法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-11-20
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):A61K39/12 授权公告日:20100113 终止日期:20121001 申请日:20031001
专利权的终止
2010-01-13
授权
授权
2006-03-01
实质审查的生效
实质审查的生效
2006-01-04
公开
公开
发明领域
本发明涉及肿瘤治疗领域，更具体地说，本发明涉及非致病性病毒作为有效抗癌药物的应用。
发明背景
缩写单词表
A549 -人肺上皮肿瘤细胞系
AcNPV -苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒
BMDC -骨髓衍生的树突细胞
BV422 -表达CCL21的重组杆状病毒
BV762 -表达Raf的重组杆状病毒
CCL21 -C-C基序配体21趋化因子；次级淋巴组织趋化因子
CD86 -树突细胞成熟的标记物
CR -完全有效
CTL -细胞毒T细胞溶解
DC -树突细胞
FACS -荧光激活细胞分选
GM-CSF -粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子
GV -颗粒体病毒
HIV -人免疫缺陷病毒
i.t. -肿瘤内
mCCL21 -鼠CCL21
MHC -主要组织相容性复合物
MHCII -MHCII类分子
MLA-DR -MHCI类分子抗原
MOI -感染复数
NPV -核型多角体病毒
PBMC -外周血单核细胞
PFU -噬斑形成单位
qd -每天每天(每日给药)
rhCCL21 -重组人CCL21
s.c. -皮下注射
Sf(Sf9) -草地夜蛾
Tn(Tn5) -粉纹夜蛾
UV -紫外线
VLP -病毒样颗粒
发明背景
调节免疫应答已经成为一种重要的肿瘤治疗策略。目前在设计肿瘤疫苗及免疫治疗措施时注意力主要集中在鉴定肿瘤细胞特异性的抗原上。利用肿瘤特异性抗原或表达肿瘤特异性抗原的基因所具有的独特的肿瘤免疫原性可以通过疫苗免疫来诱导出肿瘤特异性的免疫应答。疫苗接种方法也包括适应性细胞免疫治疗方法，其中抗原提呈细胞经改造后可提呈肿瘤相关抗原。其他的肿瘤免疫治疗措施包括给予细胞因子和趋化因子，这些因子在抗肿瘤治疗中可作为佐剂或药物产生疗效，因为它们具有扩增和补充免疫效应细胞的能力。见Homey等，(2002)Nat Rev Immunol 2：175-84；Parmiani等，(2002)J Natl Cancer Inst 94：805-18；Bronte(2001)Curr Gene Ther1：53-100；以及Fehniger等，(2002)Cytokine Growth Factor Rev 13：169-83。
免疫治疗措施虽然具有上述优点，但是要想取得成功还受到下列因素的限制：(1)肿瘤特异性的抗原性，因此这种治疗方法还只限于某些类型的肿瘤；(2)肿瘤细胞提呈抗原的能力弱；以及(3)肿瘤细胞可以产生免疫抑制因子来逃避免疫监视。因此，在本领域中一直需要找到一种有效而广谱的肿瘤治疗措施。为了满足这一需求，本发明提供了新型的免疫刺激方法以治疗和预防肿瘤。
发明概述
本发明提供了诱导动物产生免疫应答的方法，该方法包括给予动物一定量的组合物，该组合物包含能有效诱导动物产生免疫应答的灭活的非致病性病毒。
本发明还提供了导致细胞死亡的方法，该方法包括将含有一定量的非致病性病毒的组合物给予细胞以导致细胞的死亡。
另外，本发明还提供了在动物体内刺激CTL反应的方法，该方法包括将含有一定量的非致病性病毒的组合物给予动物以刺激动物体内的CTL反应，其中非致病性的病毒是昆虫特异性病毒。
本发明提供了抑制动物体内肿瘤生长的方法，该方法包括将一定量的含有昆虫特异性的非致病性病毒的组合物给予动物以有效抑制动物体内肿瘤的生长。
本发明还提供了影响动物体内肿瘤缓解的方法，该方法包括将一定量的含有非致病性病毒的组合物给予动物以有效地影响肿瘤的缓解。
本发明还提供了抑制动物体内肿瘤转移的方法，该方法包括将一定量的含有非致病性病毒的组合物给予动物以有效地抑制肿瘤在动物体内的转移。
本发明提供了使动物对再次接种的肿瘤耐受的方法，该方法包括将含有非致病性病毒的组合物给予动物。
另外，本发明还提供了抑制动物体内的非肿瘤性增生性疾病的方法，该方法包括将含有非致病性病毒的组合物给予动物。
本发明还提供了抑制动物体内的异常增生或化生的方法，该方法包括将一定量的含有非致病性病毒的组合物给予动物以有效地抑制动物体内的异常增生。
本发明还提供了抑制患病个体的一种或多种肿瘤症状的方法，该方法包括将一定量的含有非致病性病毒的组合物给予患病个体以有效地抑制其体内的一种或多种肿瘤症状。
另外，本发明还提供了保护动物不受感染性疾病感染的方法，该方法包括将一定量的含有非致病性灭活病毒的组合物给予动物以有效地保护动物不受感染性疾病的感染。
本发明还提供了抑制动物体内感染性疾病的方法，该方法包括将一定量的含有非致病性病毒的组合物给予动物以有效地防止动物发生感染性疾病。
本发明提供了导致一群细胞发生死亡的方法，该方法包括使细胞群中的部分细胞与含有一定量的非致病性病毒的组合物接触以有效地导致该细胞群发生细胞死亡。
本发明提供了治疗疾病患者疾病的方法，该方法包括灭活非致病性病毒，其中非致病性病毒通过加入浓度约为5-10μg/ml的trioxalen并在约365nm和6W的紫外线下照射15分钟加以灭活，将灭活的非致病性病毒制备成药物组合物；以及将药物组合物给予患者。
本发明还提供了预测一种化合物在体内的抗肿瘤活性的方法，该方法包括使化合物与肿瘤细胞和外周血单核细胞接触；以及测定肿瘤细胞的死亡率。能引起被接触肿瘤细胞死亡的化合物被认为是具有体内活性的化合物。
另外，本发明提供了阻止个体产生肿瘤的方法，该方法包括将一定量的含有非致病性病毒的组合物给予个体以有效地防止个体发生肿瘤。
另外，本发明提供了包含非致病性病毒和外周血单核细胞(PBMC)的组合物。
本发明还提供了包含非致病性病毒的组合物，其中的非致病性病毒至少通过两种不同的方法灭活。
本发明还提供了包含非致病性病毒和至少一种PBMC的组合物，其中的非致病性病毒用选自如下一组的两种或两种以上的方法灭活：基因灭活、化学灭活、光化学灭活、紫外线灭活、热灭活或放射线灭活。
本发明提供了制备包含非致病性病毒的抗肿瘤或抗感染性疾病组合物的过程。该过程包括将病毒暴露于第一灭活剂以有效地灭活活性病毒，将病毒暴露于第二灭活剂以有效地灭活活性病毒，将病毒与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，以及用体外试验证明病毒是无活性的。
本发明还提供了包含一种非致病性的灭活病毒和至少一种抗原以及至少一种佐剂的药物组合物，其中的抗原与非致病性的灭活病毒明显不同。
另外，本发明还提供了包含佐剂组合物的免疫刺激组合物。佐剂组合物含有非致病性的灭活病毒和至少一种抗原。该抗原与佐剂组合物不同，另外，免疫刺激组合物还能够提高机体对抗原的免疫应答。
本文所描述的方法涉及人体的治疗，但是这些方法也可用于治疗需要治疗的任何哺乳动物。在某些实施方式中，可用本发明的方法治疗或预防的肿瘤和非肿瘤性疾病包括而不限于肺、乳腺和皮肤的肿瘤和非肿瘤性疾病。在某些实施方式中，感染性疾病也可被治疗或预防，其中包括病毒感染。
本发明还提供了可用于本文所描述的抗癌方法中的非致病性病毒，这些非致病性病毒包括活病毒、灭活病毒、病毒颗粒、病毒体、病毒样颗粒、病毒包含体或病毒成分。在某些实施方式中，病毒成分包括肽、蛋白、核酸、脂质、糖及其混合物。在某些实施方式中，病毒成分是gp16。
在某些实施方式中，非致病性病毒是昆虫特异性病毒。在某些实施方式中，昆虫特异性病毒是杆状病毒科的病毒。例如，本发明的非致病性病毒包括核型多角体病毒或颗粒体病毒。在某些实施方式中，非致病性的病毒是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。
在某些实施方式中，为了治疗肿瘤将非致病性病毒以及选择添加的抗原和/或佐剂通过瘤内注射和/或瘤旁注射给予哺乳动物受试者。在某些实施方式中，为了治疗非肿瘤性增生性疾病将非致病性病毒以及选择添加的抗原和/或佐剂通过病变部位内注射和/或病变部位旁注射给予哺乳动物受试者。治疗方案可以是多次注射非致病性病毒，还可以选择添加其他抗癌治疗措施。
附图简述
图1是一个线形图，描述的是表达CCL21的杆状病毒可在3LL肺癌鼠模型内抑制肿瘤的生长以及诱导肿瘤的完全缓解。如实施例2所描述，CCL21给药方案包括以所示的浓度在瘤内注射6次。随着注射剂量的增加肿瘤被抑制的程度及完全有效发生的几率也增加。24天时采集数据进行单因子变异数分析(One way ANOVAanalysis)。白蛋白组与治疗组相比P＜0.001；25μg mCCL21组与6μg/Alb mCCL21组相比P＜0.01；25μg mCCL21组与25μg rhCCL21组相比P＞0.05。mCCL21，鼠CCL21；rhCCL21，重组人CCL21；B Gold，杆状病毒表达的重组鼠CCL21，作为参考点(“GoldStandard”)；Alb，白蛋白；qd，每天(每日给药)；CR，完全有效。
图2是一个线形图，描述的是注射表达CCL21的杆状病毒后4T1乳腺癌鼠模型中肿瘤生长的抑制，如实施例3所描述。rhCCL21，重组人CCL21；qd，每天(每日给药)。
图3是一个柱形图，描述的是注射表达CCL21的杆状病毒后自发性4T1肺癌转移的抑制，如实施例6所描述。实心柱，未进行肿瘤手术切除的动物；阴影线柱，最末一次注射CCL21后1天进行肿瘤手术切除的动物。
图4是一个线形图，描述的是给予表达CCL21的杆状病毒可以使动物对再次接种的肿瘤耐受，如实施例5所描述。简言之，在Balb/c小鼠体内建立4T1肿瘤，其中一部分小鼠通过在瘤内注射表达CCL21的杆状病毒进行治疗。最后一次注射CCL21后1天，通过手术切除肿瘤。切除肿瘤后1天，在原肿瘤部位的对侧皮下注射4T1细胞给小鼠再次接种肿瘤。空白鼠是指未进行肿瘤接种也未进行CCL21处理的小鼠；Alb+Surg+Re-chlg，先接种T41肿瘤再进行白蛋白处理的小鼠；hCCL21+Surg+Re-chlg，先接种T41肿瘤再进行CCL21处理的小鼠。在Alb+Surg+Re-chlg组中，10只小鼠中有1只对肿瘤具有完全的抵抗力。在hCCL21+Surg+Re-chlg组，10只小鼠中有6只对肿瘤具有完全的抵抗力。
图5A-5B说明了杆状病毒诱导的对再接种肿瘤的抵抗力。在3LL肿瘤模型中，用表达CCL21的杆状病毒成功处理的动物对同种肿瘤的再次接种具有抵抗力，生存期延长。图5A总结了一个试验的结果，在该试验中，用表达鼠重组CCL21的杆状病毒处理后动物体内的肿瘤完全缓解(见图1)，在最后一次给予表达CCL21的杆状病毒后60、70和80天在原肿瘤位置的对侧给小鼠再次接种同种肿瘤。在至少70天内动物对再次接种的肿瘤具有抵抗力。图5B总结了另一个试验的结果，在该试验中，用表达CCL21的杆状病毒处理诱导肿瘤完全缓解(″肿瘤加强″)后30天给动物接种肿瘤，然后在最后一次给予表达CCL21的杆状病毒后80、120、160和200天在原肿瘤位置的对侧给小鼠再次接种同种肿瘤。这些结果表明利用肿瘤加强可使动物在至少200天内对再次接种的肿瘤具有抵抗力。
图6是一个线形图，描述的是酵母或大肠杆菌产生的CCL21在3LL肺癌模型中不能诱导肿瘤缓解。hCCL21-B(HBPG1)，杆状病毒表达的重组人CCL21，lot#HBPG1；hCCL21-B 1/2(HBPG1)，杆状病毒表达的重组人CCL21，lot#HBPG1，稀释到hCCL21(HBPG1)浓度的一半；hCCL21-B conc.(HBPG1)，来源于浓缩溶液(10mg/ml)的杆状病毒表达的重组人CCL21，lot#HBPG1；hCCL21-Y(HYPG4)，酵母表达的重组人CCL21，lot#HYPG4；hCCL21-E(HEDS4)，大肠杆菌表达的重组人CCL21，lot#HEDS4；qd，每天(每日给药)。用白蛋白处理的小鼠与用hCCL21-B或hCCL21-B new处理的小鼠相比，其肿瘤的生长受到抑制，P＜0.01；与用hCCL21-B conc或hCCL21-B1/2处理的小鼠相比，其肿瘤的生长也受到抑制，P＜0.05。
图7是一个线形图，描述的是在体内无活性的杆状病毒表达的CCL21制剂在体外的趋化活性。趋化活性的分析基本按照PCT国际专利文献WO 00/38706描述的方法进行。体内活性的评价描述于实施例2-6。HBDS2.p，杆状病毒来源的重组人CCL21，lot#HBDS2.p；MBDS2.c，杆状病毒来源的重组鼠CCL21，lot#MBDS2.c；HBPG1，杆状病毒来源的重组人CCL21，lot# HBPG1；HBPG1+HBDS2.vp，用乙烯吡啶处理的等比例的HBPG1和HBDS2混合物；HYPG4，酵母来源的重组人CCL21，lot#HYPG4；HEDS4，大肠杆菌来源的重组人CCL21，lot#HEDS4。
