定琼胶强度。在温度范围为20-25℃范围内，其主要生产性状是龙须菜的日生长率为12％，琼胶的凝胶强度为880g/cm²。

比较例1

从2002年采集的野生龙须菜，在山东胶南沿海，进行了10亩的养殖，在水温16-21℃养殖季节内，野生菜所表现的性状不稳定，而且养殖中藻体颜色变浅，原来的夹苗20kg，增加到60kg。日生长速率达到8.5％，琼胶的凝胶强度达到787g/cm²。如图5所示采集的野生龙须菜照片及经过35天养殖后的龙须菜的生长状况。