生产复合氨基酸的地衣芽孢杆菌菌株及养殖用氨基酸液肥制备方法

摘要

一种生产复合氨基酸的地衣芽孢杆菌菌株及养殖用氨基酸液肥制备方法，利用诱变筛选得到的地衣芽孢杆菌菌种，在无碳源高浓度无机盐条件下常温厌氧得到复合氨基酸液，再复配铵盐和磷酸盐形成氨基酸液肥，按照每亩每米水深1－10公斤投放于对虾养殖水体，可以有效促进水体藻类生长，也适合其它需要复合氨基酸作为促长物质的场合。本发明和同类方法比较，本发明使用的原料价格低廉，来源方便，产品工艺简单，不需要大型发酵设备，大幅度减低成本，适合于大生产；产品不含任何不利于养殖水体及产品的成分，特别适合于对虾养殖。

说明书

技术领域

本发明属于一种生产复合氨基酸的地衣芽孢杆菌菌株及养殖用氨基酸液肥制备方法。

背景技术

氨基酸液肥生产的关键是制作大量的复合氨基酸。制作复合氨基酸有多种技术，一是化学方法水解生物资源，如利用强酸强碱对角质蛋白(毛发、羽毛、蹄角)、豆类、血粉、棉籽饼以及菜籽饼处理；二是利用发酵生产柠檬酸后的菌体；三是利用发酵方法生产氨基酸液肥。利用角质蛋白或工业发酵后废料水解，制作过程是利用高强度盐酸或硫酸分解蛋白质，处理过程中利用强酸强碱带来的环境问题，而且原料成本和设备不利于大规模生产服务于农业。已经有人研究通过好氧发酵产生复合氨基酸。如专利95119430：在酸处理角质蛋白加入产角蛋白酶米曲霉，使水溶蛋白转化为氨基酸，最后配入植物和人体必需的微量元素，可以生产对植物有促长作用营养剂。专利92110718培养生产一种或多种氨基酸的短杆菌属和棒状杆菌属菌株发酵制备氨基酸。专利94102211一种以酒厂生产下脚料酒糟为主要原料发酵制取氨基酸工艺。专利96109736是采用混合菌种制备含磷氨基酸液肥的制造方法。专利95197497是以微杆菌属的菌株产生有机酸和氨基酸的方法。上述的专利提出了有效的复合氨基酸生产的技术，制作为氨基酸液肥后可以使用在农业。农业氨基酸肥大部分用于叶面肥和经济价值高的作物，这些氨基酸液肥由于成本限制，不适合用于水产养殖的大面积水体。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产复合氨基酸的地衣芽孢杆菌菌株及养殖用氨基酸液肥制备方法，利用诱变筛选得到的地衣芽孢杆菌菌种，在无碳源高浓度无机盐条件下常温厌氧得到复合氨基酸液，再复配铵盐和磷酸盐形成氨基酸液肥，按照每亩每米水深1-10公斤投放于对虾养殖水体，可以有效促进水体藻类生长，也适合其它需要复合氨基酸作为促长物质的场合。

本发明诱变选育的地衣芽孢杆菌菌株，可以在4-6.5％碳酸氢铵、0.4-2％磷酸盐和无糖类、无脂肪酸和有机酸的条件下生长；在4-6.5％碳酸氢铵、0.4-2％磷酸盐和无糖类、无脂肪酸和有机酸以及厌氧、温度为25℃-35℃的条件下产生氨基酸并分泌到细胞外，不产生使培养液发臭的胺类物质。

本发明利用该地衣芽孢杆菌菌种生产氨基酸液肥的方法包括如下步骤：

(1)地衣芽孢杆菌菌种利用常规营养肉汤培养，调整pH7.0-8.0，在121℃灭菌25-30分钟，接种后在28℃-32℃、125转/分摇床培养24-48小时，培养物加20％甘油作为保存菌种，于-20℃保存，每半年转种一次。

(2)有氧发酵增加菌种量：取NH₄Cl0.5克-1克，NaCl0.3克-1克，K₂HPO₄0.5克-1克，KH₂PO₄0.1克-1克，MgSO₄·7H₂O0.1克-1克，CaCl₂0.1克-0.3克，酵母提取物0.1克-0.5克，羽毛蛋白粉5克-15克，水1000毫升，调pH7.4-8.0；扩大用量按照同等比例配制；按照常规灭菌，冷却后按1％接种菌种，在30℃-35℃有氧发酵24-48小时，得到培养液；羽毛蛋白粉2-2.5倍30％-40％盐酸混合，在121℃，蒸汽消毒器灭菌30-60分钟，或者油浴126℃隔油处理60-120分钟，用4molNaOH调pH7，得到处理羽毛粉；