图8描述的是一个蛋白质印迹试验结果，其中所示的样品与抗gp64抗体杂交。条带1，纯化的杆状病毒；条带2，未感染的Tn5细胞培养物的条件培养基；条带3，感染野生型杆状病毒的Tn5细胞培养物的条件培养基；条带4，感染表达重组人CCL21的BV422的Tn5细胞培养物的条件培养基；条带5，未感染的Tn5细胞团；条带6，感染野生型杆状病毒的Tn5细胞团；条带7，感染BV422的Tn5细胞团；条带8，杆状病毒来源的人重组CCL2，lot#HBPG1过滤液，去掉＞50kDa(5μg蛋白质)的杂蛋白；条带9，含有＞50kDa(5μg蛋白质)杂蛋白的条带8的样品过滤液残留物；条带10，含有杂蛋白(10μg蛋白质)的条带8的样品过滤液残留物；条带11，5μg未过滤的杆状病毒来源的重组人CCL21，lot#HBPG1；条带12，5μg未过滤的杆状病毒来源的重组人CCL21，lot#HBDS4；条带13，5μg未过滤的杆状病毒来源的重组人CCL21，lot#HBMCl；条带14，5μg未过滤的杆状病毒来源的重组人CCL21，lot#HBDS1。
图9是一个线形图，描述的是经过过滤去掉高分子杂蛋白后的杆状病毒表达的CLL21的抗肿瘤活性。纯化的杆状病毒是CCL21制备物的污染物(图8)，与杆状病毒表达的CCL21制备物具有一样的肿瘤抑制活性。
图10A是一个线形图，描述的是当肿瘤细胞在体外与所示的组合物接触后PBMC介导的对肿瘤细胞的毒性，如实施例8所描述。细胞团所诱导的细胞毒反应比细胞上清液所诱导的细胞毒反应要高很多。感染表达CCL21的杆状病毒或对照杆状病毒BV762的细胞都表现出明显的细胞毒活性。GAM，未用细胞培养物调整的生长分析培养基(对照)；BV422，表达CCL21的杆状病毒；V762，表达Raf的杆状病毒。
图10B是一个线形图，描述的是当肿瘤细胞在体外与所示的经0.2μm滤膜过滤的组合物接触后PBMC介导的对肿瘤细胞的毒性，如实施例8所描述。通过过滤去掉高分子物质可使细胞毒活性显著下降。细胞团样品显示出残留的低度到中度的细胞毒活性。
图11A是一个柱形图，描述的是树突细胞经所示的刺激后CD86和MHC II表达的变化。实施例9描述了鼠骨髓衍生的树突细胞的制备方法和分析方法。表达HIV gag蛋白(VLP)的痘苗病毒作为阳性对照。与VLP一样，活的杆状病毒可诱导CD86和MHC II的表达，这两个分子是DC成熟的标志。黑色柱，CD86的表达；灰色柱，MHC II的表达。
图11B是一个柱形图，描述的是树突细胞经所示的刺激后CD86和MHC II表达的变化。实施例9描述了人单核细胞来源的树突细胞的制备方法和分析方法。表达HIV gag蛋白(p55 VLP)的痘苗病毒作为阳性对照。与p55 VLP一样，活的杆状病毒可诱导DC的成熟。黑色柱，CD86的表达；灰色柱，HLA-DR的表达。
图12描述的是铬释放试验的结果，试验方法见实施例10的描述。表达HIV gag蛋白(VLP)的痘苗病毒作为阳性对照。与VLP一样，活的杆状病毒可作为一种高效的佐剂诱导细胞毒T细胞的杀伤活性。
图13描述的是当肿瘤细胞在体外与所示的组合物接触后PBMC介导的对肿瘤细胞的毒性，如实施例8所描述。
图14描述的是PBMC细胞毒活性与体内抗肿瘤活性的关系。
图15描述的是用抗gp64单克隆抗体阻断杆状病毒的肿瘤细胞杀伤效应。见实施例13。
图16描述的是灭活杆状病毒在体外诱导的PBMC介导的肿瘤细胞杀伤作用。见实施例14。
图17表明肿瘤细胞是杆状病毒的主要靶位。见实施例15。
图18描述的是杆状病毒在肺癌动物模型中的肿瘤生长抑制效应。见实施例16。
图19描述的是杆状病毒在体内和体外诱导的对致病性病毒感染的保护作用。细胞在体外和体内用水泡性口炎病毒(VSV)感染。见实施例17。
图20描述的是旁观者效应。当肿瘤细胞群中20％的细胞与杆状病毒接触后就可以达到最大杀伤效应。
发明详述
A1.非致病性病毒的抗肿瘤活性
治疗肿瘤的免疫学方法包括以趋化因子作为治疗性药物。趋化因子是一族同源性蛋白质，其功能包括：(a)介导淋巴细胞的迁移和活化；(2)调节血管生成；(c)以及维持免疫平衡和次级淋巴器官的结构。见Baggiolini等，(1997)Annu Rev Immunol 15：675-705；Jung & Littman(1999)Curr Opin Immunol 11：319-25；以及Homey等，(2002)Nat Rev Immunol 2：175-84。
如实施例1-6所描述，在研究利用次级淋巴组织趋化因子(本文称为“CCL21”；本领域中也被称为SLC、Exodus-2和6C-kine)进行肿瘤的免疫治疗的过程中，本发明的发明者惊奇地发现非致病性的病毒是具有高活性的抗肿瘤因子。见实施例7。
因此，本发明提供了方法以治疗需进行抗癌治疗的患者，其中包括通过给予患者非致病性的病毒以抑制肿瘤的生长，抑制肿瘤的转移以及诱导对肿瘤抵抗力。值得注意的是，本文所描述的肿瘤治疗方案不需要鉴别出肿瘤特异性的抗原。因此，非致病性病毒的应用范围很宽，对多种类型的肿瘤都有疗效。见实施例2-6。
虽然发明者不希望固定于特定的操作模式，但是发明者认为非致病性病毒的抗癌活性应该归功于，至少部分归功于其免疫刺激活性。例如，杆状病毒在体外和体内都可诱导树突细胞的成熟和细胞毒T细胞(CTL)反应。见实施例9-10。另外参见Gronowski等，(1999)J Virol.73：9944-51。
本文所用的术语“病毒”用于描述一种有效的抗肿瘤组合物，包括活病毒、灭活病毒、病毒颗粒、病毒包含体、病毒体、病毒样颗粒、病毒成分及其混合物。
病毒体和病毒样颗粒(VLPs)通常包含非致病性病毒的一种或多种蛋白质，还可以选择添加磷脂。在某些实施方式中，病毒体和VLPs是非复制型的，不含有任何的天然病毒基因组。病毒蛋白可以是通过重组方法制备的，也可以是从完整病毒中分离的。VLPs在下面的文献中还有进一步描述：WO 03/024480，WO 03/024481，Niikura等，(嵌合重组戊型肝炎病毒样颗粒作为提呈外源表位的口服疫苗载体“ChimericRecombinant Hepatitis E Virus-Like Particles as an Oral Vaccine Vehicle PresentingForeign Epitopes”，Virology(2002)293：273-280)；Lenz等，(乳头状瘤病毒样颗粒诱导树突细胞的急性活化“Papilloma rivurs-Like Particles Induce Acute Activation ofDendritic Cells”，Journal of Immunology(2001)5246-5355)；Pinto等，(人乳头状瘤病毒(HPV)-16 L1诱导的细胞免疫应答，用重组HPV-16 L1病毒样颗粒免疫健康志愿者“Cellular Immune Responses to Human Papillomavirus(HPV)-16 L1 HealthyVolunteers Immunized with Recombinant HPV-16 L1 Virus-Like Particles”，Journal ofInfectious Diseases(2003)188：327-338)；以及Gerber等，(人乳头状瘤病毒样颗粒与大肠杆菌热稳定性的外毒素突变体R192G或CpG联合使用时是一种有效的口服免疫原“Human Papillomavirus Virus-Like Particles Are Efficient Oral Immunogens whenCoadministered with Escherichia coli Heat-Labile Entertoxin Mutant R192G or CpG”，Journal of Virology(2001)75(10)：4752-4760)。病毒体在下面的文献中有进一步的描述：Gluck等，(未来开发疫苗的新技术平台“New Technology Platforms in theDevelopment of Vaccines for the Future”，Vaccine(2002)20：B10-B16)。
术语“活病毒”是指感染性与天然病毒相似或一样的病毒。活病毒尤其可以感染其天然的宿主细胞。
术语“灭活病毒”是指在天然宿主细胞内无法复制的病毒，下文有进一步的描述。例如，非致病性的病毒在哺乳动物宿主细胞内不能复制，同样被灭活后在其天然宿主细胞内也无法复制。使用灭活病毒可降低人们对使用活病毒安全性的担心。“灭活剂”是指用于灭活病毒的试剂。
术语“病毒颗粒”是指天然形式经改造或修饰后的病毒，因而在天然宿主细胞内无复制能力。制备病毒颗粒的方法是本领域所熟知的。可通过电镜、免疫原性分析和标准噬菌斑形成试验来评价病毒样颗粒的结构完整性和功能完整性。例如，Hamakubo等，WO 02/06305描述了去核杆状病毒样颗粒的制备方法。
美国专利No.5,750,383描述了利用标记获救系统制备杆状病毒颗粒的方法。该方法利用了遗传修饰的杆状病毒，这种病毒缺乏病毒复制所必需的基因(如gp64)，只能在能弥补其遗传缺陷的细胞内繁殖。
术语‘病毒包含体”是指包含多个包被在病毒编码蛋白晶体内的病毒颗粒的结构。蛋白晶体一旦裂解，多个病毒颗粒就会释放出来，每个病毒颗粒随后都可以感染宿主细胞。
病毒，特别是杆状病毒可用本领域熟知的技术制备。在体外用培养基培养克隆细胞系，接种病毒后在适于病毒复制的条件下孵育足够的时间。培养条件如细胞密度、感染复数、时间、温度、培养基等都不是关键的因素，本领域的技术人员可以很容易地确定选用何种条件。
制备杆状病毒的典型方法见实施例1的描述，该方法利用了草地夜蛾(Sf)细胞。其他有代表性的宿主细胞及扩增方法见美国专利Nos.5,405,770(Heliothis subflexa细胞系)和6,379,958(草地夜蛾细胞系，该细胞系可提高杆状病毒的产量)的描述。
经过孵育以后，产生出的病毒用本领域常规的技术回收，其中包括聚乙二醇(PEG)沉淀、超速离心以及色谱纯化，例如利用离子交换树脂、排阻层析、亲和层析或结合使用。见美国专利申请No.2002/0015945(色谱纯化)；美国专利No.6,194,192(病毒吸附到含硫酸岩藻糖的多糖上)。
术语“病毒成分”用于本文中是指非致病性病毒来源的保留了其亲本活病毒的抗肿瘤和/或抗感染性疾病活性的分子。在某些实施方式中，病毒成分抗肿瘤活性的大小及特异性与其亲本活病毒一样。术语“病毒成分”包括病毒的任何成分，如蛋白、肽、核酸、脂质、糖及其他生物活性分子及其混合物。在某些实施方式中，病毒成分是gp64。
例如，病毒成分可以是病毒外壳蛋白或病毒核蛋白核心的DNA相关蛋白。典型的杆状病毒外壳蛋白见如下文献的描述：Pearson等，(1988)Virology 167：407-13；Summers & Smith(1978)Virology 84：390-402；Thiem & Miller(1989)J Virol 63：2008-18以及Vialard & Richardson(1993)J Virol 67：5859-66。典型的杆状病毒DNA相关蛋白见Tweeten等(1980)J Virol 33：866-876；Wilson等(1987)J Virol 61：661-6以及Rohrmann(1992)J Gen Virol73(Pt 4)：749-61的描述。
病毒成分还可以是存在于病毒包含体内的蛋白和多糖，其中包括成熟包含体的包含体基质以及花萼外层。典型的杆状病毒包含体蛋白包括多角体和花萼。
本文说明非致病性病毒具有很高的抗肿瘤活性和/或抗感染性疾病活性，本领域的技术人员在阅读本说明书后可以很容易地鉴定、纯化或者制备和使用具有亲本活病毒抗肿瘤活性和/或抗感染性疾病活性的病毒成分。例如，美国专利No.6,001,806描述了一种生物化学方法，该方法首先裂解杆状病毒感染的昆虫细胞并分离其中的不同组分，然后利用其中的洗脱组分鉴定可被亲本活病毒识别的具有抗病毒活性的糖蛋白。
另外，利用本领域熟知的重组方法可以很容易地制备病毒蛋白和核酸，并且同样可以检测其抗肿瘤活性和/或抗感染性疾病活性。例如，病毒核酸可被克隆、合成、改变、突变等。用于分离核酸的标准重组DNA和分子克隆技术在下列参考书中有描述：Sambrook等(编)(1989)分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryManual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Silhavy等，(1984)基因融合试验技术(Experiments with Gene Fusions)，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover & Hames(1 995)DNA克隆：操作方法(DNA Cloning：A Practical Approach)，第二版，IRL Press at Oxford UniversityPress，Oxford/New York；以及Ausubel(编)(1995)分子生物学简明手册(ShortProtocols in Molecular Biology)，第三版，Wiley，New York。重组制备的多肽也可以用本领域技术人员所熟知的多种标准方法纯化和鉴定，见Schrder & Lübke(1965)肽(The Peptides)，Academic Press，New York；Schneider & Eberle(1993)肽1992：第22界欧洲多肽论坛论文集(Peptides，1992：Proceedings of the Twenty-SecondEuropean Prptide Symposium)，9月13-19日，1992，Interlaken，Switzerland.Escom，Leiden；Bodanszky(1993)肽合成原理(Principles of Peptide Synthesis)，第二版，Springer-Verlag，Berlin，New York；以及Ausubel(编)(1995)分子生物学简明手册(Short Protocois in Molecular Biology)，第三版，Wiley，New York。
