栽培烟草原生质体培养再生植株的研究和烟草抗病相关基因NtEIF4E与NtTOM3的敲除和鉴定

摘要

植物原生质体是除去细胞壁仅由细胞膜包裹的裸露细胞。烟草原生质体遗传表达系统作为研究基因网络调控、基因瞬时表达和信号通路的一种重要工具广泛应用，也是在细胞水平上研究植物分子机制和植物病毒感染的理想实验材料；此外，原生质体再生植株体系，也是实现单细胞遗传操作以及加快分子育种进程的重要基础。
　　烟草是一种重要的模式植物和经济作物。烟草抗病相关基因的研究有助于了解植物对病虫害的防御机制，并且减少病虫害对烟草产量造成的损失。马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是危害国内烟草种植业的优势病毒，对烟草的产量造成严重的经济损失。病毒浸染植株时，病毒需要依赖宿主细胞提供复制和翻译的场所以及能量的供应，其感染过程即是病毒与植物的互作的产物。下调这类宿主基因即可有效的抑制相关病毒的感染和传播。已有研究结果显示，EIF4E和TOM3基因分别是协助PVY和TMV病毒复制和转运的关键基因。
　　本研究以栽培烟草作为原生质体分离、纯化和再生体系构建的材料，对相关的影响因素进行了研究，获得了产量较高、质量较好的原生质体，并获得了栽培烟草再生植株。另一方面，使用Crispr/Cas9敲除系统敲除NtEIF4E和NtTOM3基因，获得了转基因植株，为研究栽培烟草抵抗PVY和TMV病毒的感染奠定了基础。本研究的主要结果如下：
　　1.栽培烟草原生质体的分离和纯化
　　构建了栽培烟草红花大金元原生质体分离纯化系统。使用纤维素酶和离析酶酶解八周左右烟草无菌幼苗的细胞壁，去除叶尖和叶脉组织后将叶片切成1-2厘米的丝状，与酶液混合恒温培养12小时。去除残余物质后多次离心后即可得到纯净的原生质体。
　　2.栽培烟草原生质体再生体系的构建
　　成功构建了红花大金元原生质体再生体系。主要探究了pH值和甘露醇浓度对烟草原生质体分裂的影响，发现在pH5.8和0.5M甘露醇条件下，烟草原生质体分裂效果最佳。从原生质体到完整植株所需培养时间为200天左右。
　　3.栽培烟草原生质体转化和检测
　　使用PEG介导的转化方法转化烟草原生质体。我们发现Sigma公司生产的PEG4000最适合用于栽培烟草红花大金元的转化。同时，我们也发现小片段的质粒转化效率高于大片段的质粒，转化所需时间也低于大片段质粒。
　　4.烟草NtEIF4E和NtTOM3敲除载体构建和突变检测
　　由于实验室已建立成熟的CRISPR/CAS9基因敲除系统，我们成功的构建了红花大金元抗烟草花叶病毒相关基因NtTOM3和K326抗马铃薯Y病毒相关基因NtEIF4E的CRISPR/CAS9敲除载体9个，经检测，基因敲除呈阳性，并最终获得了转基因植株7株。NtEIF4E敲除植株中发现三个靶位点产生突变，三个靶位点检测的突变形式各有差异，靶位点1主要为增加一个碱基A，靶位点2主要为单个碱基的突变，靶位点3则主要为删除一个碱基G；NtTOM3敲除植株仅检测到一个靶位点产生突变，主要形式为碱基的删除，检测到的删除形式主要为在距离PAM前面6个碱基中删除一个至三个碱基，基因组编辑的比例约为12.5％。

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第一章文献综述

1.1植物原生质体的研究进展

1.2 植物原生质体遗传转化方法的研究概况

1.3 抗病相关基因的研究概况

1.4 基因编辑技术研究概况

第二章引言

2.1 研究背景及目的意义

2.2 研究内容

2.3 技术路线

第三章栽培烟草原生质体的分离和纯化

3.1 实验材料与试剂仪器

3.2 实验方法和步骤

3.3 结果和分析

3.4 讨论

第四章栽培烟草原生质体再生体系的构建

4.1 实验材料与试剂仪器

4.2 实验方法和步骤

4.3 结果和分析

4.4 讨论

第五章原生质体转化初探

5.1 实验材料与试剂仪器

5.2 实验方法和步骤

5.3 结果和分析

5.4 讨论

第六章烟草抗病相关基因NtEIF4E和NtTOM3的敲除和鉴定

6.1 实验材料

6.2实验方法与步骤

6.3 结果和分析

6.4 讨论

第七章综合与结论

展望

参考文献

致谢

在读期间发表论文及参研课题