促甲状腺素受体的抗体及其用途

摘要

本发明提供了TSH受体的结合配偶体，该结合配偶体包含或源自人单克隆或重组抗体，或其一个或多个片段，所述抗体或片段与TSH受体反应；以及所述TSH受体的结合配偶体的用途、应用它的诊断和治疗方法和针对其的抗独特型抗体。

说明书

技术领域

本发明涉及促甲状腺素受体(TSH受体或TSHR)的结合配偶体(例如单克隆或重组抗体)及其用途。

背景技术

促甲状腺素或促甲状腺激素(TSH)是一种垂体激素，它在调节甲状腺的功能中起关键作用。它的释放被在下丘脑中形成的TRH激素(促甲状腺素释放激素)所刺激，且TSH控制重要的甲状腺激素甲状腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)的形成和释放。基于反馈机制，血清中的甲状腺激素含量控制TSH的释放。T3与T4通过甲状腺细胞的形成被TSH通过以下过程所刺激，在该过程中由垂体释放的TSH结合到甲状腺细胞膜的TSH受体上。

在突眼性甲状腺肿(一种常见的自身免疫病)中，形成了TSH受体抗体(TRAb)，并且这些自身抗体以模拟TSH的作用方式结合到TSH受体上，从而刺激甲状腺产生高水平的甲状腺激素。这些自身抗体据称具有刺激活性。在一些患者中，自身抗体与TSH受体结合但不刺激甲状腺激素的产生，并被描述为具有阻断活性(J Sanders，Y Oda，S-A Roberts，M Maruyama，J Furmaniak，B Rees Smith；“理解促甲状腺素受体的结构与功能间的相互关系(Understanding the thyrotrophin receptorfunction-structure relationship)”，Ballière’s Clinical Endocrinology andMetabolism；TF Davies编辑1997；11(3)：451～479；Ballière Tindall出版，伦敦)。

TSH受体抗体的测定在对突眼性甲状腺肿及其它甲状腺病症的诊断和控制中非常重要。目前使用三种类型的分析方法来测定TSH受体抗体：

(a)竞争性结合分析，它测定TSH受体抗体抑制TSH结合于TSH受体制备物的能力；

(b)生物分析，它测定TSH受体抗体刺激细胞在培养物中表达TSH受体的能力；和

(c)TSH受体制备物与TSH受体抗体的免疫沉淀。

用这样的分析方法测定TSH受体抗体在参考文献中已有描述：

J Sanders，Y Oda，S-A Roberts，M Maruyama，J Furmaniak，B ReesSmith；“理解促甲状腺素受体结构与功能间的相互关系”，Ballière’sClinical Endocrinology and Metabolism；TF Davies编辑1997；11(3)：451～479；Ballière Tindall出版，伦敦；

J Sanders，Y Oda，S Roberts，A Kiddie，T Richards，J Bolton，VMcGrath，S Walters，D Jaskólski，J Furmaniak，B Rees Smith；TSH受体自身抗体与¹²⁵I标记的TSH受体间的相互作用(The interaction of TSHreceptor autoantibodies with ¹²⁵I-labelled TSH receptor)；Journal of ClinicalEndocrinology and Metabolism；1999；84(10)：3797～3802。

多年以来一直认为源自患者淋巴细胞的TSH受体的人单克隆抗体，对于理解突眼性甲状腺肿的发病机理和发展新的测定TSH受体抗体的方法例如在竞争性结合测定中替代TSH，将成为有价值的制剂。并且因为患者的血清TSH受体抗体通常是有效的甲状腺刺激物(TSH激动剂)，所以当包含TSH受体的组织(如甲状腺组织或甲状腺癌组织)需要刺激的时候，刺激人单克隆TSH受体抗体对于体内应用将是有价值的。此外，由于一些患者的血清TSH受体抗体是有效的TSH拮抗物(阻断抗体)，所以当包含TSH受体的组织(如甲状腺组织或甲状腺癌组织)的活性需要失活或要使其对TSH、TSH受体抗体或其它刺激物无应答性的时候，作为TSH拮抗物的人单克隆TSH受体抗体对于体内应用将是有价值的。

也认为在这样的体外和/或体内应用中，人单克隆TSH受体抗体相对于TSH的一个主要优点将是抗体可被相对容易地操纵。例如，可对单克隆抗体的TSH受体结合区进行操纵来改变它们的特性，例如亲和力和生物学特性，包括它们的TSH激动剂或拮抗物活性程度。此外，单克隆抗体较TSH在体内的半衰期将长得多，这可以在某些体内应用中具有相当大的优势。此外，抗体的半衰期可以容易地被操纵，例如抗体Fab片段的半衰期较完整IgG的半衰期短得多。这些TSH受体抗体的一般特性在出版物中被描述，如B Rees Smith，SM Mclachlan，J Furmaniak，“促甲状腺素受体的自身抗体(Autoantibodies to the thyrotropin receptor)”，Endocrine Reviews 1988，9：106～121；B Rees Smith，KJ Dorrington，DSMunro，“长效甲状腺刺激物γG-球蛋白亚基的甲状腺刺激特性(Thethyroid stimulating properties of long-acting thyroid stimulator γG-globulinsubunits)”，Biochimica et Biophysica Acta 1969，192：277～285；KJDorrington，DS Munro，“长效甲状腺刺激物(The long acting thyroidstimulator)”；Clinical Pharmacology and Therapeutics 1966，7：788～806。

人单克隆TSH受体抗体更进一步的一个优势是它们在鉴定或提供新型的TSH受体抗体结合位点方面的用途。例如，通过产生针对结合TSH受体的人单克隆TSH受体抗体区的抗体。以这种方式产生的一些抗独特型抗体有可能作为新的配体用于TSH受体抗体、TSH和相关化合物的分析。此外它们可能是体内调节TSH受体抗体、TSH和相关化合物的作用的有效试剂。

用单克隆抗体来鉴定和提供新型的抗体结合位点的其它方法是熟知的。例如如下述文献所描述的那样，通过噬菌体展示的随机肽文库的抗体筛选的方法：JC Scott与GP Smith“用表位文库寻找多肽配体(Searchingfor peptide ligands with an epitope library)”，Science，1990，249(4967)：386～390和MA Myers、JM Davies、JC Tong、J Whisstock、M Scealy、IR MacKay、MJ Rowley，“通过多肽噬菌体展示和分子模建来鉴定的糖尿病自身抗原GAD₆₅上的构象性表位(Conformational epitopes on thediabetes autoantigen GAD₆₅ identified by peptide phage display andmolecular modelling)”，免疫学杂志(Journal of Immunology)，2000，165：3830～3838。也可进行非肽化合物和非肽化合物文库的抗体筛选。

用这些程序鉴定和提供的新型TSH受体抗体结合位点也可在TSH受体抗体、TSH及相关化合物的分析中，作为新的配体发挥作用。此外，它们可以是体内调节TSH受体抗体、TSH及相关化合物的作用的有效试剂。