特别是AcNPV完整序列已经清楚(Kool和Vlak，1993)，因此利用已知的方法可以很容易地系统分析所有的AcNPV蛋白，包括重组表达和抗肿瘤活性的检测。
为了更容易地鉴定具有活性的病毒成分，本发明还提供了一种体外分析方法用于筛选候选病毒成分。见实施例8。该分析方法包括用外周血单核细胞(PBMC)诱导细胞毒活性。如本文所描述，非致病性病毒可诱导PBMC对肿瘤细胞的细胞毒活性，这种活性与其在体内所观察到的抗肿瘤活性是相关的。候选病毒成分包括非致病性病毒的生化组分、纯化的或重组的病毒蛋白、纯化的或合成的核酸、病毒体、病毒样颗粒等。
本文所用的术语“非致病性的”用于描述病毒，是指该病毒不能感染其哺乳动物宿主，在某些实施方式中，非致病性病毒不能感染任何哺乳动物宿主。在某些实施方式中，非致病性病毒对人没有感染性。为了便于描述，除非特别说明，术语“非致病性的”病毒包括灭活病毒、病毒颗粒、病毒包含体、病毒体、病毒样颗粒、病毒成分及其混合物。
术语“感染性”通常是指对宿主细胞或生物体有害的特性，例如通过基因的表达和/或通过在宿主内的复制对宿主细胞或生物体造成损伤。与此定义相一致的是，非致病性并不排除可以进入哺乳动物细胞，但是进入以后对宿主细胞或生物体的健康没有影响。然而在某些实施方式中，非感染性的病毒不能进入哺乳动物细胞。
非致病性病毒如杆状病毒在哺乳动物宿主细胞内是转录静止的。因此，在某些实施方式中，非致病性病毒是一类被目前的基因治疗方法排除在外的病毒，因为其携带的外源基因也不表达。
非致病性病毒的例子包括而不限于昆虫特异性病毒、两栖动物特异性病毒以及植物特异性病毒。可用于本文所描述的方法中的典型病毒包括杆状病毒家族的病毒(例如核型多角体病毒(NPV)，其中包括苜蓿银纹夜蛾NPV，以及颗粒体病毒(GV)，其中包括草地夜蛾颗粒体病毒)，多分DNA病毒科的病毒(如姬蜂病毒(ichnoviruses)，其中包括Campoletis sonorensis virus，以及茧蜂病毒(bracoviruses)，其中包括CotesiaMelanoscela virus)，囊泡病毒，四病毒科和罗达病毒科(如野田村病毒，其中包括日本库蚊病毒和禽兽棚病毒(Flock House Virus))。可用于本发明的许多非致病性病毒在昆虫中都可以找到。见Fields等编，(1996)，Virology，Lippincott-Rave Publishers，Philadelphia，Pennsylvania。
术语“感染性疾病”是指对其宿主有害的因子(如病毒、真菌或细菌)。在某些实施方式中是指对人有害的因子。“抗感染性疾病”的措施是指可预防、改善或根除感染性疾病和/或其致病因子的治疗措施。
感染性疾病的例子包括而不限于HIV、西尼罗河病毒、甲型、乙型、丙型肝炎、天花、结核、水泡性口炎病毒(VSV)、呼吸道合胞体病毒(RSV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、SARS、流感、埃博拉病毒、病毒性脑膜炎、疱疹、炭疽、莱姆病以及大肠杆菌等。
在某些实施方式中，非致病性病毒是杆状病毒。如下面实施例所描述的，本发明证明杆状病毒是一种高活性的肿瘤生长抑制因子，可促进肿瘤的完全缓解。本发明还证明杆状病毒可用于抑制肿瘤的转移，提高动物对再次接种肿瘤的抵抗力，如实施例5-6的描述。
如本文所述，术语“肿瘤再次接种”是指癌或肿瘤已被治疗或切除的动物再次接种新的肿瘤。与本文上面所提供的定义相一致的是，术语“杆状病毒”包括杆状病毒颗粒和杆状病毒成分。
杆状病毒的宿主特异性已得到彻底研究。虽然已知杆状病毒可感染30多种鳞翅类昆虫，但是它不能感染已经研究过的其他昆虫细胞和超过35种哺乳动物细胞系。见Tjia等，(1983)Virology 125：107-17；Volkman & Goldsmith(1983)Appl EnvironMicrobiol 45：1085-1093；以及Mdntosh & Shamy(1980)Intervirology 13：331-41。但是，杆状病毒确实可以进入哺乳动物细胞，在宿主细胞核内也可以检测到病毒DNA。见Groner等，(1984)Intervirology 21：203-9；Tjia等，(1983)Virology 125：107-17；以及Volkman & Goldsmith(1983)Appl Environ Microbiol 45：1085-93。
术语“非致病性的”病毒还可以指天然形式是具有致病性的但是经修饰后是非致病性的病毒。这种修饰包括基因修饰(如打断病毒复制所必需的基因，如本文所描述的杆状病毒基因gp64；和/或打断病毒启动子使其在宿主内无转录活性)。例如，杆状病毒物种特异性的致病性部分是由于杆状病毒启动子在鳞翅类昆虫以外的物种内保持静默。当异源启动子插入到杆状病毒基因组时，被修饰的病毒就可以在非鳞翅类昆虫细胞系内启动基因的表达，其中包括各种哺乳动物细胞系。见Boyce &Bucher(1996)Proc Natl Acad Sci USA 93：2348-52；Carbonell等，(1985)J Virol 56：153-60；Carbonell & Miller(1987)Appl Environ Microbiol 53：1412-7；以及Hofmann等，(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92：10099-103。在哺乳动物细胞内原本有活性的病毒启动子同样也可以被修饰成无活性的启动子，这样病毒在哺乳动物细胞内就是非致病性的。制备碱基对改变、缺失或小片段插入的位点特异性突变方法也是本领域所熟知的，例如本文上面所提到的参考文献所描述的方法。
确定经修饰的病毒和未经修饰的病毒是否是非致病性的可以通过本领域所熟知的确定病毒感染性和复制能力的方法很容易地加以分析。典型的方法见Tjia等，(1983)Virology 125：107-17；Volkman & Goldsmith(1983)Appl Environ Microbiol 45：1085-93；Mdntosh & Shamy(1980)Intervirology 13：33 1-41；以及美国专利No.6,248,514等的描述。
本发明还提供了具有抗癌活性和/或抗感染性疾病活性和/或佐剂活性的非致病性病毒，其中包括活病毒、灭活病毒、病毒颗粒、病毒体、VLPs、病毒包含体以及病毒成分。本发明还提供了筛选可用于本文所描述的治疗方法中的非致病性病毒的方法。
为了筛选具有抗癌活性的非致病性病毒，候选非致病性病毒用实施例8所描述的体外或体内肿瘤细胞溶解试验和/或实施例所描述的体内抗癌活性试验模型来检测。在某些实施方式中，先用体外试验进行初步筛选，然后在相关的动物模型内评价那些具有体外活性的病毒在体内是否也具有抗癌活性。
为了筛选具有佐剂活性的非致病性病毒，需要检测候选非致病性病毒增强抗原免疫原性的能力。免疫原性可通过检测T细胞介导的反应来确定。检测T细胞反应的经典方法包括体外细胞毒性试验或体内延迟型超敏试验。在某些实施方式中，CCL21联合非致病性病毒可在体外诱导PBMC对肿瘤细胞的细胞毒活性，这种活性与其在体内的抗肿瘤活性相关。另外也可以用其他抗原来代替CCL21。另外还可以通过检测受试者血清中抗原特异性的抗体和/或证明抗原特异性的抗血清或免疫细胞具有保护作用来分析免疫原性。在某些实施方式中，非致病性病毒可使抗原的免疫原性至少提高约2倍、约5倍、约10倍、约25倍或约100倍。
在某些实施方式中，非致病性的病毒是被灭活的，如下文将要进一步描述的。具有抗癌活性的非致病性病毒可用各种灭活方法使其不再具有感染天然宿主细胞的能力。利用本文所描述的试验，本领域的技术人员可选择能保持病毒抗癌活性的灭活方法。在某些实施方式中，灭活方法可以保持病毒进入细胞的能力但是病毒基因组却失去了转录和/或复制能力。在某些实施方式中，对病毒进行基因修饰使其能进入细胞但是不能进行正常的转录和/或复制。
A2.非致病性病毒的抗感染性疾病活性
目前所用的治疗感染性疾病的方法包括使用一些能引起副作用的药物。另外，许多有效的治疗措施包括疫苗只对单一的感染因子或其密切相关的因子具有特异性。本发明的发明者惊奇地发现非致病性病毒也具有很高的抗感染性疾病的能力。见实施例17。
为了筛选具有抗感染性疾病活性的非致病性病毒，利用本领域技术人员所熟知的体外或体内抗感染性疾病检测方法来检测候选非致病性病毒。例如，对于结核来说，可用TB模型或体外巨噬细胞模型来检测病毒的抗感染性疾病活性。Abe等，(Joumalof Immunology，2003，171：1133-1139)描述了适于检测化合物抗感染性疾病活性的其他方法。
在某些实施方式中，先用体外试验进行初步筛选，然后在相关的动物模型内评价那些具有体外活性的病毒在体内是否也具有抗感染性疾病活性。
因此，本发明还提供了通过给予患者非致病性病毒对需要进行抗感染性疾病治疗的患者进行治疗的方法。值得注意的是，本文所描述的具有抗感染性疾病活性的非致病性病毒并不依赖于感染因子特异性抗原的鉴定。而且非致病性病毒具有很宽的使用范围。
虽然发明者不希望固定于特定的操作模式，但是发明者认为非致病性病毒的抗感染性疾病活性应该归功于，至少部分归功于其免疫刺激活性。例如，杆状病毒在体外和体内都可诱导树突细胞的成熟和细胞毒T细胞(CTL)反应。见实施例9-10。
B.治疗方面的应用
本发明提供了通过给予受试者非致病性病毒以治疗荷瘤哺乳动物受试者的方法。本文所描述的方法可用于抑制癌的生长，包括癌的完全缓解，抑制癌的转移以及提高受试者对癌的抵抗力。
本发明提供了通过给予受试者非致病性病毒以治疗患有一种或多种感染性疾病的动物的方法。本文所描述的方法可用于抑制病毒的复制、抑制真菌的生长。
术语“癌的生长”通常是指预示癌向更高阶段发展的多个指数中的任意一个指数。因此，用于评价癌生长抑制效应的指数包括而不限于存活癌细胞数量的减少、癌体积的缩小或形态的改变(如通过CT、超声或其他影像方法确定)、肿瘤生长的延迟、肿瘤血管的破坏、迟发型超敏皮肤试验结果的改善、细胞毒T细胞活性的升高以及肿瘤特异性抗原表达水平的下降。
术语“肿瘤生长的延迟”是指肿瘤生长到特定大小所需要的时间减少。例如，治疗可以延迟肿瘤体积增加到测量开始时(第0天)体积的3倍所需要的时间或者肿瘤生长到1cm3所需要的时间。
术语“对癌的抵抗力”是指受试者对癌生长抵抗能力的提高，特别是已有癌的生长。另外，术语“对癌的抵抗力”也指受试者体内癌生长易感性的降低。对癌的抵抗力与获得性免疫应答的诱导有关，如下文所描述。
本文所用的术语“受试者”包括任何哺乳动物种。在某些实施方式中，本发明的方法优选用于治疗哺乳动物的癌和/或感染性疾病，如人以及那些濒临灭绝的对人类具有经济价值和/或社会价值的哺乳动物。
术语“癌”通常是指肿瘤，包括原发肿瘤和转移瘤。在某些实施方式中，肿瘤是实体瘤。术语“肿瘤”包括实体瘤和任何组织的癌，其中包括而不限于乳腺癌；结肠癌；直肠癌；肺癌；鼻咽癌；喉癌；食管癌；胃癌；胰腺癌；肝癌；胆囊癌；胆管癌；小肠癌；泌尿道肿瘤包括肾癌、膀胱癌和尿路上皮癌；女性生殖道肿瘤包括宫颈癌、子宫癌、卵巢癌(如绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病)；男性生殖道肿瘤包括前列腺癌、精囊癌、睾丸和生殖细胞肿瘤；内分泌腺肿瘤包括甲状腺癌、肾上腺癌和脑下垂体癌；皮肤癌(如血管瘤和黑色素瘤)；骨癌或软组织癌；血管癌(如卡波西肉瘤)；脑肿瘤、神经肿瘤、眼肿瘤和脑脊膜肿瘤(如星形细胞瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤、神经鞘瘤和脑膜瘤)。
术语“肿瘤”还包括造血系统恶性肿瘤来源的实体瘤，如白血病，其中包括绿色瘤、浆细胞瘤、血小板瘤和蕈样肉芽肿病和皮肤T细胞淋巴瘤/白血病、多发性骨髓瘤以及淋巴瘤，其中包括何杰金氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤。
本文所用的术语“癌”还包括非肿瘤性的增生性疾病。因此，本发明的方法还可用于治疗或预防增生、化生，或者更特殊的发育异常(对这些异常增生性疾病的综述见Robbins & Angell(1976)基础病理学(Basic Pathology)，第二版，68-79页，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，Pennsylvania)。
增生是一种受控形式的细胞增殖，其中包括组织或器官内细胞数量的增加，但是其结构或功能没有改变。作为一个非限定性的例子，子宫内膜增生通常先发于子宫内膜癌。化生是另一种受控形式的细胞生长，其中一种类型的成年细胞或完全分化的细胞被另一种类型的成年细胞所替代。化生发生于上皮或结缔组织。不典型的化生包含某些无序的化生上皮。发育异常通常是癌的前兆，主要见于上皮；它是一种最常见的无序形式的非肿瘤性细胞生长，包括细胞一致性的丧失以及细胞结构定位的丧失。发育异常的细胞通常具有异常巨大而深染的细胞核，呈现多形性。发育异常通常见于慢性刺激或慢性炎症时，常见于宫颈、呼吸道、口腔和胆囊。虽然癌前病变可以发展成恶性肿瘤，但是它可以稳定相当长一段时间，甚至在刺激因素消失后或损伤受到宿主免疫系统攻击后可以复原。