(8)在培养液中加入2％-6.5％碳酸氢铵(W/V)，0.4-2％的灭菌磷酸二氢钾或过磷酸钙(W/V)，溶解并搅拌均匀，以10升-20升容器分装，密封后，在温度28℃-35℃放置5-10天，得复合氨基酸液；

(4)在得到的复合氨基酸液中加入7％-10％的碳酸氢铵和0.7％-2％磷酸二氢钾或过磷酸钙，得到氨基酸液肥，作为产品可以保存6个月。

本发明和同类方法比较，本发明使用的原料价格低廉，来源方便，产品工艺简单，不需要大型发酵设备，大幅度减低成本，适合于大生产；产品不含任何不利于养殖水体及产品的成分，特别适合于对虾养殖。

附图说明

图1是本发明高密度对虾养殖水体叶绿素变化图；

图2是本发明养殖水体温度变化图。

具体实施方式

本发明的菌种源于中国普通微生物菌种保藏管理中心(北京，菌种为地衣芽孢杆菌Bαcillus licheniforms(Weigmann)Chester，菌株编号1.813)，取回实验室后用95℃水浴处理40分钟，马上涂布于2216E海水平板培养基，经30℃、24小时培养后，挑选菌落，菌落特征为不规则形。再用常规制作的营养肉汤培养基(蛋白胨5克，牛肉膏3克，酵母膏1克，氯化钠5克，蒸馏水1000毫升，调整培养基pH7.4，常规灭菌)，在30℃，每分140转摇床培养24小时。同上温度处理，再用营养肉汤琼脂平板纯化菌种。挑选菌种，同上液体培养，培养液体加入20％甘油，保存于-20℃作为纯化菌种。

在湛江海洋大学水产病害研究室对采用的菌种进行了再确定，确定特征如下：细菌长杆状或纤维状，大小为1-10微米×0.3-0.8微米，运动，革兰氏阳性，好氧和兼性厌氧，产芽孢，芽孢为短杆状，单个，V-P测定阳性。利用丙酸盐、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖或甘露醇产酸、分解淀粉和明胶，在5℃和10℃不生长，在55℃有生长。根据上述生理化指标认为是Bαcilluslicheniforms。

诱变和选育：利用灭菌(0.15MP_a，25分钟，250毫升瓶装50毫升培养液)营养肉汤培养基，在30℃每分钟180转摇床培养该菌种28小时，取培养物再接种到营养肉汤琼脂上，在细菌对数期用无菌生理盐水洗下菌苔，加入无菌玻璃株分散菌苔，再以每分3000转离心，弃上清，沉淀物加入无菌生理盐水制作菌悬液，血球计数板计数，调整浓度为10⁸/毫升。取2-3ml置于无菌5厘米培养皿，放置于经过无菌处理的家用微波炉(2450MHZ，700瓦)的中部，去盖，照射10秒停止2秒，再照射10秒停止2秒，累积照射60秒-180秒。

取蛋白胨2克，酶母提取液0.1克，NaCl0.3克，K₂HPO₄0.5克，KHXPO₄0.1克，MgSO₄·7H₂O0.3克，CaCl₂0.1克，蒸馏水800毫升，调整pH7.4，以压力0.15MPa，15分钟灭菌。分别制作12份，每份分别再增加10克，15克，20克，25克，30克，35克，40克，45克，5克，55克，60克，65克碳酸氢铵。

其中每种浓度碳酸氢铵分别溶解于200毫升蒸馏水中，经过0.25微米孔径的膜滤除菌，加入到已灭菌的上述制作的冷却到室温的培养液中，得到碳酸氢铵的梯度选育培养基。每次照射后菌悬液涂布于碳酸氢铵的梯度选育培养基，在避光厌氧30℃条件下培养诱变菌种36-48小时。在对每次培育结果重复一次照射后，逐步提高选育培养基铵盐浓度，选择可以在40克碳酸氢铵以上梯度选育培养基中生长的地衣芽孢杆菌继续下面步骤。

