一种烟草原生质体高效快捷培养方法

摘要

本发明提供了一种烟草原生质体高效快捷培养方法及相关培养基，该方法包括：以无菌培养30天的烟草幼苗进行原生质体游离酶解；28℃、暗酶解8小时后，以240目不锈钢筛网过滤酶解液，滤液离心后所得沉淀用CPW21溶液(CPW盐附加21％蔗糖)纯化；纯化的原生质体沉淀中加入适当体积的MS1培养基，与等体积的含1.2％琼脂糖的MS2培养基悬浮混匀，加入培养皿后在27℃恒温培养箱中暗培养；培养15天后，可长出微小愈伤组织。微小愈伤组织直接进行芽的诱导，可快速形成小植株。本法操作简便、成活率大为提高，采用本法，对开展烟草遗传改良及以烟草为模式植物进行光合作用等的研究提供高效快捷方法。

说明书

技术领域：本发明涉及一种烟草原生质体高效快捷培养方法，属生物技术领域。

背景技术：烟草(Nicotiana tabacum)是我国重要的经济作物，包括烟叶生产烟草在内的相关产业每年上交利税占全国的10％左右。近来随着人们对烟叶品质的需求及安全性等方面的需求越来越高，因而加快优良品种选育是满足这种需求的重要途径之一，利用原生质体融合开展烟草育种是加快育种进程的重要方法，这种方法可打破种间不亲和障碍，是创造和扩大变异的主要手段之一。而且由于原生质体在结构上的特异性，还可以为细胞学、遗传学、病毒学建立试验体系。因而高效快捷地进行烟草原生质体培养是开展上述工作的基础和关键。

烟草原产于南美洲，其原生质体培养已经报道的有：1971年Nagata和Tabeke首次报道利用Km8P培养基(Km8P+0.4mg/L的6-BA+0.4mg/L的2，4-D+0.6mg/LIAA)获得叶肉原生质体离体培养再生植株；Firoozabady建立了栽培烟草原生质体快速培养方法，培养周期缩短为8周，我国学者徐杏阳、黄文川等对烟草原生质体又作了些修改。以上技术步骤仍然烦琐，从裸露细胞到愈伤组织形成需不断调整渗透压，污染几率偏高。

发明内容：本发明针对以上现有技术的不足，发明一种利用烟草无菌苗为外植体，操作快速简洁，污染几率大为减少，有利于愈伤组织的快速形成和植株再生的一种烟草原生质体高效快捷培养方法。

本发明的目的在于：针对前人所作烟草原生质体培养步骤烦琐、周期长、污染率高的问题，提供一种烟草原生质体高效快捷培养方法。

本发明提供的一种烟草原生质体高效快捷培养方法，包括下列步骤：A、原生质体游离纯化：取培养30天的烟草无菌叶片，放入酶解液中，酶解液经0.22μm混合纤维素微孔滤膜过滤除菌，其pH5.8，酶解结束，酶解液以900rpm离心7-8min。去掉上清，向所得沉淀中缓缓加入6ml的CPW21盐溶液并使沉淀悬浮，以800rpm离心6-7min，用巴斯德吸管小心地将处于离心管上部的原生质体带吸出，并以CPW10溶液洗涤2-3次后得到的原生质体便是纯净的原生质体；

B、原生质体培养：将纯化的原生质体以0.5ml MS1培养基轻轻悬浮，与等体积的MS2培养基混合均匀，加入30mm×10mm培养皿，用Parafilm膜封口后放入27℃恒温培养箱中倒置(防止水分蒸发)进行暗培养；其中将MS基本培养基中的大量元素减半，得到1/2MS，加入了2.4-二氯苯氧乙酸2.5mg/L、6-糠基嘌呤0.5mg/L，另外含有蔗糖30g/L和甘露醇80g/L；MS2为1/2MS，加入6-苄基嘌呤0.5mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、奈乙酸0.5mg/L，另外含有蔗糖30g/L和甘露醇80g/L，培养10天后，获得微小愈伤组织，直接将微小愈伤组织转入芽分化培养基，该培养基为MS，加入了噻重氮苯基脲0.5mg/L和活性炭3gg/L；培养20后，获得具4片叶的小苗，再将小苗转入诱根培养基，该培养基与MS1相同，但不含任何激素，而且加入了活性炭3g/L；