因此，如本文所述给予受试者非致病性病毒可以激发固有的抗癌免疫应答或癌特异性的适应性免疫应答。术语“免疫系统”包括所有的细胞、组织、系统、结构和过程，其中包括非特异性的部分和特异性的部分，可以提供一种防卫机制来抵抗含抗原性分子的细胞，抗原性分子包括而不限于肿瘤、致病原以及自身反应细胞。因此免疫应答包括固有的免疫应答、获得性免疫应答或者二者的结合。
术语“固有的免疫系统”包括吞噬细胞如中性粒细胞、单核细胞、组织巨噬细胞、库弗细胞、肺泡巨噬细胞、树突细胞和小胶质细胞。固有的免疫系统可介导非特异性的免疫应答。固有的免疫系统在起始和指导适应性免疫系统的反应中扮演重要角色。见Janeway(1989)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 54：1-13；Romagnani(1992)Immunol Today 13：379-381；Fearon & Locksley(1996)Science 272：50-53；以及Fearon(1997)Nature 388：323-324。固有的反应包括树突细胞的成熟、巨噬细胞的活化、细胞因子或趋化因子的分泌和/或NFκB信号通路的活化。
术语“适应性免疫系统”是指对宿主体内的特异性免疫具有影响的细胞和组织。这些细胞包括自然杀伤细胞(NK)和淋巴细胞(如B淋巴细胞和T淋巴细胞)。术语“适应性免疫系统”还包括抗体产生细胞及其产生的抗体。
术语“适应性免疫应答”是指对抗原的特异性反应，包括体液免疫应答(如抗原特异性抗体的产生)和细胞介导的免疫应答(如淋巴细胞的增殖)，如下文所定义的。适应性免疫应答还包括系统免疫和体液免疫。
术语“细胞介导的免疫”和“细胞介导的免疫应答”是指淋巴细胞提供的免疫防卫机制，如T淋巴细胞接近其靶细胞时所产生的防卫反应。细胞介导的免疫应答还包括淋巴细胞的增殖。测定“淋巴细胞的增殖”就是测定淋巴细胞接触特异性抗原后的增殖能力。淋巴细胞增殖是指B细胞、T辅助细胞或CTL的增殖。
本文所用的术语“CTL反应”是指抗原特异性细胞溶解和杀伤表达特异性抗原的细胞的能力。如本文所描述，本领域熟知的标准CTL分析方法可用于测定CTL的活性。
术语“系统免疫应答”用于本文中是指淋巴结、脾或肠道相关淋巴组织内的免疫应答，其中免疫系统的细胞，如B细胞被活化。例如，系统免疫应答包括血清免疫球蛋白(IgGs)的产生。另外，系统免疫应答是指血流中循环的抗原特异性的抗体以及系统免疫器官如脾和淋巴结中的抗原特异性的细胞。
术语“体液免疫”或“体液免疫应答”是指获得性免疫，其中经抗原刺激后可分泌抗体分子。
本文所用的术语“癌特异性的”是用于描述适应性免疫应答，是指受试者内细胞介导的免疫应答或体液免疫应答，其中发生的反应是受试者内已有的癌特异性的。如果固有免疫应答和适应性免疫应答所包含的免疫细胞类型是唯一的，那么就不要期望激发固有免疫应答的方法也能激发适应性免疫应答。但是在某些实施方式中，给予非致病性病毒既可以激发固有免疫应答，又可以激发适应性免疫应答。
在某些实施方式中，本文所描述的利用非致病性病毒进行治疗的方法可以和其他一种或多种肿瘤治疗方法一起使用。例如，在给予非致病性病毒之前或之后可以将肿瘤或异常增生的细胞手术切除。同样，本发明的非致病性病毒也可以和其他的药剂一同给药或制成一种制剂，例如抗血管生成因子、化疗药和/或其他的免疫刺激因子。可与非致病性病毒联合使用的典型药剂包括而不限于甲氨蝶呤、他莫昔芬、nelandron、尼鲁米特、阿霉素、5氟尿嘧啶(5FU)、细胞因子如干扰素α(IFN-α)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素2(IL2)、白细胞介素4(IL4)、白细胞介素6(IL6)、以及肿瘤坏死因子(TNF)。感染性疾病还可以通过给予抗病毒药物、抗生素或抗真菌药物治疗。
本发明还涉及用于在哺乳动物受试者包括人体内诱导细胞毒T细胞介导的免疫应答的方法和组合物。在某些实施方式中，本发明涉及利用非致病性病毒诱导细胞毒T细胞介导的免疫应答。因此，本发明提供了制备含有非致病性病毒和抗原的抗原性制剂的方法。术语“抗原”是指能通过与T细胞或B细胞受试者相互作用而活化淋巴细胞(正性或负性)的物质。正性活化可导致免疫应答，负性活化导致免疫耐受。抗原可以是蛋白质、脂质、核酸或其混合物。抗原可以是异源抗原(如在宿主体内一般情况下不存在的抗原)或自身抗原(自体抗原)。
本发明还提供了使用本文所描述的抗原制剂作为治疗性和/或预防性药物的方法。例如，这种抗原制剂可给予哺乳动物受试者以治疗疾病，其中对于HIV感染或流感来说CTL反应是很重要；另外，这种抗原制剂还可用于治疗或预防细菌感染、寄生虫感染等。
在某些实施方式中，本发明提供了在需要治疗的个体体内抑制肿瘤的一种或多种症状的方法。该方法包括给予个体一定量的包含非致病性病毒的组合物以有效地抑制癌症的一种或多种症状。
癌症症状是本领域技术人员所熟知的，包括生理指标和物理指标。生理指标包括而不限于肿瘤的生长、异常的细胞增生、肿瘤的转移、血管生成、细胞死亡或细胞浸润。物理指标包括而不限于体重下降、出血、呼吸困难、骨折、免疫力下降或疲乏。
如本文所描述，给予受试者非致病性病毒还可以激发抗感染性疾病免疫应答。如上所述，所激发的免疫应答包括固有免疫应答、适应性免疫应答或者二者都存在。
本发明还提供了保护动物不受感染性疾病影响的方法，该方法包括给予动物有效量的包含非致病性病毒的组合物。在某些实施方式中，非致病性病毒是用任何方法或本文所描述的方法灭活的。根据下面所描述的实施例可以看到给予无活性的非致病性病毒可产生抗感染性因子(如病毒、真菌或细菌)的保护作用。非致病性病毒还可以和其他疫苗、抗病毒药物、抗真菌药物、抗细菌药物或其混合物一起使用。
C.治疗性组合物和方法
本发明还提供了药物组合物及其使用方法。本发明的非致病性病毒可制备成安全有效的具有本文所描述的抗肿瘤和/或抗感染性疾病和/或佐剂活性的制剂。
本发明还提供了用于治疗或预防感染性疾病和/或癌的组合物。在某些实施方式中，组合物包含非致病性病毒和外周血单核细胞(PBMC)。在某些实施方式中，PBMC是从动物或人体内分离出来的，在体外与非致病性病毒接触，然后再以混合物或组合物的形式输入到动物或人体内。在某些实施方式中，PBMC是从被治疗动物或人体外的其他动物或人体内分离的，或者本发明的组合物被输入到被治疗动物或人体内。
在某些实施方式中，组合物包含非致病性病毒以及至少一种肿瘤细胞。肿瘤细胞可以是被治疗个体或动物自身的，也可以是同种异体的。
在某些实施方式中，组合物包含非致病性病毒、至少一种肿瘤细胞以及至少一种PBMC。在某些实施方式中，非致病性病毒是无活性的病毒。
C.1.病毒灭活
在某些实施方式中，本发明的方法所用的非致病性活病毒可在给予受试者前被灭活。如上面所定义的，非致病性病毒在哺乳动物宿主内不能复制。灭活可使病毒在其天然宿主细胞内失去复制能力，从而增加了其安全性。
病毒灭活可用任何适宜的方法完成，其中包括而不限于破坏病毒包被的脂质或蛋白组分、对病毒进行改造以使其无法识别靶细胞、破坏病毒的核酸和/或改造病毒使其失去复制能力。典型的病毒灭活方法包括而不限于巴氏消毒法、用去污剂(如Triton-X100)处理、用二乙烯亚胺(BEI)进行烷基化、光化学灭活、紫外线灭活、辐射灭活、物理裂解(如超声、电子束)；基因灭活以及上述方法的联合。见Rueda等，(2000)Vaccine 19：726-34和Henzler & Kaiser(1998)Nat Biotechnol 16：1077-9。在某些实施方式中，灭活并不能显著降低病毒的抗原性和/或活性。病毒灭活以后可用标准的方法来确定其感染性。
“基因灭活”用于本文中是指对病毒的核酸(如基因)进行改造。这种改造包括删除一个或多个基因、突变至少一个基因；创造温度敏感突变株、灭活基因等。温度敏感突变株是指该突变株在某个温度下是允许的，而在另一个温度下是受限的(如抑制病毒的复制)。对于杆状病毒来说，制备温度敏感突变株可用于使病毒在室温(约25℃)下繁殖和制备，而进入到具有更高内部温度的动物体内时病毒就变成了无活性的。在某些实施方式中，温度敏感突变株在约16-28℃、约20-28℃、约25-28℃或27℃的范围内是允许的，而在约30-45℃、约32-40℃、约35-38℃、约37℃温度下是受限的。在某些实施方式中，受限温度是约28℃、约29℃、约30℃、约31 ℃、约32℃，、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃或约37℃以上的任何温度。在某些实施方式中，温度敏感突变株在动物或人体内是无活性的。在某些实施方式中，当病毒处于受限温度时温度敏感突变株与野生型病毒相比其活性降低约100％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
稳定敏感突变株可包含任何突变的基因，该基因的突变可使病毒在一种温度下的活性比另一种温度下的活性降低。可被突变的基因或蛋白包括而不限于鸟苷酰基转移酶、RNA三磷酸酶、ATP酶、蛋白激酶(如PK-1)等。下面的文献中描述了一些温度敏感突变株的例子：Jin等，Journal of Virology，(1998)，卷72，pp.10011-10019和McLachlin等，Virology，(1998)，卷246，pp.379-391，本文都已纳入作为参考。
如果病毒经加热处理后足以被灭活则巴氏消毒法是一种简单的灭活方法。在某些实施方式中，在保证可灭活病毒的情况下加热的持续时间应该尽量短以使对病毒蛋白的损伤降到最低。另外，可通过使用稳定剂和柠檬酸钠、蔗糖和/或甘氨酸使对病毒的损伤降到最低。
另外，化学灭活，如用温和的胃蛋白酶在低pH条件下处理或者用去污剂处理，可用于破坏脂双层，因此可用于灭活包膜病毒，其中包括杆状病毒。见美国专利Nos.4,820,805和4,764,369。氮丙啶二元乙烯亚胺是一种强力烷化剂，可通过与核酸而不是蛋白上的亲核基团相互作用而灭活病毒。
在本发明的某些实施方式中，病毒灭活可通过光化学反应进行。按照这种方法，将辐射致敏的化合物加到非致病性病毒的脂质悬液中，然后将混合物在紫外灯下照射或者用离子化射线(γ射线或X射线)照射。
补骨脂素及其衍生物以及具有与补骨脂素类似的线性三环结构的化合物可诱发光敏作用。补骨脂素是一种双功能的光反应分子，在长波紫外线的照射下可与核酸形成共价键。补骨脂素可嵌入到DNA双螺旋内，然后通过光反应使DNA分子的两条链发生交联。见Hwang等，(1996)Biochem Biophys Res Commun 219：191-7。交联使DNA分子无法复制或被转录。商品化的补骨脂素化合物有8-甲氧补骨脂素(甲氧沙林)和4，5′，8三甲基补骨脂素(trioxalen)。使用补骨脂素进行光化学灭活最有效的波长在320nm到380nm之间，最大有效波长在33nm到360nm之间。见Pathak，M(1974)，阳光与人类(Sunlight and Man)，Pathak，M & Fitzpatrick，T编，Universityof Tokyo Press，Tokyo。
其他光致敏试剂包括卤代补骨脂素、异补骨脂内脂、呋喃并色酮和香豆素，这些化合物都含有一个卤素取代基和一个水溶性基团，如第四氨离子或磷离子。据信在补骨脂素分子上加入卤原子取代基，特别是溴原子取代基可以提高致敏剂与DNA的结合常数，因为溴原子可提供疏水特性。在某些实施方式中，可以使用溴化光致敏剂，因为只需要一个光子就可以活化溴化致敏剂，而用非溴化的补骨脂素需要两个光子才能使DNA交联。见美国专利No.5,418,130。
光化学灭活的典型方法见实施例11的描述，该方法联合使用trioxalen和长波紫外线照射。见Weightman & Banks(1999)J Virol Methods 81：179-82和Cotton等，(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：6094-8。
为了保持病毒的抗原性，用补骨脂素灭活活病毒时应在非氧化的环境下进行。通过去除灭活培养基中的氧和其他氧化物，由于紫外线照射而引起的抗原降解可得到最大限度的避免。见美国专利No.5,106,619。同样，通过使用抗氧化剂/淬灭剂可使短波紫外线照射时产生的自由基和其他活性氧成分降到最少，从而可以使蛋白的损伤大大减少。见Marx等，(1996)Photochem Photobiol 63：541-6。
在本发明的某些实施方式中，病毒灭活可以通过改造病毒的基因来完成，从而使病毒受到损伤或无法复制。例如，对病毒进行基因改造使病毒的必需基因发生一个或多个温度敏感型的突变。在允许温度(如25℃)下用Sf9或Tn5细胞制备和扩增病毒。当病毒在治疗时被导入到哺乳动物受试者内时，温度不再是允许温度了，这样温度敏感基因就很难表达，或者表达的基因产物没有功能，因此病毒是残缺的。
可被制备的典型温度敏感突变可在病毒感染所必需的基因上进行。例如，编码PKIP的基因发生温度敏感型的突变，这个蛋白可与病毒编码的蛋白激酶相互作用，调节病毒晚期基因的转录。在非允许温度下，携带这种突变的病毒在感染宿主时是有缺陷的。见McLachlin等(1998)Virology 246：379和Partington等，(1990)Virology175：91。