再取蛋白胨2克，酶母提取液0.1克，NaCl0.3克，MgSO₄·7H₂O0.3克，CaCl₂0.1克，蒸馏水800毫升，分别制作5份，每份分别再增加4克，8克，12克，16克，20克磷酸盐(磷酸二氢钾或过磷酸钙)，得到磷酸盐的梯度选育培养基。调整pH7.4，以压力0.15MPa，15分钟灭菌。每一份再增加溶于200毫升蒸馏水中的45克同上膜滤除菌的碳酸氢铵，再接种选育的诱变菌种，接种量5％，静置3-7日，显微镜血球计数板测定细菌生物量和纸层析茚三酮染色测定上清液中氨基酸。

如果不增加氨氮和无机磷，静置厌氧发酵时，实验菌的数量增加少，角蛋白水解时间长，产生的氨基酸数量少，而且需要增加温度(如50℃)才能达到一定的分解速度。在本发明中，该菌在大于、等于4％氨盐存在下，细菌数量增加迅速，氨基酸等物质迅速增加，在常温下(28℃-30℃)第7天时可以达到14克/升。实验证明在这一过程中，由于培养基没有其它碳水化合物作为碳源，细菌强化了对角蛋白的分解，同时在这一铵盐和磷酸盐浓度下产生并分泌氨基酸。

用次氯酸钠-碘化钾法以及盐酸-乙醇滴定法测定胺，放弃产生胺使培养液发臭的菌株。通过以上诱变选育得到的菌株，在菌液中加入20％甘油，于-20℃保存。

菌种安全性实验：选育的菌种用营养肉汤培养，培养后利用显微镜检和稀释100倍计数，使菌液浓度为10⁹/毫升。以养殖缸中32升15‰洁净海水充气养殖6尾10厘米左右健康凡纳滨对虾，每组3个养殖缸，共3组。每日分别投放0.5毫升，1毫升，2毫升营养肉汤培养菌液，连续25日，每2日交换5-6升洁净海水。观察凡纳滨对虾的摄食、蜕皮、生长、活动均为正常。

氨基酸测定：由于培养物中氨氮的干扰，不能用常规测定氨基酸的方法测定其氨基酸，采用纸层析法进行常规半定量测定。新华层析滤纸28×28厘米，上样量10-20微升，展层液为正丁醇∶冰乙酸∶乙醇∶水＝4∶1∶1∶2(V/V)，显色剂为0.5％茚三酮丙酮溶液。洗脱液为75％乙醇和0.1％硫酸铜溶液(38∶2，V/V)。分别用不同的标准氨基酸(生化纯)制作各种氨基酸的标准曲线和斜率。层析结果按照斑点减下，洗脱，在OD520测定光吸收值。根据不同Rf值辨别氨基酸，采用不同斜率计算含量。

HPLC定量测定氨基酸：样品液经过高速离心机10000g离心，取上清液，0.25微米膜滤，经过预处理，用高效液相色谱仪测定上清液氨基酸。

用福林酚方法测定蛋白质含量。用磷钼蓝法测定磷的含量。可溶性糖用硫酸苯酚法检测。

氨基酸液肥的制作：

利用摇床和500毫升瓶进行种子培养。菌种培养基组成为蛋白胨5克，牛肉膏3克，酵母膏1克，NaCl5克，水1000毫升。调整pH7.4，在121℃，灭菌25-30分钟。接种后在28-32℃，125转/分摇床培养24-48小时。

配制生产培养基，可以采用以下两种培养基：

(1)羽毛粉用2-2.5倍30％-40％盐酸混合，在121℃，0.15MPa灭菌30-60分钟，或者油浴126℃隔油处理60-120分钟，用4molNaOH调pH7，得到处理羽毛粉；

取NH₄Cl0.5克-1克，NaCl0.3克-1克，K₂HPO₄0.5克-1克，KH₂PO₄0.1克-1克，MgSO₄·7H₂O0.1g，CaCl₂0.3克，酵母提取液0.1克-0.5克，羽毛蛋白粉5克-15克，水1000毫升，调pH7.4-8.0，扩大用量按照同等比例配制。

(2)NH₄Cl0.5克-1克，NaCl0.3克-1克，K₂HPO₄0.5克-1克，KH₂PO₄0.1克-1克，MgSO₄·7H₂O0.1-1克，CaCl₂0.1克-0.3克，酵母提取液0.1克-0.5克，羽毛蛋白粉5克-10克，蛋白胨3克-5克，水1000毫升，调pH7.4-8.0。扩大用量按照同等比例配制。

