地衣芽孢杆菌噬菌体的侵染能力及抗性菌株的诱变筛选

摘要

地衣芽孢杆菌是饲料上常用的益生菌之一，在地衣芽孢杆菌发酵生产中噬菌体的感染现象非常普遍。本文对地衣芽孢杆菌噬菌体性状以及抗噬菌体菌株的诱变筛选进行了研究。得到如下结果：
　　 ⑴通过分离纯化，从地衣芽孢杆菌菌粉中得到2种噬菌体，命名为DB01和DB02，两种噬菌体对三株地衣芽孢杆菌YCB、ZCS、TC侵染能力弱，宿主专一性强。经纯化培养后噬菌体的浓度最高达109pfu/mL以上。
　　 ⑵研究了生产环境噬菌体的分布及杀灭方法。生产工厂的土壤、空气、尘埃中地衣芽孢杆菌噬菌体平均含量分别达到1.7×105pfu/g、2.9×103 pfu/g、6.0×104pfu/g，种类丰富。100℃湿热处理5min不能完全杀灭噬菌体;1.4％漂白粉在实验室可完全杀灭噬菌体，工厂使用2％漂白粉消毒，仍有极少量噬菌体存活。
　　 ⑶研究了噬菌体和温度对地衣芽孢杆菌的影响。菌体长得越好，噬菌体的数量越少。噬菌体污染严重时，菌数只能维持在50亿左右。北海从三月到到七月平均气温从19℃到34℃，平均气温28℃为临界点，高于临界点菌数可维持在100亿以上。
　　 ⑷研究了紫外线+亚甲基胍复合诱变条件。紫外线:20w紫外灯，距离40cm，照射3min，用报纸盖住存放11h，致死率在87％;亚甲基胍:20ug/mL，20min，致死率在98％，4℃冰箱冷藏一夜。诱变后得到地衣芽孢杆菌菌株抗性效价为3.75。
　　 ⑸根据抗性菌株易退化的特点，研究了噬菌体与抗性菌株共培养保持其抗性的方法。试验组采用103.25 pfu/mL噬菌体浓度对抗性菌株进行保藏及种子液扩大传代培养，然后在噬菌体共存下进行固体发酵，菌数达到440亿/g;对照组采用无噬菌体存在的抗性菌株保藏并进行传代培养，然后在有噬菌体存在的条件下进行固态培养，其菌数仅为48亿/g，表明在抗性菌株的保藏、活化及扩大培养过程中有噬菌体存在有利于保持其菌株抗性。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 噬菌体定义

1．2 噬菌体分类

1．2．1 烈性噬菌体和温和噬菌体

1．2．2 按照噬菌体的核酸类型分类

1．3 噬菌体侵染过程和细菌的噬菌体防御体系

1．3．1 噬菌体侵染细菌的过程

1．4 噬菌体的防御体系

1．4．1 常见的噬菌体防御体系

1．4．2 CASS-噬菌体的新防御体系

1．5 噬菌体对发酵工业危害

1．6 抗噬菌体污染的措施

1．6．1 预防措施

1．6．2 感染噬菌体后的处理办法

1．7 地衣芽孢杆菌应用

1．8 地衣芽孢杆菌的发酵工艺

1．8．1 地衣芽孢杆菌的固体发酵

1．8．2 地衣芽孢杆菌的液体发酵

1．9 抗噬菌体菌株筛选的研究进展

1．10 本研究的目的

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株和噬菌体

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 噬菌体的分离纯化及原液制备

2．2．2 噬菌体效价测定

2．2．3 互染实验

2．2．4 环境抽样检测：土壤、尘埃、积水和空气

2．2．5 杀灭环境中的噬菌体

2．2．6 噬菌体和温度对芽孢杆菌生长的影响的测定方法

2．2．7 地衣芽孢杆菌的亚甲基胍诱变育种方法

2．2．8 双层琼脂筛选法

2．2．9 复合诱变方法

2．2．10 梯度筛选培养基制作方法

2．2．11 测菌株的生长曲线方法

2．2．12 传代对比测试方法

2．2．13 生长能力的检测方法

3 结果与分析

3．1 地衣芽孢杆菌噬菌体分离纯化及性状研究

3．1．1 地衣芽孢杆菌噬菌体分离纯化

3．1．2 地衣芽孢杆菌噬菌体效价

3．1．3 地衣芽孢杆菌噬菌体生长水平

3．1．4 噬菌体对枯草芽孢杆菌的交叉感染能力

3．2 地衣芽孢杆菌各株系的噬菌体抗性

3．3 生产环境噬菌体检测结果

3．3．1 土壤中噬菌体分析

3．3．2 尘埃中噬菌体分析

3．3．3 积水中噬菌体分析

3．3．4 消毒前后噬菌体分析

3．4 噬菌体杀灭试验

3．4．1 水浴杀灭噬菌体

3．4．2 漂白粉对噬菌体的死灭效果

3．5 噬菌体和温度对芽孢杆菌生长的影响

3．5．1 地衣芽孢杆菌菌体与噬菌体的关系

3．5．2 地衣芽孢杆菌菌数与温度的关系

3．6 亚甲基胍诱变条件选择和诱变的结果

3．6．1 不同浓度亚甲基胍处理出发菌株

3．6．2 相同浓度亚甲基胍处理出发菌株不同时间

3．6．3 亚甲基胍单一因素诱变结果

3．7 复合诱变中紫外线照射的条件

3．8 复合诱变筛选的菌株

3．8．1 复合诱变实验结果

3．8．2 稳定性检测

3．8．3 诱变菌株的传代直径

3．9 抗性菌株效价的提高

3．9．1 抗性菌株的抗性

3．9．2 抗性菌株抗性提高后的抗性

3．10 抗性菌株遗传稳定性的提高和生产能力

3．10．1 菌株的生长曲线

3．10．2 菌株的传代对比

3．10．3 生长能力的测试结果

4 结论与讨论

4．1 噬菌体性状的研究

4．2 对多种噬菌体感染的菌株选用诱变方法

4．2．1 常用的诱变方法

4．2．2 选择诱变方法

4．3 工厂噬菌体污染

4．3．1 噬菌体污染途径

4．3．2 环境消毒和空气净化

4．4 筛选是诱变育种的关键

4．4．1 筛选方法的选择

4．4．2 遗传稳定性和生产能力

4．5 展望

参考文献

致谢