考虑到人单克隆TSH受体抗体的潜在价值，多年来已付出大量努力来产生这样的抗体(参见，例如B Rees Smith，SM McLachlan，J Furmaniak，“促甲状腺素受体的自身抗体”，Endocrine Reviews 1988，9：106～121)。然而到目前为止，这些努力都是不成功的(参见，例如SM McLachlan，BRapoport，“TSH受体的人单克隆自身抗体—我们寻找的目标及为何我们要寻找它(Monoclonal，human autoantibodies to the TSH receptor-TheHoly Grail and why are we looking for it)”，临床内分泌学与代谢杂志(Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism)，1996，81：3152～3154和JHW van der Heijden，TWA de Bruin，KAFM Gludemans，J de Kruif，JP Banga，T Logtenberg，“半合成文库方法用于获得突眼性甲状腺肿的促甲状腺素受体的人单克隆自身抗体的局限性”(Limitations of thesemisynthetic library approach for obtaining human monoclonalautoantibodies to the thyrotropin receptor of graves’disease)，临床与试验免疫学(Clinical and Experimental Immunology)，1999，118：205～212)。

发明内容

本发明的一个目的是提供TSH受体的结合配偶体，它能够以与TSH受体自身抗体与TSH受体间的相互作用相当的方式与TSH受体发生相互作用，特别是本发明的目的是提供TSH受体的人单克隆抗体，它们之间所显示出的相互作用可以与存在于甲状腺机能亢进性突眼性甲状腺肿患者血清中的所见到的TSH受体抗体与TSH受体的相互作用相比拟；以及还提供了其重组体制备物。本文描述的发明中已克服了生产人单克隆TSH受体抗体的相当大的困难。尤其是描述了具有在甲状腺机能亢进性突眼性甲状腺肿患者血清中所发现的自身抗体的特性的人单克隆TSH受体抗体的成功生产。我们已生产的人TSH受体单克隆抗体(本文称为hMAb TSHR 1)以高亲和力结合到TSH受体上，通过这样的方式以致于少量的抗体抑制标记的TSH结合到TSH受体上，且少量可充当有效的甲状腺刺激物。抗体的Fab片段与重组体Fab制备物如同完整IgG一样，是类似的有效的甲状腺刺激物及标记的TSH结合的抑制剂。单克隆Fab和/或完整IgG可以用¹²⁵I或生物素标记，并显示其结合到TSH受体上。这样的结合被患者血清中的TSH受体自身抗体所抑制。

因此，本发明提供了一种TSH受体的结合配偶体，该结合配偶体包含或源自人单克隆或重组抗体或其一个或多个片段，所述抗体或片段与TSH受体反应。

特别地，本发明提供了一种TSH受体的结合配偶体，该结合配偶体包含或源自人单克隆抗体或其一个或多个片段，所述抗体或片段与TSH受体反应。

特别地，本发明提供了一种TSH受体的结合配偶体，该结合配偶体包含或源自人重组抗体或其一个或多个片段，所述抗体或片段与TSH受体反应。

特别地，本发明提供了一种人单克隆抗体或其一个或多个片段，所述抗体或片段与TSH受体反应。

特别地，本发明提供了一种人重组抗体或其一个或多个片段，所述抗体或片段与TSH受体反应。特别是本发明提供了与TSH受体反应的人重组抗体的一个或多个片段。

根据本发明的结合配偶体，尤其是根据本发明的与TSH受体反应的人单克隆或重组抗体，可以通过其抑制TSH结合到TSH受体上的能力和/或其刺激TSH受体的能力而被进一步地表征，已显示两者分别与得自突眼性甲状腺肿患者血清中所存在的TSH受体自身抗体的抑制和刺激特性相当。

更特别地，根据本发明的结合配偶体，尤其是根据本发明的人单克隆或重组抗体，可以通过对于TSH结合到TSH受体上的抑制活性来表征，所述抑制活性至少为国际标准NIBSC 90/672的约15个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约30个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约60个单位/mg，或更优选至少为国际标准NIBSC90/672的约120个单位/mg，或该单克隆或重组抗体的一个或多个片段。

更特别地，根据本发明的结合配偶体，尤其是根据本发明的人单克隆或重组抗体，可以进一步通过对于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性而进行表征，所述刺激活性至少为国际标准NIBSC 90/672的约30个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约60个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约120个单位/mg，或更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约240个单位/mg，或这样的单克隆或重组抗体的一个或多个片段。

在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的结合配偶体，尤其是根据本发明的人单克隆或重组抗体，可以通过以下来表征：

(i)对于TSH结合到TSH受体上的抑制活性，至少为国际标准NIBSC 90/672的约15个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672约的30个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约60个单位/mg，或更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约120个单位/mg；和

(ii)对于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性，至少为国际标准NIBSC 90/672的约30个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约60个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约120个单位/mg，或更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约240个单位/mg；

或该单克隆或重组抗体的一个或多个片段。

在根据本发明的结合配偶体包含或源自与TSH受体反应的单克隆或重组抗体的一个或多个片段，尤其是在例如与TSH受体反应的单克隆或重组抗体的一个或多个Fab片段的情况下，优选这样的结合配偶体可以用对于TSH结合到TSH受体上的抑制活性来表征，所述抑制活性至少为国际标准NIBSC 90/672的约30个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约60个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约120个单位/mg，或更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约240个单位/mg。

在根据本发明的结合配偶体包含或源自与TSH受体反应的单克隆或重组抗体的一个或多个片段，尤其是在例如与TSH受体反应的单克隆或重组抗体的一个或多个Fab片段的情况下，还优选该结合配偶体可以用对于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性来表征，所述刺激活性至少为国际标准NIBSC 90/672的约50个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约100个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC90/672的约200个单位/mg，或更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约400个单位/mg。

在根据本发明的结合配偶体包含或源自与TSH受体反应的单克隆或重组抗体的一个或多个片段，尤其是在例如与TSH受体反应的单克隆或重组抗体的一个或多个Fab片段的情况下，仍优选采用以下方式来表征该结合配偶体：

(i)对于TSH结合到TSH受体上的抑制活性，至少为国际标准NIBSC 90/672的约30个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约60个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约120个单位/mg，或更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约240个单位/mg；和

(ii)对于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性，至少为国际标准NIBSC 90/672的约50个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约100个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约200个单位/mg，或更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约400个单位/mg。

在一个优选方案中，本发明提供了一种TSH受体的结合配偶体(典型的是人单克隆抗体)，该结合配偶体优选能与TSH受体相结合从而刺激TSH受体，且它包含抗体V_H区，该抗体V_H区选自如SEQ ID NO.1所示的V_H区(重链可变区)，和包含一个或多个V_H CDR的V_H区，所述V_H CDR的氨基酸序列选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。

因此，在本发明的第一实施方案中，提供了一种TSH受体的结合配偶体(典型的是人单克隆抗体)，该结合配偶体优选能与TSH受体相结合从而刺激TSH受体，且它包含如SEQ ID NO.1所示的抗体V_H区。

因此，在本发明的第二实施方案中，提供了一种TSH受体的结合配偶体(典型的是人单克隆抗体)，该结合配偶体优选能与TSH受体相结合从而刺激TSH受体，且它包含抗体V_H区，该抗体V_H区含有一个或多个V_H CDR，该V_H CDR的氨基酸序列选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

可以理解根据本发明的结合配偶体可以基本上如前所述那样包含抗体V_H区，而不包含抗体V_L区(轻链可变区)。已知单免疫球蛋白区，尤其是V_H区，能以特殊的方式结合靶抗原。可选地，根据本发明的结合配偶体可以包含与抗体V_L区配对的抗体V_H区，以使用现有技术中熟知的的技术(Biochim.Biophys.Acta，192(1969)277～285；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第89卷，第10026～10030页，1992年11月)来提供抗体结合位点，该抗体结合位点包含针对TSH受体的V_H和V_L区。