病毒是否被灭活可通过证明其在天然宿主细胞内的复制能力是否丧失来确定。可利用标准的噬菌斑试验来证明一个样品的感染性。在没有合适的方法来证明某种病毒是否具有感染性时，就需要通过灭活一个具有相似的生物物理特性和结构特性的模型病毒来证明其是否被灭活。见Henzler & Kaiser(1998)Nat Biotechnol 16：1077-9。为了使病毒完全灭活，本发明所用的灭活方法可以包括使病毒与灭活刺激物连续接触。
C.2.载体
如本文所描述，非致病性病毒可以是活病毒、灭活病毒、病毒颗粒、病毒包含体、病毒成分或其混合物。为了促进非致病性病毒向受试者癌细胞内的转移，可以给予一种能在受试者体内激发抗癌和/或抗感染性疾病反应的组合物，该组合物包含：(a)有效量的非致病性病毒；以及(b)药学上可接受的载体。在适当的条件下可同时使用两个或两个以上的载体。
本文所用的术语“载体”是指可用于将病毒、病毒样颗粒、病毒成分、病毒蛋白转运到细胞的浆膜或穿过细胞的浆膜的化合物或一组化合物。
用于转运非致病性病毒或病毒成分的典型载体包括脂质体、纳米微球(Manome等，1994；Saltzman和Fung，1997)、氨基葡糖多聚糖(见美国专利No.6,106,866)、脂肪酸(见美国专利No.5,994,392)、脂肪乳剂(见美国专利No.5,651,991)、脂质和脂质衍生物(见美国专利No.5,786,387)、胶原(见美国专利No.5,922,356)、多糖及其衍生(见美国专利No.5,688,931)、纳米悬液(见美国专利No.5,858,410)、聚合微胶粒或聚合物(见美国专利Nos.4,551,482、5,714,166、5,510,103、5,490,840和5,855,900)以及多核糖体(见美国专利No.5,922,545)。
为了转录病毒成分，载体还可以用基因治疗载体，其中包括病毒载体和质粒载体。适于基因表达的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒(AAVs)、逆转录病毒、假型逆转录病毒、疱疹病毒、痘苗病毒和Semiliki森林病毒。载体还可以包含病毒样颗粒、蛋白运送载体，其中包括Pro-Ject(Pierce Biotechnology，INC.)和Profect(TargetingSystems)以及Chariot(Active Motif)等。
可以选择载体使非致病性病毒在需要治疗部位达到稳定的生物利用度。术语“稳定的生物利用度”涉及的因素包括而不限于非致病性病毒从载体内的延迟释放、非致病性病毒的代谢稳定性、包含非致病性病毒的组合物的系统转运以及非致病性病毒的有效剂量。
能达到稳定的生物利用度的典型组合物包括而不限于基质聚合物，其中包括膨胀的可生物降解的基质聚合物(美国专利Nos.6,335,035；6,312,713；6,296,842；6,287,587；6,267,981；6,262,127和6,221,958)，聚合物包被的微粒子(美国专利Nos.6,120,787和6,090,925)，多元醇：油悬液(美国专利No.6,245,740)，多孔颗粒(美国专利No.6,238,705)，乳胶/蜡包被颗粒(美国专利No.6,238,704)，壳聚糖微胶囊，以及微球乳剂(美国专利No.6,190,700)。
C.3.剂型、剂量和给药途径
本发明组合物的适宜给药剂型包括水性的和非水性的无菌注射液，其中包含抗氧化剂、缓冲物质、抑菌剂、抗生素和抗真菌药(如parabens，氯代丁醇，酚，抗坏血酸，硫柳汞)、将制剂的渗透压调整到与受试者体液一致的溶质(如糖，盐和多元醇)，悬浮剂和增厚剂。制剂可置于单次剂量的包装内，也可置于多次剂量的包装内，如密封的安瓿和小玻璃瓶，可以储存在冷冻条件下活冻干条件下，在使用前只需加入无菌液体载体就可以注射了。
注射到宿主体内的组合物包括无菌水溶液或分散液以及可制备成无菌注射液或分散液的无菌粉末。可注射的组合物应当是液体的，其流动性应当达到可以很容易地用注射器注射的程度。适宜的溶剂包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其混合物。可以使用包被如卵磷脂和/或通过降低颗粒的直径来维持组合物的流动性。
本发明的非致病性病毒可通过瘤内注射、瘤旁注射、系统注射、胃肠外途径(如静脉注射、肌肉注射、动脉内注射和输液)、口服、透真皮注射(局部给药)、鼻内途径(吸入)以及粘膜内注射的方式给药。选择何种给药方式要根据载体的类型、组合物的疗效、需治疗的部位以及患者的状况而定。
本文所用的术语“蛋白运送载体”是指可促使蛋白质转运到细胞膜或跨过细胞膜的物质。
在某些实施方式中，非致病性病毒是被直接注射到肿瘤内或肿瘤旁部位。术语“肿瘤旁部位”是指离肿瘤外缘约15cm以内的部位、约10cm以内的部位、约5cm以内的部位、约1cm以内的部位或者约0.1cm以内的部位。本发明的非致病性病毒可以注射到一个或多个肿瘤或肿瘤旁部位内。在某些实施方式中，本发明的非致病性病毒可以注射到肿瘤和/或肿瘤周围的多个位点内。
在某些实施方式中，如果癌的生长是非肿瘤性的，那么非致病性病毒可以注射到病变部位或病变周围部位。术语“病变周围部位”是指非肿瘤性增生外缘约15cm以内的部位、约10cm以内的部位、约5cm以内的部位、约1cm以内的部位或者约0.1cm以内的部位。本发明的非致病性病毒可以注射到一个或多个病变和/或病变旁部位内。在某些实施方式中，本发明的非致病性病毒可以注射到非肿瘤性增生部位和/或非肿瘤性增生部位周围的多个位点内。
在组合物是用于治疗感染性疾病的实施方式中，非致病性病毒可通过系统途径给药。在某些实施方式中，非致病性病毒被局部注射到损伤部位内。
本发明涉及给予患者有效量的非致病性病毒。术语“有效量”用于本文中是指足以激发出抗癌活性，包括抗肿瘤活性和/或抗非肿瘤性增生活性的非致病性病毒的量。如本文所描述，典型的抗癌活性包括而不限于癌细胞的溶解、癌生长的抑制、癌转移的抑制和/或对癌的抵抗力。在某些实施方式中，“有效量”是指体外试验中可有效抑制癌的生长、转移、诱导对癌的抵抗力、诱导细胞溶解、细胞死亡等所需要的一种药物的量。在某些实施方式中，“有效量”的药物抑制癌的生长、转移、诱导对癌的抵抗力、诱导细胞溶解、细胞死亡至少提高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70、80％、90％、2倍、5倍、10倍或100倍。
本文中的术语“有效量”是用于描述足以激发抗感染性疾病活性的非致病性病毒的量。在某些实施方式中，与对照相比，“有效量”的非致病性病毒可以使病毒的复制至少被抑制10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、10倍或100倍。
本发明的治疗性组合物中实际包含的活性成分的量可以是不同的，只要该剂量的组合物在特定的患者体内可以达到预期的治疗效果。为了激发出预期的活性，可以选择不同的给药方案。可以进行单次注射，也可以进行多次注射。剂量和给药方案的选择要根据不同的因素来确定，其中包括治疗性组合物的活性、剂型、给药途径、与其他药物或治疗措施的联合、被治疗的疾病类型以及被治疗患者的健康状况及用药史。确定和调整有效给药剂量以及确定何时和如何调整都是医学领域技术人员所熟知的。
可用各种方法来计算非致病性病毒的给药剂量。对非致病性活病毒来说，可用噬菌斑形成单位来计算剂量。对于无活性的非致病性病毒来说，由于不能形成噬菌斑，其剂量用PFU的等价量来表示。本文所用的术语“PFU等价量”是指非致病性病毒的量。PFU等价量定义为1 PFU的病毒被灭活后所得到的病毒的量。
[00155]另一种确定病毒给药量的方法是基于样品中存在的病毒颗粒数目。可用任何方法对颗粒进行计数，如电镜。也可以通过体外试验所得到的有效量来推算出非致病性病毒，包括灭活病毒的给药量。体外试验可以是本领域技术人员所熟知的测定抗癌活性或抗感染性疾病活性的任何试验，其中包括而不限于测定细胞毒性、细胞死亡、细胞在软琼脂上的生长能力等的试验。在某些实施方式中，剂量是指可使细胞毒活性或细胞死亡比对照组增加至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的量。在某些实施方式中，剂量是指可使细胞在软琼脂上的生长能力比对照组至少降低20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的量。
其他有关剂型、剂量和给药方案的指导原则描述于Berkow等，(1997) Merck医学情报手册(The Merck Manual of Medical Information)，Home编，Merck ResearchLaboratories，Whitehouse Station，New Jersey；Goodman等，(1996)Goodman & Gilman治疗学的药理基础(Goodman & Gilman’s the Pharmacological Basis of Therapeutics)第9版，McGraw-Hill Health Professions Division，New York；Ebadi(1998)CRC临床药理学手册(CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology)，CRC Press，Boca Raton，Florida；Katzung(2001)基础和临床药理学(Basic & Clinical Pharmacology)，第8版，Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub.Division，New York；Remington等，(1975)Remington药物学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第15版，Mack Pub.Co.，Easton，Pennsylvania；Speight等，(1997)Avery药物治疗：疾病管理中药物特性、选择、治疗用途和经济价值指导手册(Avery’s Drug Treatment：A Guide to thePropertie，Choice，Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in DiseaseManagement)，第4版，Adis International，Auckland/Philadelphia，Pennsylvania。
在某些实施方式中，通过体外或体内试验来检测组合物以确定其“有效量”。例如，在本文所描述的诱导细胞死亡的方法中，适用的试验包括而不限于细胞体外存活能力分析试验，其中包括TUNEL分析或其他荧光分析方法如Cell-Titer Blue(Promega Corp)；监测DNA片段化的试验；以及细胞色素C释放试验、软琼脂生长试验、接触抑制试验和及肿瘤在裸鼠体内的生长试验；给动物注射本发明的组合物后接种肿瘤并监测肿瘤缓解情况的试验和转基因小鼠试验，其中转基因小鼠被接种了肿瘤并监测其缓解情况；本文所描述的体内试验；测定细胞穿过屏障的体外试验如Matrigel试验(见Cancer Res.2003 Aug 1；63(15)：4632-40；Am J Chin Med.2003；31(2)：235-46)；Yang等，(Cancer Res.61，5284-5288，July 1，2001)所描述的体外侵袭性和体内转移性分析试验。
本发明包含非致病性病毒的组合物还可以包含一种或多种用于增强药物组合物疗效的佐剂。这些佐剂包括而不限于：(1)铝盐(明矾)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油乳剂(其中含有或不含有其他特异性的免疫刺激因子如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁成分)，如(a)MF59(国际公开号No.WO 90/14837)，其中含有5％角鲨烯、0.5％Tween 80和0.5％Span 85(虽然不是必须的，但是还可以添加不同剂量的MTP-PE(见下文))，用微射流匀质仪如Model 110Y微射流匀质仪(Microfluidics，Newton，Mass.)制备成亚微粒，(b)SAF，其中含有10％角鲨烯、0.4％Tween 80、5％Pluronic封闭的聚合物L121和thr-MDP(见下文)，或者经过微射流匀质化制备成亚微粒，或者激烈搅拌成大颗粒乳剂，以及(c)RibiTM.佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem，Hamilton，Mont.)，其中含有2％角鲨烯、0.2％Tween 80和一种或多种选自以下细胞壁成分：monophosphorylipid A(MPL)、双分枝菌酸海藻糖(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)(在1999年6月24日公开的国际申请WO 99/30739中有关于适宜亚微粒水包油乳剂的进一步描述)；(3)皂甙佐剂，如StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，Mass.)或从它衍生的颗粒如ISCOMs(免疫刺激复合物)；(4)完全福氏佐剂(CFA)和不完全福氏佐剂(IFA)；(5)细胞因子如白细胞介素(IL-1、IL-2等)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(6)细菌ADP核糖酰化毒素的脱毒突变株，如霍乱毒素(CT)、百日咳毒素(PT)或大肠杆菌的热稳定毒素(LT)，特别是LT-K63(其中野生型蛋白上的63位氨基酸被赖氨酸替代)、LT-R72(其中野生型蛋白上的72位氨基酸被精氨酸替代)、CT-S109(其中野生型蛋白上的109位氨基酸被丝氨酸替代)，CpG家族分子来源的佐剂，CpG二核苷酸和包含CpG基序的合成寡核苷酸(见Krieg等，Nature，374：546(1995)和Davis等，J.Immunol.，160：870-876(1998))以及PT-K9/G129(其中野生型蛋白上的第9位氨基酸被赖氨酸替代，129位氨基酸被甘氨酸替代)(见国际专利申请Nos.WO93/13202和WO92/19265)；以及(7)可作为免疫刺激因子增强组合物疗效的其他物质。