在100升发酵罐中，加入培养基成分和水，在121℃灭菌60分钟，冷却到30℃，接种菌种，接种量1-5％。在温度30℃-35℃有氧发酵24-36小时。

在上述培养液中加入2％-6.5％碳酸氢铵(W/V)，0.4％-2％的灭菌磷酸二氢钾或过磷酸钙(W/V)，充分搅拌，分装到10升容器中。加盖密封，在温度28℃-35℃或室温，或更高温度，放置5-10天，得到氨基酸液。产物有特定酯味，呈稠的流质态，黑色或黄褐色，pH值为8。

在得到的氨基酸液中加入7％-10％的碳酸氢铵和0.7％-2％磷酸二氢钾或过磷酸钙，得到氨基酸液肥，作为产品可以保存6个月。使用的磷酸二氢钾或过磷酸钙在121℃灭菌30分钟，碳酸氢铵要求选择质量良好，无其它杂质者，直接使用。

利用高效液相谱定量检查复合氨基酸液的氨基酸含量。

    氨基酸厌氧7天，毫克/毫升  氨基酸厌氧7天，毫克/毫升    asp    ghu    0.035    0.274    cys    val    0.732    1.427  ser  his  gly  thr  arg  ala  tyr    0.308    0.067    0.785    0.192    0.261    0.638    0.279    met    phe    ile    leu    lys    pro    6.327    0.462    0.423    0.805    0.425    1.008    总计  14.446

根据多个样品的分析met，val，pro总是较高量，gly，ser，leu，ala在多数情况下有较高量，phe，cys以及lys有中等量，arg和ile在少数情况下有一定量。其中his和asp的数量最少。

氨基酸液肥的安全性实验：以养殖缸中32升15‰洁净海水充气养殖6尾10厘米左右健康凡纳滨对虾，共3组，每组3个养殖缸。每日分别投放1毫升/升的制作的氨基酸液肥，连续25日，每2日交换5-6升洁净海水。凡纳滨对虾的摄食、蜕皮、生长、活动均为正常。

实验室培养微藻使用量：富营养要求浮游藻类如海水小球藻：1％(样品/水，V/V)；中度营养要求如：卵囊藻、骨条藻1‰(样品/水，V/V)；贫营养要求如部分硅藻：0.1‰。

对虾养殖水体使用：2-15ppm。泼洒。

产生的效果：测定氨基酸液肥对于藻类生长的作用

1、培养对虾饵料微藻和养殖水浮游微藻。

洁净海水煮沸后冷却，分别加入适量微藻，1克/升氨基酸液肥，另外用同样起始浓度的藻类加入无机盐培养液，作为对照。培养结果用血球计数板在显微镜下计数。

表1氨基酸液肥对小球藻的培养

海水小球藻数量×10⁶/毫升  起始 24小时   48小时   192小时   216小时   240小时氨基酸液肥无机盐培养液  0.61  0.61  5.68  5.40    7.90    6.13    20.92    14.80    37.20    16.80    55.12    19.24

小球藻无机盐培养液成分：NaNO₃80毫克，K₂HPO₄8毫克，FeC₆H₅O₇(1％溶液)0.2毫升，VB₁ 200微克，VB₁₂ 0.2微克，NaHCO₃0.5克。海水1000毫升。培养液体pH为7-8，培养温度25-28℃，光照为2000-8000LUX，盐度10。

表2氨基酸液肥对中肋骨条藻的培养

中肋骨条藻数量×10⁶/毫升  起始 24小时   48小时 192小时216小时  240小时氨基酸液肥无机盐培养液  23.41  23.41  38.9  32.4    76.4    44.2   245   106 288 102    321    88

中肋骨条藻无机盐培养液成分：KNO₃60毫克，Na₂HPO₄·12H₂O10毫克，Na₂SiO₃10毫克，海水1000毫升。培养液体pH为8.4，培养温度25-28℃，光照2000-8000LUX，盐度25。

表3氨基酸液肥对湛江等鞭金藻数量的培养

湛江等鞭金藻数量×10⁶/毫升起始  24小时  48小时  192小时  216小时  240小时氨基酸液肥无机盐培养液 15    56    34    98    68    548    344    680    276    732    198