然而在本发明的优选方案中，提供了一种TSH受体的结合配偶体，该结合配偶体优选能与TSH受体相结合从而刺激TSH受体，并且它包含：

抗体V_H区，选自由以下组成的组：

如SEQ ID NO.1所示的V_H区和含有一个或多个V_H CDR的V_H区，所述V_H CDR的氨基酸序列选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4；和/或

抗体V_L区，选自由以下组成的组：

如SEQ ID NO.6所示的V_L区和含有一个或多个V_L CDR的V_L区，所述V_L CDR的氨基酸序列选自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9。

根据本发明，优选基本上如前所述的结合配偶体包含与基本上如前所述的抗体V_L区配对的基本上如前所述的抗体V_H区，来提供同时含有针对TSH受体的V_H和V_L区的抗体结合位点，尽管当进一步讨论时，抗体V_H区或抗体V_L区可能是独立地用于结合TSH受体。因此，可以理解，基本上如前所述的结合配偶体可包含基本上如前所述的抗体V_H区而不包含抗体V_L区。因此，还可理解，基本上如前所述的结合配偶体可包含基本上如前所述的抗体V_L区而不包含抗体V_H区。可选地，基本上如前所述的结合配偶体可以包含与基本上如前所述的抗体V_L区配对的抗体V_H区，来提供同时含有针对TSH受体的V_H和V_L区的抗体结合位点。

因此，根据本发明的优选实施方案可包括基本上如前所述的结合配偶体，该结合配偶体包含如SEQ ID NO.1所示的抗体V_H区，该抗体V_H区与SEQ ID NO.6所示的V_L区配对，来提供同时包含针对TSH受体的V_H和V_L区的抗体结合位点。

根据本发明进一步设想，基本上如前所述的V_H区可以与除文中特别提到的V_L区以外的V_L区配对。也可以根据本发明进一步地设想，基本上如前所述的V_L区可以与除文中特别提到的V_H区以外的V_H区配对。

根据本发明的另一个实施方案，提供了TSH受体的基本上如前所述的结合配偶体，该结合配偶体能结合到TSH受体上从而刺激TSH受体，且它可包含：

抗体V_H区，该抗体V_H区包含：

含有一个或多个V_H CDR的V_H区，所述V_H CDR的氨基酸序列选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；和/或抗体V_L区，该抗体V_L区包含：

含有一个或多个V_L CDR的V_L区，该V_L CDR的氨基酸序列选自SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9。

上述的一个或多个CDR可获自前述的V_H和V_L区并可被插入到合适的阅读框内。例如，基本上如前所述的一个或多个CDR的氨基酸序列可以被插入到与文中特别揭示的hMAb TSHR 1不同的抗体的阅读框区域内，这些抗体因此插入了一个或多个CDR并能结合到TSH受体上，优选基本上如前所述来刺激TSH受体。可选地，本发明可以提供能与TSH受体结合的多肽，从而基本上如前所述来刺激TSH受体；并且所述多肽包含文中特别揭示的一个或多个CDR所表示的氨基酸以及任选地连同另外的氨基酸的一级结构构象，这些另外的氨基酸可以加强文中所述的一个或多个CDR对TSH受体的结合亲和力或可以基本上不影响多肽对TSH受体的结合特性。

本发明还包括文中所述的特异性人单克隆抗体、V_H区、CDR和文中所揭示的多肽的变异体、类似物、衍生物和片段，该变异体，类似物、衍生物和片段基本上如前所述保留了与TSH受体发生相互作用的能力(例如刺激TSH受体)。

文中所用术语“变异体”、“类似物”、“衍生物”和“片段”可以被表征为抗体、抗体片段或多肽，它们基本上保留了与具有如SEQ ID NO.1所示的V_H区和如SEQ ID NO.6所示的V_L区的人单克隆抗体相同的生活学功能和活性，尤其是其对于TSH受体的结合特性。适宜地，文中所述的变异体、类似物、衍生物和片段，及所述片段的变异体、类似物和衍生物具有氨基酸的一级结构构象，其中具有如SEQ ID NO.1所示的V_H区和如SEQ ID NO.6所示的V_L区的人单克隆抗体的许多或几个氨基酸残基(例如5～10、1～5或1～3)被取代，缺失或添加，或它们的任意组合。在这些中优选沉默取代、添加和缺失，它们不改变或者基本上不改变具有如SEQ ID NO.1所示的V_H区和如SEQ ID NO.6所示的V_L区的人单克隆抗体的生物学活性或功能。可优选保守性取代，这在下文中有更详细的介绍。

更为特别地，根据本发明的具有如SEQ ID NO.1所示的V_H区和如SEQ ID NO.6所示的V_L区的人单克隆抗体的变异体、类似物、衍生物可以是那些其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)所取代的变异体、类似物、衍生物，或那些其中一个或多个氨基酸残基包含取代基或其类似物的变异体、类似物、衍生物。这样的变异体、类似物，衍生物据认为是在本领域技术人员通过本文的教导所能获知的范围内。

最典型地，变异体、类似物、衍生物是通过保守氨基酸取代而不同于具有如SEQ ID NO.1所示的V_H区和如SEQ ID NO.6所示的V_L区的基准人单克隆抗体的变异体、类似物、衍生物。这样的取代是用另外的具有类似特性的氨基酸取代给定的氨基酸。在以下氨基酸中进行相互的替换被视为典型的保守取代：在脂肪族氨基酸A(丙氨酸)、V(缬氨酸)、L(亮氨酸)和I(异亮氨酸)中；在羟基残基S(丝氨酸)和T(苏氨酸)中；在酸性残基D(天冬氨酸)和E(谷氨酸)中；在酰胺残基N(天冬酰胺)和Q(谷氨酰胺)中；在碱性残基K(赖氨酸)和R(精氨酸)中；及在芳香族残基F(苯丙氨酸)和Y(酪氨酸)中。

应意识到，文中所用术语“片段”尤其涉及文中特别所述的抗体片段，并形成本发明的一个重要方面。这样，如本发明所提供的人单克隆或重组抗体可以作为以下任意片段而被提供：(i)由V_L、V_H、C_L和C_H1区组成的Fab片段；(ii)由V_H和C_H1区组成的Fd片段；(iii)由V_L和V_H区组成的Fv片段；(iv)由V_H区组成的dAb(域抗体)片段；(v)独立的CDR区；(vi)F(ab′)₂片段，其为含有两个连接的Fab片段的二价片段；和(vii)单链Fv分子(scFv)，其中V_H区和V_L区通过连接肽连接起来，这使得这两个区联合起来形成抗原结合位点。

可选地，根据本发明的人单克隆或重组抗体可以包含完整的IgG抗体，由此抗体包括可变区和恒定区。

本发明还提供了能与TSH受体结合的另外的结合配偶体，它能与TSH受体的基本上如上所述的结合配偶体(典型地是人单克隆抗体)竞争性地结合到TSH受体上，所述另外的结合配偶体不包含TSH。优选地，该另外的结合配偶体可以包含另外的具有针对TSH受体表位区的结合位点的抗体，且它能与基本上如上所述的TSH受体的结合配偶体(典型地是人单克隆抗体)竞争性地结合到TSH受体上。合适的所述另外的结合配偶体可以包含鼠单克隆抗体，优选它可基本上由实施例中所述的技术生产出来，所述技术通过本领域中已知的技术用TSH受体对鼠进行免疫。