胞壁酰肽包括而不限于N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-dipahitoyl-sn-甘油-3-huydroxyphosphoryloxy)-乙基酰胺(MTP-PE)等。
国际专利公开号No.WO 98/50071描述了病毒样颗粒(VLPs)可以作为佐剂用于增强与VLP共同注射的抗原的免疫应答。St.Clair等描述了蛋白结晶在增强体液免疫应答和细胞免疫应答方面的应用(St.Clair，N.等，Applied Biol.Sci.，96：9469-9474，1999)。
通过阅读本发明的说明书，本领域的技术人员可以很容易地理解通过给予非致病性病毒进行治疗的方法可以加以变通以激发出抗癌反应和/或抗感染性疾病反应。
根据长久以来形成的惯例，术语“一个”、“一种”和“这种”可用于指单数，也可用于指复数。当本文所用的术语“约”和可测量数值联用时，如肿瘤周围的距离或病变周围的距离，是指特定数值上下20％、10％、5％、1％或0.1％的变化，只要这种变化的数值能够实施本发明描述的方法或者说能够实施本发明。在某些实施方式中，“约”是指特定数值上下10％的变化。
D1.预测体内的活性
要预测体内的抗肿瘤活性常常是困难而偶然的。本发明提供了预测体内抗肿瘤活性的方法。在某些实施方式中，该方法包括使化合物与肿瘤细胞和外周血单核细胞接触，然后测定肿瘤细胞的死亡率。在某些实施方式中，化合物是非致病性病毒或非致病性的昆虫特异性病毒。任何方法都可用于测定细胞的死亡率，例如测定细胞调亡情况、坏死情况、细胞的存活能力等。可用于本发明的肿瘤细胞包括而不限于肺癌细胞(如A549细胞、3LL-HM细胞)、乳腺癌细胞(如4T1细胞；MT901细胞；MAT BIII细胞)、前列腺癌细胞、结肠癌细胞、皮肤癌细胞(如B16黑色素瘤细胞)、胰腺癌细胞、肝癌细胞、脑癌细胞、骨癌细胞(如MG-63细胞)、胃癌细胞或食管癌细胞等。
E.1释放试验
在一种药物上市以前，政府的有关机构，如食品药品监督管理局(FDA)，通常需要对这种药物进行严格的质量控制以确保该药物所含有的成分与其被FDA或其他政府机构批准的药物所含有的成分一样。这种质量控制通常通过释放试验来完成以确保该药物符合监督者制定的法规。
本发明提供了用于上市的抗癌和抗感染性疾病组合物的制备过程。在某些实施方式中，组合物包含一种或多种非致病性病毒。在某些实施方式中，非致病性病毒是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒。在某些实施方式中，非致病性病毒包括灭活病毒、病毒颗粒、病毒体、病毒样颗粒、病毒包含体或病毒成分。在某些实施方式中，制备过程包括进行组合物的释放试验以确保组合物的安全性、毒性和有效性符合处方的指导原则。
制备抗癌和抗感染性疾病组合物的过程包括使组合物与第一灭活剂接触以有效地灭活有活性的病毒，使组合物与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，通过体外试验确定灭活病毒、病毒颗粒、病毒体、病毒样颗粒、病毒包含体或病毒成分是无活性的。在某些实施方式中，每个灭活步骤后都要检测所述病毒、病毒颗粒、病毒体、病毒样颗粒、病毒包含体或病毒成分被灭活的情况。
在某些实施方式中，制备过程还包括对组合物随机取样以分析安全性、有效性或毒性中的一种或多种。在某些实施方式中，随机取得的样品的安全性和/或有效性和/或有效性与第二种抗癌或抗感染性疾病化合物的安全性和/或有效性和/或有效性比较。比较所得到的数据用于上市前药品评价。
在某些实施方式中，通过噬菌斑形成试验来确定病毒、病毒颗粒、病毒体、病毒样颗粒、病毒包含体或病毒成分是否已被灭活。在某些实施方式中，噬菌斑形成试验用的是Sf细胞。在某些实施方式中，制备过程还包括对灭活病毒、病毒颗粒、病毒体、病毒样颗粒、病毒包含体或病毒成分进行计数。计数可用本领域技术人员所熟知的任何方法进行。在某些实施方式中，计数用EM进行。
下面的实施例用于说明本发明，并不以任何方式构成对本发明的限定。本领域的技术人员应该清楚在本发明的精神和范围内可以对本发明作出修改。
实施例
实施例1.重组杆状病毒的制备
将编码人CCL21的全长序列(GenBank登录号No.NM 002989)克隆到杆状病毒运送载体pVL1392(Pharmingen of San Diego，California)内，按照厂商推荐的方法与BACULOGOLDWT基因组DNA(Pharmingen of San Diego，California)共转染。利用这种方法获得的重组杆状病毒在Sf9细胞内通过噬菌斑纯化进行亚克隆以制备几株表达人CCL21的分离株。挑选出一个克隆，因为这个克隆与其亲本病毒相比具有异常的表达特征。这个杆状病毒分离株的扩增以较低的感染复数(MOI)进行以制备出高滴度低传代的病毒种用于蛋白的制备。表达CCL21的杆状病毒被命名为BV422。其他重组杆状病毒用同样的方法制备。例如，制备出表达胞内Raf蛋白的杆状病毒，命名为BV762。
用感染复数(MOI)为2-10的杆状病毒感染无蛋白培养基内的粉纹夜蛾(Tn5)细胞48小时以制备蛋白质和出芽的杆状病毒。含有重组CCL21的BV422培养上清通过离心收获，过滤澄清后通过色谱柱进行纯化。
实施例2.肺癌动物模型内的肿瘤生长抑制
9-11周龄的C57BL/6小鼠在接种肿瘤细胞前最少要适应环境7天。在小鼠右腹部皮下接种2×105处于传代早期(＜10代)的3LL-HM肿瘤细胞。每周测量两次肿瘤的大小。肿瘤生长到50-100mm3(一般在接种后7天可以达到这个体积)，将小鼠随机分组。给荷瘤小鼠的肿瘤内注射杆状病毒表达的CCL21。调整给药剂量和给药方案以达到最大的肿瘤抑制效应。一旦有任何一组的肿瘤体积达到3000mm3(对照组小鼠一般在接种后33-35天可达到这个体积)就将小鼠处死。
如图1所示，瘤内注射杆状病毒表达的CCL21可导致3LL肿瘤生长的延迟。优化CCL21的剂量以达到完全抑制肿瘤生长的效果。以相对高的剂量注射2次或3次的给药方案与以相对低的剂量注射6次的给药方案所达到的效果一致。单次注射也可以观察到某种程度的肿瘤抑制。
实施例3.乳腺癌模型内的肿瘤生长抑制
9-11周龄的Balb/c小鼠在接种肿瘤细胞前最少要适应环境7天。在小鼠右腹部皮下接种2×105处于传代早期(＜10代)的4T1细胞。每周测量两次肿瘤的大小。肿瘤生长到50-100mm3(一般在接种后7天可以达到这个体积)，将小鼠随机分组。给荷瘤小鼠的肿瘤内注射杆状病毒。调整给药剂量以确定最佳有效剂量。一旦有任何一组的肿瘤体积达到3000mm3(对照组小鼠一般在接种后33-35天可达到这个体积)就将小鼠处死。如图2所示，瘤内注射CCL21可导致4T1肿瘤生长的延迟。
实施例4.黑色素瘤模型内的肿瘤生长抑制
鼠黑色素瘤细胞系B16-BL6用于在6-8周龄的粉红色雌性BDF-1小鼠(CharlesRiver Laboratories of Boston，Massachusetts)皮下建立肿瘤模型。为了建立皮肤肿瘤，在第0天将0.2ml含106B16-BL6细胞的培养基注射到6-8周龄的雌性BDF-1小鼠背部。在细胞注射之前及之后利用台盼蓝排出试验分析细胞的存活能力。注射之前的死细胞数一般不超过细胞总数的10％。6天之后肿瘤的直径一般可达到5-10mm。
杆状病毒表达的CCL21按照实施例1描述的方法制备。在第3天和第4天，于离每个肿瘤约3mm的部位皮下注射杆状病毒。每日测量肿瘤的体积，连续测量3周。当肿瘤体积达到4000mm3处死小鼠。
实施例5.对再接种肿瘤的抵抗力
按照上述方法制备和用杆状病毒处理荷瘤小鼠。给那些肿瘤完全被抑制的小鼠或在最后一次注射杆状病毒后2天将未完全抑制的肿瘤手术切除的小鼠再次接种肿瘤。腹腔注射200μl氯胺酮/赛拉嗪混合物(4∶1的氯胺酮/赛拉嗪，用磷酸盐缓冲液稀释10倍)以麻醉小鼠，切除肿瘤后用钉书钉封闭伤口。切除肿瘤后1到4天在原肿瘤部位以外的其他部位皮下注射2×105 4T1细胞以再次接种肿瘤。每周测量2次再次接种的肿瘤体积。将肿瘤生长被完全抑制的小鼠平均分成两组。一组在原肿瘤的对侧腹部皮下注射1×105细胞再次接种同种肿瘤，另一组在小鼠的左腹部皮下接种1×105不同种的肿瘤细胞(B16F10)。监测再接种部位肿瘤的生长状况。用杆状病毒处理小鼠可诱导小鼠对再次接种的3LL-HM肿瘤细胞产生抵抗力，但是却不能诱导小鼠对不同种的肿瘤细胞产生抵抗力。
实施例6.抑制肿瘤的转移
[00185]按照实施例3所描述的方法制备荷瘤小鼠并用杆状病毒处理。当对照组的小鼠由于肺转移而出现病危信号时处死小鼠。常规的观察指标包括呼吸困难、毛发油腻及体重下降。取小鼠的肺并保存在Buoin溶液中。观察是否发生了肺转移。图3显示杆状病毒表达的CCL21可显著抑制肿瘤的转移。
实施例7.杆状病毒的抗肿瘤活性
如实施例2-3和5-6所描述，杆状病毒表达的hCCL21的抗肿瘤活性主要是由于杆状病毒而不是CCL21。如图6所示，经过滤的杆状病毒表达的CCL21制备物不足以影响3LL肿瘤模型的缓解。经过过滤以后所有样品中CCL21的浓度没有发生变化。有些但不是所有杆状病毒表达的CCL21制备物同样是无效的。
与体内试验所观察到的疗效出现变化相反，所有的CCL21制备物在体外都可以有效诱导淋巴细胞的趋化作用。见表1和图7。这些结果说明杆状病毒表达的CCL21内的高分子杂蛋白对于达到较高的抗肿瘤活性是必需的，但不是CCL21在体外诱导趋化作用所必需的。
表1.重组CCL21制备物的活性
1可从PreproTech EC Ltd.of Rocky Hill，New Jersey购买
如实施例1所描述，杆状病毒是杆状病毒表达的CCL21制备物中的污染物。以能特异性识别杆状病毒gp4蛋白的抗体为探针利用蛋白印迹分析杆状病毒表达的CCL21。如图8所示，可以在杆状病毒表达的CCL21制备物中检测到gp64。另外，具有抗肿瘤活性的杆状病毒表达的CCL21批次含有的活病毒滴度相对较高，而无活性的批次含有的活病毒滴度相对较低(表2)。
表2.病毒滴度与杆状病毒表达的CCL21制备物的抗肿瘤活性相关
1小组分；2大组分；3bv，杆状病毒
图9显示在不存在CCL21的情况下，将与CCL21制备物中污染的病毒滴度相同的纯化活杆状病毒注射到肿瘤内所达到的肿瘤抑制效果与污染杆状病毒的CCL21一样。
实施例8.杆状病毒诱导的体外细胞毒活性
按照实施例1所描述的方法制备杆状病毒。以未感染的Sf9细胞作为对照。离心以后收集上清和细胞团。样品用培养基按1∶11稀释到初始病毒滴度5×106PFU/ml，分析其细胞毒活性。
人肺上皮细胞A549接种到96孔组织培养板中，设3复孔，与系列稀释的杆状病毒感染的或未感染的Sf9细胞及其上清共孵育。24小时去掉培养基，细胞用新鲜培养基洗涤。24到48小时后通过结晶紫染色分析细胞的存活能力，用分光镜定量。
如图10A所示，细胞团所诱导的细胞毒反应比上清更强。未感染细胞的上清没有细胞毒活性。图10B显示杆状病毒表达上清用0.2μm的滤膜过滤后(去掉内含的杆状病毒)其细胞毒活性显著降低，与体内活性的丧失相似。本文所描述的体外细胞毒试验可用于预测体内抗癌活性。参见图13。
实施例9.杆状病毒活化树突细胞的成熟
树突细胞(DC)培养物内添加野生型的杆状病毒可诱导DC细胞的成熟，其表现是活化标记分子在细胞表面表达水平的升高。如图11A和11B所示，杆状病毒可活化鼠骨髓衍生的DC和人单核细胞来源的DC。
按照标准的方法制备骨髓衍生的鼠DC。简言之，从6-8周龄的雌性Balb/c或C57BI/6(Charles River Laboratories of Holster，Califomia)小鼠体内分离其骨髓，用添加10％细胞培养级二甲亚砜(DMSO)的热灭活胎牛血清冷冻(-80℃)保存，细胞密度为2×107细胞/ml。细胞冻存管快速解冻后洗涤去除DMSO。将细胞接种到150mm悬浮培养皿中，培养基用20ml添加200U/ml鼠GM-CSF(PreproTech of Rocky Hill，New Jersey)的补充RPMI培养基(Sigma-ALDRICH of St.Louis，Missouri)。在培养的第3天，再次添加鼠GM-CSF，在第5天，离心去掉一半培养基，用含GM-CSF的新鲜培养基替换。用移液管小心吸取收获BMDC。
在第6天时加入杆状病毒和其他对照试剂。细胞继续孵育18小时，然后分析细胞和上清液。通过FACS分析BMDC表面的分子标记，通过测定第6天加入刺激因子前标记未成熟DC的标记物来确定其成熟情况，其中包括CD11c、CD11b、H-2Kd、I-Ad(表达低)、CD80(表达低)和CD86(表达低)。细胞与各种刺激因子共孵育过夜后洗涤细胞，用抗CD11c抗体和抗CD86抗体或抗I-A抗体双染，然后用流式细胞仪分析。采用门技术圈出CD11c阳性的活细胞群。刺激表达为平均荧光强度(MFI)除以只用GM-CSF处理的染色细胞的MFI。图11A显示用杆状病毒刺激后DC活化标记分子CD86和MHC II的表达显著升高(用抗I-A抗体检测)。经杆状病毒刺激后CD80和CD40的表达同样升高。