诱根10天左右萌发4-5条不定根，即可进行移栽，生成的小苗无需锻炼，直接移栽到生产用育苗基质上，移栽成活率在99％以上。

所述酶解液组成是：以CPW10盐溶液为溶剂，加入纤维素酶(Cellulase Onzuka R-10)和的离析酶(Macerozyme R-10)，使它们的终浓度分别为1.0％和0.5％。酶充分溶解后，以0.22μm微孔过滤灭菌备用(以重量/体积比计算)。

CPW10盐溶液组成是：以CPW盐为溶剂，加入10％的甘露醇(以重量/体积比计算)；CPW盐由27.2mg/L的KH₂PO₄、101.0mg/L的KNO₃、1480.0mg/L的CaCl₂·2H₂O、246.0mg/L的MgSO₄·7H₂O、0.16mg/L的KI和0.025mg/L的CuSO₄·5H₂O组成，调整CPW10盐溶液pH值为5.8。

CPW21盐溶液是在以CPW10盐溶液为溶剂，加入21％蔗糖组成(以重量/体积比计算)。

不含琼脂糖的愈伤组织诱导培养基(MS1)是将MS常规基本培养基中的大量元素减半，加入了2.4-二氯苯氧乙酸2.5mg/L、6-糠基嘌呤0.5mg/L，另外含有蔗糖30g/L和甘露醇80g/L构成。

含琼脂糖的愈伤组织诱导培养基(MS2)是1/2MS培养基，加入6-苄基嘌呤0.5mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、奈乙酸0.5mg/L，另外含有1.2％的低熔点琼脂糖、蔗糖30g/L和甘露醇80g/L。

烟草为栽培烟草(Nicotiana tabacum)、圆锥烟草(N.paniculata)、黄花烟草(N.rustica)、花烟草(N.alata)和波叶烟草(N.undulata)。

基本工作过程：1、原生质体的制备：将整片无菌叶放入10ml酶解液中进行酶解，在26℃恒温培养箱中暗酶解，酶解时间为8小时。

2、原生质体的纯化：酶解完毕，将游离出的原生质体连同酶液经240目不锈钢筛网过滤，滤液离心去掉上清，向所得沉淀中缓缓加入CPW21(CPW10盐溶液中附加21％蔗糖)溶液，悬浮沉淀并离心，以巴斯德吸管小心地将处于离心管上部的原生质体带吸出，并以CPW10(CPW10盐溶液中附加10％甘露醇)溶液洗涤3次后得到的原生质体，该原生质体便是纯净的原生质体。

3、原生质体高效快捷培养：愈伤组织的诱导与分化阶段，纯化的原生质体沉淀用不含琼脂糖的愈伤组织诱导培养基(其组成为1/2MS培养基中，加入了2.4-二氯苯氧乙酸2.5mg/L、6-糠基嘌呤0.5mg/L，另外含有蔗糖30g/L和甘露醇80g/L，以MS1表示)轻轻悬浮，再加入等体积的含琼脂糖的愈伤组织诱导培养基(其组成为1/2MS培养基中，加入6-苄基嘌呤0.5mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、奈乙酸0.5mg/L，另外含有1.2％的低熔点琼脂糖、蔗糖30g/L和甘露醇80g/L，以MS2表示)，混匀后迅速加入30mm×10mm培养皿，用Parafilm膜封口后放入27℃恒温培养箱中倒置(防止水分蒸发)进行暗培养。培养10天后，可长出直径0.2mm微小愈伤组织，无需调整渗透压。将微小愈伤组织直接加入分化培养基中进行培养，培养25天后可长出小苗，即可转入生根阶段。

生根：将所得小苗转移到生根培养基(成分和MS1相同，但不含激素)，培养10天左右萌发多条不定根，即可进行移栽。生成的小苗直接移栽到生产用育苗基质上，移栽成活率在99％以上。