本发明还可以提供能结合到TSH受体上的另外的结合配偶体，它可以包含或源自与TSH受体反应的人单克隆或重组抗体或其一个或多个片段。尤其是，该另外的结合配偶体可以包含另外的具有针对TSH受体表位区的结合位点的抗体，该另外的抗体能与TSH受体相结合，且它可与TSH受体的基本上如上所述的结合配偶体(典型地是人单克隆抗体)竞争性地结合到TSH受体上。合适的所述另外的结合配偶体可以通过合适的诱变技术，如点突变或类似技术，源自如文中所述的特异性结合配偶体hMAb TSHR 1，来获得TSH受体的另外的结合配偶体，它可以与如上所述的结合配偶体(例如hMAb TSHR 1)竞争性地与TSH受体相互作用。

优选地，TSH受体的另外的结合配偶体可以包含单克隆或重组抗体，且能用对于TSH结合到TSH受体上的抑制活性来表征，所述抑制活性至少为国际标准NIBSC 90/672的约15个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约30个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约60个单位/mg，或更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约120个单位/mg，或抗体的一个或多个片段。还优选本发明的另外的结合配偶体，也可以通过对于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性来表征，所述刺激活性至少为国际标准NIBSC 90/672的约30个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约60个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约120个单位/mg，或更优选至少为国际标准NIBSC90/672的约240个单位/mg，或抗体的一个或多个片段。

更优选本发明的所述的另外的结合配偶体可以通过以下来表征：

(i)对于TSH结合到TSH受体上的抑制活性，至少为国际标准NIBSC 90/672的约15个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约30个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约60个单位/mg，或更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约120个单位/mg；和

(ii)对于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性，至少为国际标准NIBSC 90/672的约30个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约60个单位/mg，更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约120个单位/mg，或更优选至少为国际标准NIBSC 90/672的约240个单位/mg；

或其一个或多个片段。

提供根据本发明的另外的结合配偶体的优选的鼠单克隆抗体包含在实施例进一步制备的9D33，9D33具有如图9～12和序列19～38所示的氨基酸和多核苷酸序列。因此根据本发明，提供了TSH受体的另外的结合配偶体(典型地是鼠单克隆抗体)，它包含如SEQ ID NO.19所示的抗体V_H区。

本发明所提供的另外的结合配偶体也可以被表征为包含抗体V_H区，所述抗体V_H区含有一个或多个V_H CDR，所述V_H CDR的氨基酸序列选自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21或SEQ ID NO.22。

应意识到，根据本发明的另外的结合配偶体可以包含基本上如前所述的抗体V_H区而不含有抗体V_L区。已知单免疫球蛋白区，尤其是V_H区，能以特殊的方式结合靶抗原。可选地，根据本发明的另外的结合配偶体采用现有技术中公知的技术(Biochim.Biophys.Acta，192(1969)277～285；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第89卷，10026～10030，1992年11月)可以包含与抗体V_L区配对的抗体V_H区，来提供同时包含针对TSH受体的V_H和V_L区的抗体结合位点。

然而在本发明的优选方案中，还提供了TSH受体的另外的结合配偶体，该另外的结合配偶体包含：

抗体V_H区，该抗体V_H区选自由以下组成的组：

如SEQ ID NO.19所示的V_H区和含有一个或多个V_H CDR的V_H区，所述V_H CDR的氨基酸序列选自SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.21或SEQ ID NO.22；和/或

抗体V_L区，该抗体V_L区选自由以下组成的组：

如SEQ ID NO.24所示的V_L区和含有一个或多个V_L CDR的V_L区，所述V_L CDR的氨基酸序列选自SEQ ID NO.25、SEQ IDNO.26或SEQ ID NO.27。

根据本发明，优选基本上如前所述的另外的结合配偶体包含与基本上如前所述的抗体V_L区配对的基本上如前所述的抗体V_H区，来提供同时含有针对TSH受体的V_H和V_L区的抗体结合位点，尽管如进一步讨论的那样，抗体V_H区或抗体V_L区，可以独立地用于结合TSH受体。因此，应意识到，基本上如前所述的另外的结合配偶体可以包含基本上如前所述的抗体V_H区而不包含抗体V_L区。因此，还应意识到，基本上如前所述的另外的结合配偶体可以包含基本上如前所述的抗体V_L区而不包含抗体V_H区。可选地，基本上如前所述的另外的结合配偶体可以包含与基本上如上所述的抗体V_L区配对的抗体V_H区，来提供同时含有针对TSH受体的V_H和V_L区的抗体结合位点。

因此根据本发明的优选实施方案可以包括基本上如前所述的另外的结合配偶体，该结合配偶体包含与SEQ ID NO.24所示的抗体V_L区配对的如SEQ ID NO.19所示的抗体V_H区，来提供同时包含针对TSH受体的V_H和V_L区的抗体结合位点。

根据本发明进一步设想，基本上如前所述的V_H区可以与除文中特别提到的V_L区以外的V_L区配对。也可以根据本发明进一步地设想，基本上如前所述的V_L区可以与除文中特别提到的V_H区以外的V_H区配对。

根据本发明的另一个实施方案，提供了TSH受体的基本上如前所述的另外的结合配偶体，该另外的结合配偶体能结合到TSH受体上从而抑制对TSH受体的刺激，且它可包含：

抗体V_H区，该抗体V_H区包含：

含有一个或多个V_H CDR的V_H区，所述V_H CDR的氨基酸序列选自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22；和/或抗体V_L区，该抗体V_L区包含：

含有一个或多个V_L CDR的V_L区，所述V_L CDR的氨基酸序列选自SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27。

上述的一个或多个CDR可获自前述的V_H和V_L区并被插入到合适的阅读框内。例如，基本上如前所述的一个或多个CDR的氨基酸序列可以被插入到与文中特别揭示的9D33不同的抗体的阅读框区域内，这些抗体因此插入了一个或多个CDR并能结合到TSH受体上。可选地，本发明可以提供能与TSH受体结合的多肽，其包含如本发明特别揭示的一个或多个CDR所表示的氨基酸以及任选地连同另外的氨基酸的一级结构构象，所述另外的氨基酸可以加强文中所述的一个或多个CDR对TSH受体的结合亲和力或可以基本不影响多肽对TSH受体的结合特性。

应意识到，此处所用术语“片段”尤其涉及文中特别所述的抗体的片段，并形成本发明的一个重要方面。这样，根据本发明的另外的结合配偶体可以作为以下任意片段来提供：(i)由V_L、V_H、C_L和C_H1区组成的Fab片段；(ii)由V_H和C_H1区组成的Fd片段；(iii)由V_L和V_H区组成的Fv片段；(iv)由V_H区组成的dAb片段；(v)独立的CDR区；(vi)F(ab′)₂片段，其为含有两个连接的Fab片段的二价片段；和(vii)单链Fv分子(scFv)，其中V_H区和V_L区通过连接肽连接起来，这使得这两个区联合起来形成抗原结合位点。