人源DC来源于外周血单核细胞，是用抗CD-14抗体包被的磁珠(Miltenyi Biotecof Auburn，California)从健康志愿者外周血棕黄层中纯化出来的。用含白细胞介素4和GM-CSF(1000U/ml，购自PreproTech of Rocky Hill，New Jersey)的培养基培养3-4天后收获未成熟的DC。通过FACS(Pharmingen of San Diego，California)分析发现，培养物中超过90％的细胞都是CD1a阳性的。用门技术(gating)圈出CD11a阳性的活细胞通过FACS分析DC表面的活化标记分子。图11B显示杆状病毒可诱导CD86和HLA-DR++表达水平升高。
实施例10.杆状病毒在体内活化CTL
用杆状病毒和可溶性蛋白抗原(HIV p24)免疫小鼠可诱导出很强的抗原特异性CTL反应。第三次免疫后2周取免疫小鼠的脾。将所取的脾混合，这样每个样品中有5个脾。免疫小鼠的脾细胞在24孔板中培养，每孔5×106个细胞。将这些细胞中的1×106细胞用下列物质致敏：(1)合成的p7g肽，这是一种H-2Kd限制性CTL表位，相当于HIV-1SF2p24gag的199-208位氨基酸；以及(2)pGagb肽，这是一种H-2Db限制性CTL表位，相当于HIV-1SF2p55gag的390-398位氨基酸。肽的浓度为10μM，37℃处理1小时。然后洗涤脾细胞，与剩余的4×106未处理的细胞共培养。脾细胞用2ml脾细胞培养基培养，培养基中含有：添加100mM L-谷氨酰胺(Gibco ofGrand Island，New York)的RPMI 1640(Sigma-Aldrich of St.Louis，Missouri)和α-Mem(最低要求标准培养基α，添加L-谷氨酰胺、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)(1∶1)、10％热灭活胎牛血清(Hyclone of Logan，Utah)(在56℃水浴中孵育30分钟灭活)、100U/ml青霉素、10μg/ml链霉素、10ml/L 100mM丙酮酸钠和50μM 2-巯基乙醇。另外，在细胞开始培养前以5％大鼠T-Stim IL2(大鼠T-Stim：Collaborative BiomedicalProducts of Bedford，Massachusetts)作为IL2源添加到培养基中。
经过6-7天的刺激，收集脾细胞作为效应细胞进行铬释放试验。约1×106SV/Balb或MC57靶细胞用200μl含50μCi51Cr的培养基培养，加入1μM校正肽p7g孵育60分钟后洗涤，以细胞-靶位不配对的肽作为阴性对照。效应细胞以不同的效应细胞：靶细胞比例与5×103靶细胞在200μl培养基中共培养4小时，培养板用的是96孔圆底或V形底组织培养板。两个复孔的每分钟计数平均值用于计算特异性释放百分率。图12显示杆状病毒可诱导细胞毒T细胞反应。
实施例11.光化学方法灭活杆状病毒
2升粉纹夜蛾(Tn)细胞悬浮培养物感染杆状病毒。在28℃孵育3天后收获被感染的细胞，800×g离心10分钟使上清液澄清。收获的培养基中的杆状病毒滴度用草地夜蛾(Tn)细胞通过噬菌斑形成试验来确定，如King & Possee(1992)，杆状病毒表达系统：实验室手册(The Baculovirus Expression System：A Laboratory Manual)，Chapman & Hall，London所描述。
用二甲亚砜(DMSO)制备0.2mg/ml的trioxalen储存液。感染细胞悬液中加入约5-10μg/ml的trioxalen，温和震荡使其分散到细胞悬液内。然后将细胞悬液倒入一个无缝的不锈钢托盘(如约1cm深)内，将托盘置于旋转平台上。将一个长波紫外灯(365nm，6W)直接放到托盘上空，离液面1cm。紫外照射进行约15分钟或足以灭活病毒的时间。
为了评价病毒灭活情况，用昆虫细胞测定trioxalen/UV灭活样品的滴度。例如，从细胞悬液中取样，系列稀释后感染Sf9细胞。接种后约16小时换液以使DMSO诱导的细胞毒性降到最低。接种后7天在显微镜下观察细胞以评价细胞的病理状况，如果是阴性的，将细胞再传代2次以进一步确定病毒的灭活情况。还可以检测培养物以评价细胞的细胞毒性。
实施例12.预测体内抗肿瘤效应的体外试验
用细胞毒性试验和体内鼠肿瘤模型分析各批次的CCL21，下文描述了两种试验的方法。细胞毒活性系数在下文也有描述。通过测定体内试验结束时的肿瘤大小来确定哪个批次是有活性的，哪个批次是无活性的。
诱导PBMC细胞毒活性的试验
[00210]诱导PBMC细胞毒活性的试验分析的是某种活化物质所诱导的细胞毒(或细胞抑制)反应，如细胞因子(IL-2或β-IFN)或抗粘附靶细胞系(A549或MG-63细胞)的杆状病毒(BV)，所用的是效应细胞(PBMC)和靶细胞的共培养技术。孵育以后，通过Alamar blue染色定量检测靶细胞的存活能力。试验用的材料包括：
生长培养基(GM)：(含Earle盐的Eagle′s MEM，2.2g/L碳酸氢钠，胎牛血清(FBS)，L-谷氨酰胺，青霉素和链霉素)：
MEM............................................................................500ml
FBS.............................................................................50ml
L-谷氨酰胺(200mM)............................................................... 5ml
青霉素(10,000U/ml)/链霉素(10,000μg/ml)/mix....................................... 5ml
生长/分析培养基(GAM)：(RPMI 1640w/o pH指示剂，胎牛血清(FBS)，L-谷氨酰胺)：
RPMI 1640.......................................................................500ml
FBS............................................................................. 50ml
L-谷氨酰胺(200mM)..................................................... 5ml
PBMC制备培养基：(RPMI 1640w/o pH指示剂，0.5％BSA成分V)：
RPMI 1640........................................................... 500ml
BSA(7.5％BSA溶液).................................................... 37ml
STV溶液：(盐水A，胰蛋白，依地酸(Na4 EDTA))：
NaCl................................................................ 8.00g
KCl................................................................. 0.40g
D-葡萄糖1.00g
NaHCO3.............................................................. 0.58g
胰蛋白1：250........................................................ 0.50g
Na4 EDTA............................................................ 0.20g
0.5％酚红........................................................... 0.9ml
玻璃蒸馏水............................................. 添加到总体积为1.0L
磷酸缓冲盐水：(PBS，无钙无镁)
KCl.................................................................. 0.2g
NaCIl................................................................ 8.0g
KH2PO4...............................................................0.2g
Na2HPO4.............................................................1.14g
玻璃蒸馏水............................................. 添加到总体积为1.0L
Alamar Blue染色培养基：添加Alamar blue(Biosource International)的RPMI 1640。
A549细胞
A549人肺癌细胞得自美国典型培养物收集中心，处于第76代(ATCC CCL 185)。扩增细胞，然后将低传代的细胞冷冻保存。A549细胞的主种子用液氮冷冻保存。
A549工作培养物
A549细胞以粘连单层生长，传代时必须用胰酶消化。倒掉T-175培养瓶中的培养基，细胞单层用10-15ml PBS洗涤两次，然后每瓶中加入3-5ml STV，孵育3-4分钟直到细胞开始脱离，温和吹打脱离的细胞。每瓶中加入5ml生长培养基，用移液管轻轻吹打细胞制备单细胞悬液，然后将细胞转移到含新鲜生长培养基的50ml离心管内轻轻混合。将不同比例的细胞混合物(1∶5、1∶10或1∶20的分别培养2、3和4天的细胞)加入到含40±5ml、37℃预热的新鲜生长培养基的T175培养瓶内。
MG-63细胞
人骨肉瘤细胞系MG-63得自美国典型培养物收集中心(ATCC CRL 1427)。MG-63细胞的主种子用液氮冷冻保存。
MG-63工作培养物
工作培养物每3天或4天分裂一次。细胞生长到融合的单细胞层后每3天按1∶6的比例传代或者每4天按1∶8的比例传代。
传代过程：
MG-63以粘连单层生长，传代时必须用胰酶消化。吸去T-175培养瓶中的培养基，细胞单层用10-15ml PBS洗涤两次，每瓶中加入4±0.1ml STV，然后在37℃±2℃、5±1％CO2中孵育3-5分钟直到细胞开始脱离，温和吹打使细胞脱离培养瓶壁。
用移液管上下吹打STV内的细胞制备均匀的细胞悬液，然后将细胞转移到含新鲜生长培养基的50ml离心管内轻轻混合。将不同比例的细胞混合物(1∶6或1∶8)加入到含40±5ml、37℃预热的新鲜生长培养基的培养瓶内。
PBMC细胞
PBMC采自志愿者。
制备A549或MG-63细胞用于PBMC诱导的细胞毒试验
去掉T-175培养瓶内A549或MG-63工作培养物的培养基。细胞单层用10-15mlPBS洗涤两次，然后每瓶中加入3-5ml STV，孵育5分钟或者直到细胞开始脱离，温和吹打使细胞脱离培养瓶壁。每瓶中加入5ml生长培养基，用移液管轻轻吹打细胞制备单细胞悬液，然后将细胞转移到50ml圆锥形试管内，再加入25ml生长培养基，反转试管以混合细胞，得到细胞浓缩物。测定细胞浓缩物中细胞的密度。简言之，将细胞悬液按1∶3稀释，然后用Z1型Coulter计数仪计数。计数A549细胞时把计数仪的阈值设定为8微米，计数MG-63细胞时计数仪的阈值也设定为8微米。
用生长分析培养基将A549细胞浓缩到50,000细胞/ml，将MG-63细胞浓缩到65,000细胞/ml。所需要的总细胞数等于所需要的培养基总体积乘以接种密度。所需要的细胞浓缩物的体积(C)等于所需要的细胞总数除以浓缩物的密度。所需要添加的生长/分析培养基的体积(GAM)等于所需要的培养基的体积减去细胞浓缩物的体积。用于PBMC诱导的细胞毒试验的靶细胞接种密度由(C)和(GAM)决定。
在一次性Erlenmeyer培养瓶或组织培养玻璃器皿中制备细胞悬液。在15分钟内将细胞加到分析板中。每孔内加入100μl细胞悬液(每孔5000个A549细胞或者6500个MG-63细胞)。分析板加盖后在湿润的37℃±2℃、5±0.5％CO2孵育箱中孵育18到24小时。
在转移板内进行初始样品制备和系列稀释
初筛试验
为了提高检测到PBMC细胞毒活性诱导因子的几率，先制备相对较高浓度的样品。在随后的试验中根据样品的活性逐渐降低样品的浓度。
低浓度的CCL21样品：
用PBS(无钙无镁)将低蛋白浓度的CCL21样品(3000μg/ml以下)稀释到400到600μg/ml之间。加入FBS和L-谷氨酰胺使样品中FBS的浓度达到10％，L-谷氨酰胺的浓度达到1％。将240μl的样品加到96孔板的第一孔中。用含10％FBS和1％L-谷氨酰胺的PBS在96孔转移板内倍比稀释样品。