湛江等鞭金藻无机盐培养液成分：NaNO₃30毫克，尿素15毫克，KH₂PO₄6毫克，FeC₆H₅O₇·5H₂O0.5毫克，硅酸钠1毫克，VB₁200微克，VB₁₂0.2微克，海水1000毫升。培养液体pH为8.4，培养温度25-28℃，光照2000-8000LUX，盐度25。

此外，本产品对卵囊藻、微绿球藻、螺旋藻、扁藻、杜氏盐藻有类似作用。

2、大面积使用状况

在湛江地区，4月水温26-27℃，日照充分。对虾养成期放苗前，每亩每米水深投放制作的氨基酸液肥2.5公斤，浮游植物在24小时后开始迅速增加，48小时使水色为浅绿色或淡茶色。72小时水体藻类达到104-105/毫升。投苗后，这种水色可以维持15-20日。

2001-2003年，在湛江遂溪下录对虾精养池使用了制作的氨基酸液肥，连续数年对虾养殖成功率近于100％，而同样虾苗的对照池成功率低于50％。在整个对虾养殖早中期，每15天-20天投放制作的氨基酸液肥一次，可以在整个养殖时期保持水色稳定。其优点有：1、在对虾养殖早期对水体投放无机营养盐时迅速增加氨氮或亚硝氮浓度，容易使虾苗产生病害，使用制作的氨基酸液肥避免了这一问题。2、能够在15天-20天内稳定水色，保持浮游藻类数量。3、由于制作的氨基酸液肥属于发酵物，投放后没有污染。用化学方法制作的氨基酸液肥投放到对虾养殖池，容易使水体变黑。2003年6月-9月，该对虾精养池放苗13-15万尾，早中期全部用制作的氨基酸液肥培养水色，前65天共使用4次，保持水色优良。养殖时间为70天-90天，收获对虾64-76尾/公斤，产量每亩11500-1250公斤，每亩每茬有利润12000左右。

2004年在湛江遂溪下录和湛江东海岛庵里对虾精养池使用制作的氨基酸液肥的实验结果良好，养殖得到成功。2004年7月东海岛庵里收获对虾每亩1250-1777公斤，大小为90尾/公斤。

2004年2月13日至2004年5月31日在湛江东海岛庵里对虾精养池实验使用制作的氨基酸液肥，除投饵外不再使用其它养殖用品和药品。养殖前，投放制作的氨基酸液肥，每次每亩2.5公斤，放苗以后3天强化一次，以后每15日投放一次，共投放10次。从图示可以看到，早期水温18-25℃，高密度养殖水体藻类叶绿素在10-20微克/升，变化平稳。在养殖中后期温度升高到25-30℃，叶绿素增加，在实验3#池(5亩面积)藻类叶绿素30-60微克/升，在实验2#池(5亩面积)藻类叶绿素35-70微克/升。整个养殖过程没有过浓的藻类突然死亡的“倒水”现象发生，保证了对虾生长环境的稳定，同时有力地抑制了水体病原菌的数量。

2004年2月13日至2004年5月31日实验池藻类叶绿素数量图，如图1、2所示。

2004年5月31日对实验池的水质指标进行测定，数据说明养殖的水质良好，数据如下：

实验2#池：pH为7.89，盐度15，活性磷0.222毫克/升，总磷0.981毫克/升，化学耗氧量22.36毫克/升，硝酸氮0.008毫克/升，亚硝酸氮0.021毫克/升，氨氮0.805毫克/升，碱度2.891，硫化氢小于0.01毫克/升。

蛋白型好氧自养菌33000个/毫升，厌氧自养菌15000个/毫升，弧菌1475个/毫升，发酵型细菌2000个/毫升，硝化细菌2000个/毫升，叶绿素44.65毫克/升。

实验3#池：pH为7.86，盐度13，活性磷0.210毫克/升，总磷1.2毫克/升，化学耗氧量29.19毫克/升，硝酸氮0.024毫克/升，亚硝酸氮0.074毫克/升，氨氮0.961毫克/升，碱度2.983，硫化氢小于0.01毫克/升。

蛋白型好氧自养菌10000个/毫升，厌氧自养菌10000个/毫升，弧菌1010个/毫升，发酵型细菌300个/毫升，硝化细菌2300个/毫升，叶绿素41.86毫克/升。