可选地，根据本发明的鼠单克隆或重组抗体，例如9D33，可以包含整个IgG抗体，由此抗体包括可变区和恒定区。

本发明还提供了多核苷酸，该多核苷酸包含：

(i)如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列，其编码如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQID NO.9所示的抗体V_H区、V_L区或CDR的氨基酸序列；

(ii)编码TSH受体的基本上如前所述的结合配偶体(典型地是人单克隆抗体)，或编码TSH受体的基本上如前所述的结合配偶体(典型地是人单克隆抗体)的抗体V_H区、V_L区或CDR的氨基酸序列的核苷酸序列；

(iii)由于遗传密码的简并性而编码序列与(i)中任意序列不同的核苷酸序列；

(iv)包含(i)中任意序列的等位突变的核苷酸序列；

(v)包含(i)、(ii)、(iii)或(iv)中任意序列的片段的核苷酸序列，尤其是包含(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)中任意序列的片段并编码基本上如前所述的人单克隆抗体的Fab片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、独立的CDR区、F(ab′)₂片段或scFv片段的核苷酸序列；

(vi)由于核苷酸碱基的突变、缺失或取代而不同于(i)中任意序列并编码TSH受体的基本上如前所述的结合配偶体(典型地是人单克隆抗体)，或编码TSH受体的基本上如前所述的结合配偶体(典型地是人单克隆抗体)的抗体V_H区、V_L区或CDR的氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明还提供了多核苷酸，该多核苷酸包含：

(i)如SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.37所示的核苷酸序列，其编码如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26或SEQ ID NO.27所示的抗体V_H区、V_L区或CDR的氨基酸序列；

(ii)编码基本上如前所述的TSH受体的另外的结合配偶体(典型地是鼠单克隆抗体)，或编码基本上如前所述的TSH受体的另外的结合配偶体(典型地是鼠单克隆抗体)的抗体V_H区、V_L区或CDR的氨基酸序列的核苷酸序列；

(iii)由于遗传密码的简并性而编码序列不同于(i)中任意序列的核苷酸序列；

(iv)包含(i)中任意序列的等位突变的核苷酸序列；

(v)包含(i)、(ii)、(iii)或(iv)中任意序列的片段的核苷酸序列，尤其是包含(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)中任意序列的片段并编码基本上如前所述的鼠单克隆抗体的Fab片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、独立的CDR区、F(ab′)₂片段或scFv片段的核苷酸序列；

(vi)由于核苷酸碱基的突变、缺失或取代而与(i)中任意序列不同并编码TSH受体的基本上如前所述的另外的结合配偶体(典型地是鼠单克隆抗体)，或编码TSH受体的基本上如前所述的另外的结合配偶体(典型地是鼠单克隆抗体)的抗体V_H区、V_L区或CDR的氨基酸序列的核苷酸序列。

根据本发明的变异体多核苷酸，在其全长内与相应的(i)中任意多核苷酸序列适合有至少70％的同一性，最优选的是在其全长内包含与(i)中任意多核苷酸序列具有至少80％同一性的区域的多核苷酸，尤其优选的是在其全长内与(i)中任意多核苷酸序列有至少90％同一性的多核苷酸，在这些特别优选的多核苷酸中，格外优选那些具有至少95％同一性的多核苷酸。

本发明还提供了具有生物学功能的载体系统，它携带有基本上如前所述的多核苷酸，且它能将多核苷酸引入宿主微生物的基因组中。

本发明还涉及用本发明的多核苷酸转化的宿主细胞，及通过重组技术生产本发明的TSH受体的结合配偶体。宿主细胞可进行遗传工程改造而插入多核苷酸并表达本发明的TSH受体的结合配偶体。

hMAb TSHR 1的氨基酸序列，hMAb TSHR 1为本发明的人单克隆抗体；及编码hMAb TSHR 1的氨基酸序列的核苷酸序列；9D33的氨基酸序列，9D33为鼠单克隆抗体，它代表本发明的另外的结合配偶体；及编码9D33的氨基酸序列的核苷酸序列；均显示于下述的序列表中并可按以下分配。

序列描述和附图说明

对于hMAb TSHR 1：

氨基酸序列

SEQ ID NO.1          V_H

SEQ ID NO.2          V_H CDRI

SEQ ID NO.3          V_H CDRII

SEQ ID NO.4          V_H CDRIII

SEQ ID NO.5          重链可变区和相邻恒定区

SEQ ID NO.6          V_L

SEQ ID NO.7          V_L CDRI

SEQ ID NO.8        V_L CDRII

SEQ ID NO.9        V_L CDRIII

核苷酸序列

SEQ ID NO.10       V_H

SEQ ID NO.11       V_H CDRI

SEQ ID NO.12       V_H CDRII

SEQ ID NO.13       V_H CDRIII

SEQ ID NO.14       重链可变区和相邻恒定区

SEQ ID NO.15       V_L

SEQ ID NO.16       V_L CDRI

SEQ ID NO.17       V_L CDRII

SEQ ID NO.18       V_L CDRIII

对于9D33：

氨基酸序列

SEQ ID NO.19       V_H

SEQ ID NO.20       V_H CDRI

SEQ ID NO.21       V_H CDRII

SEQ ID NO.22       V_H CDRIII

SEQ ID NO.23       重链可变区和相邻恒定区

SEQ ID NO.24       V_L

SEQ ID NO.25       V_L CDRI

SEQ ID NO.26       V_L CDRII

SEQ ID NO.27       V_L CDRIII

SEQ ID NO.28       轻链可变区和相邻恒定区

核苷酸序列

SEQ ID NO.29       V_H

SEQ ID NO.30       V_H CDRI

SEQ ID NO.31       V_H CDRII

SEQ ID NO.32       V_H CDRIII

SEQ ID NO.33       重链可变区和相邻恒定区

SEQ ID NO.34       V_L

SEQ ID NO.35       V_L CDRI

SEQ ID NO.36       V_L CDRII

SEQ ID NO.37       V_L CDRIII

SEQ ID NO.38       轻链可变区和相邻恒定区

图1显示了hMAb TSHR1 IgG和Fab对标记的TSH结合到TSHR包被的试管上的抑制；对照IgG为GAD₆₅的人单克隆自身抗体；

图2显示hMAb TSHR1 IgG和Fab、猪TSH(70个单位/mg；pTSH)、重组人TSH(6.7个单位/mg；hTSH)和对照单克隆抗体((MAb：甲状腺过氧化物酶的人单克隆自身抗体(2G4))的甲状腺刺激活性；基底＝只在不含NaCl的Hanks缓冲盐溶液存在下产生的cAMP；

图3显示淋巴细胞供体血清对TSH结合到TSHR上的抑制的影响和对TSHR转染的CHO细胞中的环腺苷酸的刺激的影响。在结合抑制测定中，将血清在健康献血者血清池中稀释；对于刺激测定，将血清在不含NaCl的Hanks缓冲盐溶液中稀释；健康献血者血清(n＝3)给出的应答范围为1.1×基底～1.3×基底；

图3a表示对根据本发明的TSHR自身抗体的ELISA与以前的测定进行比较；尤其是基于TSH-生物素的ELISA，如J Bolton、J Sanders、YOda、C Chapman、R Konno、J Furmaniak、B Rees Smith所述，“通过ELISA测定甲状腺刺激激素受体自身抗体”，临床化学，1999，第45卷，第2285～2287页；和原始RIA，如K Southgate、FM Creagh、M Teece、C Kingswood、B Rees Smith所述“用于测定未提取的血清中的TSH受体抗体的受体测定(A receptor assay for the measurement of TSH receptor antibodies inunextracted serum)”，1984，临床内分泌学(Clinical Endocrinology)，第20卷，第539～543页；