准备使用高浓度进行试验的样品(蛋白、活性、细胞或病毒)按照低浓度蛋白样品的试验方法进行制备，或者直接加入生长/分析培养基进行制备。将240μl的样品加到96孔板的第一孔中。用生长分析培养基在96孔转移板内倍比稀释样品。
杆状病毒样品：
BV样品用生长/分析培养基(GAM)稀释到1∶2到1∶10，按照上述方法用GAM进行系列稀释。
β-IFN或IL-2：
小玻璃瓶内的β-IFN或IL-2样品用适当的稀释剂(注射用盐水或注射用水)从新配制。0.25mg/ml从新配制的β-IFN等于13.9μM，1.1mg/ml从新配制的IL-2等于64.7μM。用生长分析培养基(GAM)进一步稀释200,000IU/ml的细胞因子制备成工作液。批号为IFN-01-001的β-IFN按1∶35.75的比例用GAM稀释，批号为MLAPM006的IL-2按1∶91.75的比例用GAM稀释。然后用GAM稀释到试验所需的浓度。IL-2的试验浓度为2000IU/ml，β-IFN的试验浓度为2000IU/ml。
高浓度的CCL21样品：
上述3mg/ml的CCL21样品用GAM稀释到200到600μg/ml的试验浓度。
将稀释的样品转移到靶细胞(分析)板上：
将稀释板内的样品转移到分析(细胞)板内。样品的最终浓度为原稀释板浓度的1/2。用具有板到板转移程序的移液器进行样品的转移。在制备PBMC的同时孵育分析板。
用于测定试验样品对靶细胞的直接细胞毒性的毒性对照板：
取两个一样的转移板(稀释板)，将培养基加到2个细胞板内。第一个板内加入50μl PBMC制备物用于诱导的细胞毒性试验，第二个板内加入50μl PBMC制备培养基用于测定被测样品的直接细胞毒活性。
从人外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)
制备1∶10稀释的漂白溶液(3升)。所有接触血的试管和移液管都要漂白过夜。将烧杯干燥并将所有物品弃于收集生物危害品的容器。在处理血液前将50ml试管的盖子去掉(防止血液污染盖子)。将血液加入到250ml可降解的聚合羧酸盐培养瓶内，用等量的HBSS稀释。在加入血液前30分钟将约17ml ficoll-plaque溶液加到50ml聚苯乙烯试管内。血液会在ficoll-plaque溶液之上分层，并且不会破坏ficoll层。每3ml ficoll-plaque加入4ml血液/HBSS(即每个50ml试管内加入17ml ficoll和23ml血液/HBSS)。
在室温下1800rpm(400×g)离心试管30分钟(Sorval GLC-2B离心机)。用25ml的血清学移液管尽可能多地吸取顶层的液体，留约5ml的体积在第二层顶部。用5ml血清学移液管去掉第一层的剩余部分。然后用5ml的无菌血清学移液管收集含B淋巴细胞和T淋巴细胞的第二层，转移到另一个50ml试管内。收集物用3倍体积的不含添加物的RPMI稀释，所得到的溶液900rpm(100×g)离心15-20分钟(第一次洗涤)。用血清学移液管将上清去掉，细胞用40ml RPMI重悬，900rpm重复离心一次(第二次洗涤)。用血清学移液管将上清去掉，细胞用40ml PBMC制备培养基(含0.5％BSA的RPMI)重悬。准确记录重悬细胞的总体积。用Coulter计数器对细胞进行计数以确定细胞的浓度--用PBMC制备培养基按1∶5的比例稀释浓缩的细胞用于计数)。
确定达到合适细胞浓度所需要的重悬体积。细胞毒性试验所需要的细胞浓度为2×106细胞/ml，冷冻PBMC理想的细胞密度为10×106细胞/ml。最终的重悬体积等于细胞浓度乘以总体积再除以最终所需的细胞浓度(2或10×106细胞/ml)。
剩余的重悬细胞900rpm再次离心(第三次洗涤)。去掉上清液，将细胞重新悬浮到终体积。用Coulter计数器确定细胞的浓度(用PBMC制备培养基按1∶10的比例稀释浓缩的细胞用于计数)。
试验用的PBMC制备物
细胞重悬到PBMC制备培养基内直接用于分析试验。将细胞用PBMC制备培养基按1∶2的比例稀释使细胞终浓度达到1×106细胞/ml。将细胞加到分析板中与50μl/孔的靶细胞混合(50000PBMC/孔)。用多道移液器添加PBMC。分析板置于37℃、5％CO2中孵育3到4天。
用于冻存的PBMC制备物
将细胞重悬到含10％DMSO的FBS(热灭活的)中，以10×106细胞/ml的浓度冻存。细胞分装到2ml的无菌冻存管中，加入异丙醇后冷冻到-70℃冰箱的冻存盒内。用Coulter计数器确定最终的细胞浓度。
解冻冻存的PBMC用于试验
在37℃水浴中快速融化PBMC冻存管。细胞用13ml RPMI 1640重悬，装入圆锥形离心管后900rpm(100×g)离心15-20分钟。用血清学移液管去掉上清，细胞重悬到13ml PBMC制备培养基中(含0.5％BSA的RPMI)。用Coulter计数器计数以确定细胞的浓度(用PBMC制备培养基按1∶5的比例稀释浓缩的细胞用于计数)。
确定达到合适细胞浓度所需要的重悬体积。细胞毒性试验所需要的细胞浓度为2×106细胞/ml，冷冻PBMC理想的细胞密度为10×106细胞/ml。最终的重悬体积等于细胞浓度乘以总体积再除以最终所需的细胞浓度(2或10×106细胞/ml)。剩余的重悬细胞900rpm再次离心。去掉上清液，将细胞重新悬浮到终体积。
用Coulter计数器确定细胞的浓度(用PBMC制备培养基按1∶10的比例稀释浓缩的细胞用于计数)。将细胞用生长分析培养基按1∶2的比例进一步稀释使细胞终浓度达到1×106细胞/ml。将细胞加到分析板中与50μl/孔的靶细胞混合(50000 PBMC/孔)。用多道移液器添加PBMC。分析板置于37℃、5％CO2中孵育3到4天。
用Alamar Blue染色分析板
孵育3到4天后，从分析板上吸去培养基。每孔加入100μl Alamar Blue染色液(含10％Alamar Blue、0.5％BSA的RPMI)，分析板再孵育2到3小时。用分光光度计(测定570nm-630nm处的吸光度)或荧光光度计(测定530nm处的激发光和590nm处的发射光)。
检测活性
检测活性定义为参照孔的反应除以PBMC样品孔的反应。在大多数情况下，参照孔是无PBMC的样品对照孔，其中所含的样品浓度与PBMC样品孔一样，通常用最大的样品浓度(系列稀释中的第一孔)。在某些情况下，如果样品量不足以设无PBMC的对照板，则参照孔用含或不含PBMC的PBS/生长培养基。
如果有足够量的样品来设置无PBMC的对照板，则活性设定为直接的细胞毒反应/诱导的细胞毒反应。如图14所示，体外的试验结果与体内的试验结果一致。
实施例13.抗-gp64单克隆抗体阻断杆状病毒的肿瘤细胞杀伤效应
杆状病毒起始材料(CΔ3)用抗-gp64抗体处理。简言之，1-500μg纯化的抗-gp64鼠单克隆抗体(克隆1.3A，由Dr.DONALD Jarvis，U.of WY提供)或Ig对照抗体与不同感染复数的重组杆状病毒在一定的体积内混合。在室温下于暗处使抗体与病毒结合约15小时，在进行噬菌斑形成试验或细胞毒试验前将样品冷藏1-2天。按照上面所描述的方法用细胞毒试验检测样品。见图15。
实施例14.灭活杆状病毒在体外诱导PBMC介导的肿瘤细胞杀伤作用
杆状病毒起始材料(CΔ3)通过trioxalen和紫外线处理加以灭活。杆状病毒通过补骨脂素和紫外线照射进行光灭活(Weightman，S.A.和Banks，M.J.Virol.Met.81：179-182(1999))。将含杆状病毒的昆虫细胞培养培养基(3ml，约6E7 pfu)转移到6孔培养板(Costar)内。用二甲亚砜(DMSO)制备2mg/ml的4，5’，8-三甲基补骨脂素(trioxalen)储存液，然后加到每个孔内，终浓度达到100μg/ml。然后在培养板上1.5cm处放置一个手提灯(Model UVL-56，UVP，Upland，CA)用紫外线(365nm)照射培养板15分钟。对照样品包括不含补骨脂素的DMSO和含补骨脂素但未进行紫外线照射的DMSO。照射以后将培养基转移到10 MWCO透析筒(Slidalyzer，Pierce)内，用磷酸缓冲盐透析。所有样品都用Sf9细胞进行噬菌斑形成试验。按照上面所描述的方法检测样品的细胞毒活性，结果见图16。
实施例15.肿瘤细胞是杆状病毒的主要靶细胞
完整的A549靶细胞单层培养物经杆状病毒处理3小时后用生长分析培养基洗涤3次。同时，效应细胞(PBMC)也用杆状病毒处理3小时后用生长分析培养基洗涤3次。按照如下组合将杆状病毒处理的和未处理的靶细胞与效应细胞混合：1)单独的未处理靶细胞；2)未处理靶细胞和效应细胞；3)杆状病毒处理的靶细胞和未处理的PBMC；以及4)未处理的靶细胞与杆状病毒处理的PBMC。
孵育4天后按照SOP中所描述的方法测定靶细胞的存活能力。利用Alamar Blue荧光确定的细胞存活能力，取每组中16个孔平均值(试验在96孔板内进行)。结果见图17。
实施例16.利用杆状病毒抑制肺癌动物模型内肿瘤的生长
8-10周龄的C57BL/6小鼠在接种肿瘤细胞前最少要适应环境7天。在小鼠右腹部皮下接种2×105处于传代早期(＜10代)的3LL-HM肿瘤细胞。每周测量两次肿瘤的大小。肿瘤生长到50-100mm3(一般在接种后7天可以达到这个体积)时，将小鼠随机分组，同一天给小鼠的肿瘤内注射第一次杆状病毒。给药方案为每日一次，连续6天。小鼠分为如下4组：1)白蛋白阴性对照，单次剂量为25μg(0.5mg/ml)；2)活病毒阳性对照(滴度约为1×107/ml)；3)活病毒阴性对照(滴度约为800/ml)；以及4)灭活病毒(滴度约为800/ml)。每周测量两次肿瘤的大小，连续测定4周。当肿瘤体积达到2500mm3或小鼠出现下列任何一种症状时处死小鼠：体重下降超过20％；肿瘤溃疡面积超过肿瘤表面积的30％或者虽然低于30％但是肿瘤出现破溃、出血或流脓；严重的呼吸困难或处于垂死状态。
如图18所示，瘤内注射杆状病毒可导致3LL肿瘤生长的延迟。
实施例17.利用杆状病毒在体外和体内产生抗感染性因子的保护作用。
活杆状病毒已经表明可诱导鼠细胞系和人细胞系分泌干扰素(IFN)，并且可在鼠体内诱导抗脑心肌炎病毒感染的保护作用。但是用紫外线将杆状病毒灭活后其感染性和IFN诱导活性丧失(Gronowski等，J Virology，Dec.1999，p.9944-9951卷73，No.12)。
为了研究杆状病毒对感染因子的影响，用水泡性口炎病毒(VSV)在体内和体外感染细胞。如图19所示，用Sf9和杆状病毒或Sf9和杆状病毒培养上清处理的细胞或培养基可在体外产生最大的抗VSV保护效应。如图19所示，灭活的杆状病毒在体内和体外都可以产生抗致病性病毒感染的保护效应。
实施例18：旁观者效应
为了确定肿瘤细胞的抑制是否是直接的作用(即每个细胞必须被非致病性病毒感染)，将感染的肿瘤细胞与未感染的肿瘤细胞按不同比例混合。
A549或MG-63细胞系或PBMC与活化剂量的杆状病毒接触3到5小时，然后将剩余的或未结合的病毒从应答细胞内洗去。经洗涤的BV处理细胞与未处理的应答细胞按不同比例混合。BV处理的和未处理的PBMC混合物加到未处理的A549或MG-63靶细胞内，另外，BV处理的A549或MG-63细胞混合物加到未处理的PBMC内。BV未处理的细胞和BV处理的细胞按照一样的方法处理。
PBMC在CO2培养箱内不断振摇使之处于悬浮状态才能被BV感染。细胞经离心、倒掉上清、再悬浮(3次)洗涤后与未处理的PBMC混合。BV处理A549和MG-63靶细胞的方式有两种，一种是完整单层细胞用BV处理，再用新鲜的生长培养基温和洗涤，然后将未处理的靶细胞加到分析板内；另一种方式是如上面所描述的PBMC那样在悬浮状态下处理。
如果将杆状病毒从A549和MG-63靶细胞中洗掉后很久再加入PBMC，则细胞毒试验中所检测到的细胞毒反应快速消失。对于A549细胞来说，去掉杆状病毒后20小时细胞毒反应完全消失，对于MG-63细胞来说，细胞毒反应基本消失(数据未列出)。
原位洗涤杆状病毒处理的靶细胞单层，然后与未处理的细胞混合，立即加入PBMC可对A549和MG-63细胞产生旁观者效应。
在悬浮状态下用BV处理PBMC或A549细胞再经过离心洗涤(3个循环的离心、去上清、再悬浮)可有效地消除细胞毒反应。
BV处理MG-63细胞并离心洗涤对MG-63靶细胞的细胞毒反应影响较小。
在振摇使之处于悬浮状态下用BV处理PBMC再经过离心洗涤好像可以非特异性地刺激抗MG-63靶细胞的细胞毒反应(在含0％BV处理细胞的孔内)，但是对A549细胞没有这种作用。
如图20所示，当总细胞体积是20％的感染细胞和80％的非感染细胞时，可以观察到最大反应。因此，未感染的细胞可被大家所熟知的旁观者效应杀伤(即靠近靶细胞可促进非靶细胞(未感染细胞)的死亡)。
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下面所列出的参考文献以及本说明书所引用的所有参考文献都已纳入本文作为参考，其目的在于为本发明所用的方法、技术和/或组合物提供背景资料或者说明这些方法、技术和/或组合物。
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应当理解的是本发明的各种详细描述在不脱离本发明的范围的情况下可以做出修改。而且，上述的说明书只是为了说明的目的，并不意味着对权利要求所定义的本发明的限制。
机译： 抗癌组合物和抗感染性疾病组合物及其使用方法
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