上述MS培养基的成分按常规为：硝酸铵(NH₄NO₃)1650mg/L，硝酸钾(KNO₃)900mg/L，硫酸镁(MgSO₄.7H₂O)370mg/L，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)1701mg/L，氯化钙(CaCl₂.2H₂O)440mg/L，硫酸锰(MnSO₄.4H₂O)22.3mg/L，硫酸锌(ZnSO₄.7H₂O)8.6mg/L，硼酸(HBO₃)6.2mg/L，碘化钾(KI)0.83mg/L，钼酸钠(Na₂MoO₄.2H₂O)0.25mg/L，硫酸铜(CuSO₄.5H₂O)0.025mg/L，氯化钴(CoCl₂.6H₂O)0.025mg/L，硫酸亚铁(FeSO₄.7H₂O)27.8mg/L，Na₂EDTA 37.3mg/L，甘氨酸0.025mg/L，盐酸硫胺素0.4mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L。

本发明有以下优点：微小愈伤组织形成快、步骤简洁、分化效率高，污染率大为降低。省略了进行原生质体游离前的质壁分离、愈伤组织诱导过程中渗透压调节和转接以及愈伤组织增殖等步骤，而且所用培养基诱发短，增殖频率高。

具体实施方式：

实施例1：1、培养无菌苗：将栽培烟草种子以75％的乙醇中消毒30s，在0.1％HgCl₂溶液中灭菌7min，无菌水冲洗4-5次，播种在由附加蔗糖3％、琼脂0.8％、不含激素的MS基本培养基(Murashige and Skoog培养基，简称MS)组成的培养基上，在26±2℃培养室进行培养，30天后获得的无菌苗，即可进行原生质体的游离。

2、原生质体游离和纯化：酶解液组成为CPW10盐溶液(KH₂PO₄27.2mg/L、KNO₃101.0mg/L、CaCl₂·2H₂O1480.0mg/L、MgSO₄·7H₂O246.0mg/L、KI0.16mgg/L、CuSO₄·5H₂O0.025mg/L，10％甘露醇，PH5.8。)为溶剂，溶解1.0％的纤维素酶(Cellulase OnzukaR-10，日本产)和0.5％的离析酶(Macerozyme R-10，日本产)，pH5.8。酶解结束，酶解液以900rpm离心7min。去掉上清，向所得沉淀中缓缓加入6ml的CPW21溶液(CPW10盐溶液中附加21％蔗糖，下同)并使沉淀悬浮，以800rpm离心6min，用巴斯德吸管小心地将处于离心管上部的原生质体带吸出，并以CPW10盐溶液洗涤3次后得到的原生质体便是纯净的原生质体。

3、原生质体培养：将纯化的原生质体以0.5mlMS1(见以下说明)培养基进行悬浮，与等体积的MS2(见以下说明)培养基混合均匀，加入30mm×10mm培养皿，用Parafilm膜封口后放入27℃恒温培养箱中倒置(防止水分蒸发)进行暗培养。

其中MS1为1/2MS培养基中，加入了2.4-二氯苯氧乙酸2.5mg/L、6-糠基嘌呤0.5mg/L，另外含有蔗糖30g/L和甘露醇80g/L；MS2为1/2MS，加入6-苄基嘌呤0.5mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L、奈乙酸0.5mg/L，另外含有1.2％的低熔点琼脂糖、蔗糖30g/L和甘露醇80g/L。培养10天后，获得微小愈伤组织，直接将微小愈伤组织转入芽分化培养基，该培养基为MS，加入了噻重氮苯基脲0.5mg/L和活性炭3g/L。培养20后，获得具4片叶的小苗。再将小苗转入诱根培养基，该诱根培养基与MS1相同，但不含任何激素，而且加入了活性炭3g/L。

诱根10天左右萌发4-5条不定根，即可进行移栽。生成的小苗无需锻炼，直接移栽到生产用育苗基质上，移栽成活率在99％以上。

实施例2：取栽培烟草(Nicotiana tabacum)、圆锥烟草(N.paniculata)、黄花烟草(N.rustica)、花烟草(N.alata)和波叶烟草(N.undulata)等野生烟草，按实施例1所述方法进行培养，获得了相同的效果。