图3b表示对根据本发明的TSHR自身抗体的ELISA与基于TSH-生物素的ELISA进行比较，所述基于TSH-生物素的ELISA如J Bolton、JSanders、Y Oda、C Chapman、R Konno、J Furmaniak、B Rees Smith所述，“通过ELISA测定甲状腺刺激激素受体自身抗体”，临床化学，1999，第45卷，第2285～2287页；比较了来自72位突眼性甲状腺肿患者的血清；y＝1.1154×-13.032，r＝0.99；

参考图4、5、6和7，也可以看出上述hMAb TSHR1的序列，其中：

图4显示了hMAb TSHR1重链的核苷酸序列，以及相邻的恒定区，其中

图4a给出了核苷酸序列本身；

图4b给出了标注了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恒定区的核苷酸序列；

图5显示了hMAb TSHR1重链的氨基酸序列，以及相邻的恒定区，其中

图5a给出了氨基酸序列本身；

图5b给出了标注了CDRI、CDRII、CDRIII和恒定区的氨基酸序列；

图6显示了hMAb TSHR1轻链的核苷酸序列，其中

图6a显示了核苷酸序列本身；

图6b给出了标注了PCR引物、CDRI、CDRII和CDRIII区的核苷酸序列；

图7显示了hMAb TSHR1轻链的氨基酸序列，其中

图7a给出了氨基酸序列本身；

图7b给出了标注了CDRI、CDRII、CDRIII区的氨基酸序列。

从以上可以意识到，对于hMAb TSHR1的V_H链，如图4b所示的CDRI、CDRII和CDRIII区的核苷酸序列分别相应于SEQ ID NO.11、12和13所示的V_H CDRI、V_H CDRII和V_H CDRIII序列；如图5b所示的CDRI，CDRII和CDRIII区的氨基酸序列分别相应于SEQ ID NO.2、3和4所示的V_H CDRI，V_H CDRII和V_H CDRIII序列。从以上还可以意识到，对于hMAb TSHR1的V_L链，如图6b所示的CDRI、CDRII和CDRIII区的核苷酸序列分别相应于SEQ ID NO.16、17和18所示的V_L CDRI、V_L CDRII和V_L CDRIII序列；如图7b所示的CDRI、CDRII和CDRIII区的氨基酸序列分别相应于SEQ ID NO.7、8和9所示的V_L CDRI、V_L CDRII和V_L CDRIII序列。

分析hMAb TSHR1 Fab的晶体结构(通过本领域的现有技术测定)使得用简并的PCR引物测定的HC和LC核苷酸序列能够被改进。具体地，鉴定了核苷酸115～120的HC测序人工产物。测序显示为cacgtg(转录成氨基酸His Val)，但是晶体结构更可靠地显示为氨基酸Gln Leu(相应的碱基为cagctg)，改进序列如附图和序列表所示。晶体结构分析还使得尤其是在简并PCR引物区域中的HC和LC衍生氨基酸序列能被改进。当通过RT-PCR发现LC aa 2为Pro的情况下，而从晶体结构发现为Thr。当通过RT-PCR发现HC aa 2为Met的情况在，而从晶体结构发现为Val。此外，这些改进的序列由附图和序列表所示。

上述9D33序列还可参见图9、10、11和12，其中：

图9表示9D33的重链核苷酸序列，以及相邻的恒定区，其中

图9a给出了核苷酸序列本身；

图9b给出了标注了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恒定区的核苷酸序列；

图10显示了9D33重链的氨基酸序列，以及相邻的恒定区，其中

图10a给出了氨基酸序列本身；

图10b给出了标注了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恒定区的氨基酸序列；

图11显示了9D33轻链的核苷酸序列，其中

图11a给出了核苷酸序列本身；

图11b给出了注释了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恒定区的核苷酸序列；

图12表示9D33轻链的氨基酸序列，其中

图12a给出了氨基酸序列本身；

图12b给出了注释了PCR引物、CDRI、CDRII、CDRIII和恒定区的氨基酸序列。

从以上可以意识到，对于9D33的V_H链，如图9b所示的CDRI、CDRII和CDRIII区的核苷酸序列分别相应于SEQ ID NO.30、31和32所示的V_H CDRI、V_H CDRII和V_H CDRIII序列；如图10b所示的CDRI、CDRII和CDRIII区的氨基酸序列分别相应于SEQ ID NO.20、21和22所示的V_H CDRI、V_H CDRII和V_H CDRIII序列。从以上还可以意识到，对于9D33的V_L链，如图11b所示的CDRI、CDRII和CDRIII区的核苷酸序列分别相应于SEQ ID NO.35、36和37所示的V_L CDRI、V_L CDRII和V_L CDRIII序列；图12b所示的CDRI、CDRII和CDRIII区的氨基酸序列分别相应于SEQ ID NO.25、26和27所示的V_L CDRI、V_L CDRII和V_L CDRIII序列。

本发明还提供了一种方法，该方法提供基本上如前所述的TSH受体的人单克隆抗体，该方法包括：

(i)由受试者提供淋巴细胞源，关于对TSH结合到TSH受体上的抑制，该受试者具有大于约0.04个NIBSC 90/672单位/mL血清的TSH受体抗体活性；

(ii)从所述(i)的淋巴细胞源分离淋巴细胞；

(iii)无限增殖所分离的淋巴细胞；和

(iv)克隆该无限增殖的淋巴细胞，从而产生无限增殖化克隆，该无限增殖化克隆分泌基本上如前所述的TSH受体的人单克隆抗体。

可选地，可将提供基本上如前所述的TSH受体的人单克隆抗体的方法定义为包括以下步骤的方法：

(i)由受试者提供淋巴细胞源，关于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性，该受试者具有大于约0.1个NIBSC 90/672单位/mL血清的TSH受体抗体活性；

(ii)从所述(i)的淋巴细胞源分离淋巴细胞；

(iii)无限增殖所分离的淋巴细胞；和

(iv)克隆该无限增殖的淋巴细胞，从而产生无限增殖化克隆，该无限增殖化克隆分泌基本上如前所述的TSH受体的人单克隆抗体。

优选根据本发明的方法包括从外周血、甲状腺组织、脾脏组织、淋巴结或骨髓，最典型地是从外周血分离淋巴细胞。典型地，用于根据本发明的方法的淋巴细胞源可以进一步地表征为：其得自这样的受试者，该受试者的血清TSH受体抗体水平关于TSH结合到TSH受体上的抑制，为高于约0.1个NIBSC 90/672单位/mL；或更典型地关于TSH结合到TSH受体上的抑制，为高于约0.2个NIBSC 90/672单位/mL；或关于TSH结合到TSH受体上的抑制，更典型地为高于约0.3个NIBSC 90/672单位/mL；优选关于TSH结合到TSH受体上的抑制，处于约0.3～0.5个NIBSC90/672单位/mL的范围或更大。可选地或此外，用于根据本发明的方法的淋巴细胞源可以典型地进一步地表征为：其得自这样的受试者，该受试者的血清TSH受体抗体水平关于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性，为高于约0.2个NIBSC 90/672单位/mL；或更典型地关于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性，为高于约0.5个NIBSC90/672单位/mL；优选关于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性，处于约0.5～1.0个NIBSC 90/672单位/mL的范围或更大。从上述可意识到，从其中分离淋巴细胞的受试者的对TSH受体的免疫反应优选应处于高活性阶段。

优选根据本发明的方法包括用EB病毒感染所分离的淋巴细胞，和适当地将这样无限增殖化的淋巴细胞与鼠/人细胞系融合。适当地，根据本发明的方法还包括例如在分析系统中通过对¹²⁵ITSH结合到TSH受体上的抑制，筛选所得到的TSH受体抗体克隆，该系统具有至少约1个NIBSC 90/672单位/L的灵敏度。

本发明还提供了制备TSH受体的人重组抗体或其一个或多个片段的方法，该方法包括通过基本上如前所述的方法克隆和表达如本发明提供的TSH受体的人单克隆抗体，或由其衍生的一个或多个片段。

本发明还提供了获自基本上如前所述的方法的TSH受体的人单克隆或重组抗体。优选这样获得的本发明的TSH受体的人单克隆或重组抗体，可用对于TSH结合到TSH受体上的抑制活性来表征，所述抑制活性至少为约15个国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约30个国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约60个国际标准NIBSC90/672单位/mg，或更优选至少为约120个国际标准NIBSC 90/672单位/mg，或这样的人单克隆或重组抗体的一个或多个片段。

更特别地，优选根据本发明的这样的人单克隆或重组抗体，可用对于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性来进一步表征，所述刺激活性至少为约30个国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约60个国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约120个国际标准NIBSC 90/672单位/mg，或更优选至少为约240个国际标准NIBSC 90/672单位/mg，或这样的人单克隆或重组抗体的一个或多个片段。

在本发明的一个优选实施例中，根据本发明的这样的人单克隆或重组抗体，可以通过以下来表征：

(i)对于TSH结合到TSH受体上的抑制活性，至少为约15个国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约30个国际标准NIBSC90/672单位/mg，更优选至少为约60国际标准NIBSC 90/672单位/mg，或更优选至少为约120国际标准NIBSC 90/672单位/mg；和

(ii)对于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性，至少为约30国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约60国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约120国际标准NIBSC 90/672单位/mg，或更优选至少为约240国际标准NIBSC 90/672单位/mg；

或这样的人单克隆或重组抗体的一个或多个片段。

还优选本发明的这样获得的人单克隆或重组抗体的一个或多个片段，尤其例如其一个或多个Fab片段，可以用对于TSH结合到TSH受体上的抑制活性来表征，所述抑制活性至少为约30国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约60国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约120国际标准NIBSC 90/672单位/mg，或更优选至少为约240国际标准NIBSC 90/672单位/mg。还优选这样的一个或多个片段可用对于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性表征，所述刺激活性至少为约50国际标准NIBSC 90/672单位/mg，或更优选至少为约100国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为200单位国际标准NIBSC90/672约/mg，或更优选至少为约400国际标准NIBSC 90/672单位/mg。

更优选，这样的一个或多个Fab片段可由以下来表征：

(i)对于TSH结合到TSH受体上的抑制活性，至少为约30国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约60国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约120国际标准NIBSC 90/672单位/mg，或更优选至少为约240国际标准NIBSC 90/672单位/mg；和

(ii)对于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性，至少为约50国际标准NIBSC 90/672单位/mg，或更优选至少为约100国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约200国际标准NIBSC 90/672单位/mg，或更优选至少为约400国际标准NIBSC 90/672单位/mg。

基本上如前所述的方法可以进一步包括另外的步骤，借此可将所获得的人单克隆或重组抗体经由合适的进一步的操作技术(如适当的诱变技术，例如点突变或类似技术)，来进一步获得TSH受体的另外的结合偶联物，所述偶联物能与基本上如文中所述的结合配偶体(例如hMAbTSHR 1)竞争性地与TSH受体发生相互作用。这样的进一步的操作技术是本领域的普通技术人员所熟知的。本发明进一步提供了通过这样的进一步操作技术所获得的TSH受体的另外的结合配偶体。

优选这样的另外的TSH受体的结合配偶体可以包含单克隆或重组抗体，且可用对于TSH结合到TSH受体上的抑制活性来表征，所述抑制活性至少为约15国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约30国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约60国际标准NIBSC90/672单位/mg，或更优选至少为约120国际标准NIBSC 90/672单位/mg，或其一个或多个片段。也还可以优选本发明的这样的另外的结合配偶体可用对于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性来表征，所述刺激活性至少为约30国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约60国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约120国际标准NIBSC90/672单位/mg，或更优选至少为约240国际标准NIBSC 90/672单位/mg，或其一个或多个片段。

还更优选本发明的这样的另外的结合配偶体，可通过以下来表征：

(i)对于TSH结合到TSH受体上的抑制活性，至少为约15国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约30国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约60国际标准NIBSC 90/672单位/mg，或更优选至少为约120国际标准NIBSC 90/672单位/mg；和

(ii)对于表达TSH受体的细胞的cAMP生产的刺激活性，至少为约30国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约60国际标准NIBSC 90/672单位/mg，更优选至少为约120国际标准NIBSC 90/672单位/mg，或甚至更优选至少为约240国际标准NIBSC 90/672单位/mg；

或其一个或多个片段。

根据本发明的TSH受体的结合配偶体(典型的是人单克隆或重组抗体)可以用于诊断或治疗。

相应地，根据本发明的TSH受体的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)可被应用于筛选方法中来检测患者血清中的TSH受体的自身抗体，也可被应用于诊断方法中。这样，根据本发明的TSH受体的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)可被用于替代或补充至今所描述的竞争剂以用于筛选方法中来检测TSH受体的自身抗体，也可被用于诊断方法中。相似地，根据本发明的TSH受体的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)可被用于替代或补充至今所描述的竞争剂以用于试剂盒中来用以检测TSH受体的自身抗体。

因此，本发明还提供了一种在获自受试者的体液样品中筛选TSH受体的自身抗体的方法，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，所述方法包括：

(a)提供来自所述受试者的所述体液样品；

(b)提供一对或多对结合分子，其中所述结合对的第一分子包含根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)，所述结合对的第二分子包含结合区，该结合区与所述结合配偶体或另外的结合配偶体相互作用；

(c)将所述样品与所述一对或多对结合分子接触，以允许所述结合对的所述第二分子与以下相互作用：(i)存在于所述样品中的TSH受体的自身抗体，或(ii)TSH受体的的所述结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)；和

(d)监测所述结合对的所述第二分子与存在于所述样品中的所述自身抗体的相互作用，从而提供在所述样品中存在所述TSH受体的自身抗体的指示。

本发明的用于检测上述自身抗体的方法在灵敏性水平上尤其有利，所述灵敏性水平可以通过使用该方法来实现。这可以参考实施例和附图得以进一步说明，其中附图3a表示基于hMAb TSHR1-生物素的TSH自身抗体的检测与以前的检测之间的比较曲线图。根据国际标准NIBSC90/672的可检测浓度，基于hMAb TSHR1-生物素的检测的灵敏度明显优异。这在对72个突眼性甲状腺肿患者血清的研究中被确认，如图3b所示。

因此，本发明还进一步提供了在获自受试者的体液样品中筛选TSH受体的自身抗体的方法，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，所述方法包括：

(a)提供来自所述受试者的所述体液样品；

(b)提供一对或多对结合分子，其中所述结合对的第一分子包含根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)，所述结合对的第二分子包含结合区，该结合区与所述结合配偶体或另外的结合配偶体相互作用；其中所述结合分子的相互作用为所述样品中的自身抗体滴度基本上相当于国际标准NIBSC 90/672的0.4U/L。

(c)将所述样品与所述一对或多对结合分子接触，以允许所述结合对的所述第二分子与以下相互作用：(i)存在于所述样品中的TSH受体的自身抗体，或(ii)本发明的TSH受体的所述结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)；和

(d)监测所述结合对的所述第二分子与存在于所述样品中的所述自身抗体的相互作用，从而提供在所述样品中存在所述TSH受体的自身抗体的指示。

上述灵敏度还可以根据本发明检测方法或试剂盒获得，所述检测方法和试剂盒使用TSH受体的人或非人多克隆抗体、TSH或其一个或多个变异体、类似物、衍生物或片段，或对TSH受体的亲和力为10¹⁰/摩尔或更大的TSH受体的结合配偶体，这些通常显示出对TSH受体足够的亲和力以便提供规定的灵敏度的方法或试剂盒。这样的多克隆抗体、TSH或其一个或多个变异体、类似物、衍生物或片段在本领域中已熟知。例如，TSH的超活性类似物在自然(Nature)，生物技术(Biotechnology)，第14卷，1995年10月，第1257～1263页有描述，尽管该文章没有像本发明现在所提供的一样披露这样的超活性TSH在方法或试剂盒中的用途。

因此，本发明还进一步提供了在获自受试者的体液样品中筛选TSH受体的自身抗体的方法，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，所述方法包括：

(a)提供来自所述受试者的所述体液样品；

(b)提供一对或多对结合分子，其中所述结合对的第一分子包含TSH受体的人或非人多克隆抗体，所述结合对的第二分子包含结合区，该结合区与所述多克隆抗体相互作用，其中所述结合分子的相互作用是使在所述样品中可检测到的自身抗体的滴度基本上相当于国际标准NIBSC 90/672的0.4U/L；

(c)将所述样品与所述一对或多对结合分子接触，以允许所述结合对的所述第二分子与以下相互作用：(i)存在于所述样品中的TSH受体的自身抗体，或(ii)所述多克隆抗体；和

(d)监测所述结合对的所述第二分子与存在于所述样品中的所述自身抗体的相互作用，从而提供在所述样品中存在所述TSH受体的自身抗体的指示。

本发明还进一步提供了在获自受试者的体液样品中筛选TSH受体的自身抗体的方法，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，所述方法包括：

(a)提供来自所述受试者的所述体液样品；

(b)提供一对或多对结合分子，其中所述结合对的第一分子包含TSH或其一个或多个变异体、类似物、衍生物或片段，所述结合对的第二分子包含结合区，该结合区与所述TSH或其一个或多个变异体、类似物、衍生物或片段相互作用，其中所述结合分子的相互作用是使在所述样品中可检测到的自身抗体的滴度基本上相当于国际标准NIBSC 90/672的0.4U/L；

(c)将所述样品与所述一对或多对结合分子接触，以允许所述结合对的所述第二分子与以下相互作用：(i)存在于所述样品中的TSH受体的自身抗体，或(ii)所述TSH或其一个或多个变异体、类似物、衍生物或片段；和

(d)监测所述结合对的所述第二分子与存在于所述样品中的所述自身抗体的相互作用，从而提供在所述样品中存在所述TSH受体的自身抗体的指示。

本发明还进一步提供了在获自受试者的体液样品中筛选TSH受体的自身抗体的方法，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，所述方法包括：

(a)提供来自所述受试者的所述体液样品；

(b)提供一对或多对结合分子，其中所述结合对的第一分子包含对TSH受体的亲和力为10¹⁰/摩尔或更大的TSH受体的结合配偶体，所述结合对的第二分子包含结合区，该结合区与所述结合配偶体相互作用，其中所述结合分子的相互作用是使在所述样品中可检测到的自身抗体的滴度基本上相当于国际标准NIBSC 90/672的0.4U/L；

(c)将所述样品与所述一对或多对结合分子接触，以允许所述结合对的所述第二分子与以下相互作用：(i)存在于所述样品中的TSH受体的自身抗体，或(ii)所述TSH的结合配偶体；和

(d)监测所述结合对的所述第二分子与存在于所述样品中的所述自身抗体的相互作用，从而提供在所述样品中存在所述TSH受体的自身抗体的指示。

本发明还提供了根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)的用途，以用于在获自受试者的体液样品中检测TSH受体的自身抗体，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，其中所述结合配偶体或另外的结合配偶体与TSH受体间的相互作用是使在所述样品中可检测到的自身抗体的滴度基本上相当于国际标准NIBSC 90/672的0.4U/L。

本发明还提供了TSH受体的人或非人多克隆抗体的用途，以用于在获自受试者的体液样品中检测TSH受体的自身抗体，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，其中所述多克隆抗体与TSH受体间的相互作用是使在所述样品中可检测到的自身抗体的滴度基本上相当于国际标准NIBSC 90/672的0.4U/L。

本发明还提供了TSH或其一个或多个变异体、类似物、衍生物或片段的用途，以用于在获自受试者的体液样品中检测TSH受体的自身抗体，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，其中所述TSH或其一个或多个变异体、类似物、衍生物或片段与TSH受体间的相互作用是使在所述样品中可检测到的自身抗体的滴度基本上相当于国际标准NIBSC 90/672的0.4U/L。

本发明还更提供了对TSH受体的亲和力为10¹⁰/摩尔或更大的TSH受体的结合配偶体的用途，以用于在获自受试者的体液样品中检测TSH受体的自身抗体，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，其中所述结合配偶体与TSH受体间相互作用是使在所述样品中可检测到的自身抗体的滴度基本上相当于国际标准NIBSC 90/672的0.4U/L。

可以意识到，一个或多个结合对的结合分子可以是抗原-抗体(例如，[TSH受体或表位]-[单克隆或重组TSH受体抗体])、抗独特型抗体-单克隆或重组TSH受体抗体、或新TSH受体抗体结合成员-单克隆或重组TSH受体抗体。优选该结合对的结合分子是抗原-抗体，也就是，[TSH受体或其一个或多个表位]-[单克隆或重组TSH受体抗体]，其中表位可以是“独立式”或存在于大量的支架多肽或其类似物中。

优选地，本发明提供一种在获自受试者的体液样品中筛选TSH受体的自身抗体的方法，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，所述方法包括：

(a)提供来自所述受试者的所述体液样品；

(b)将所述样品与以下接触：(i)全长TSH受体，或其一个或多个表位，或含有一个或多个TSH受体表位的多肽，和(ii)根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)，所述接触在允许TSH受体与针对TSH受体进行应答而产生的自身抗体相互作用的条件下，以允许所述TSH受体或其所述一个或多个表位或所述多肽，与存在于所述样品中的TSH受体的自身抗体或所述TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)相互作用；和

(c)监测所述TSH受体，或其所述一个或多个表位或所述多肽与存在于所述样品中的所述的自身抗体的相互作用，从而提供在所述样品中存在所述TSH受体的自身抗体的指示。

在一些实施方案中，根据本发明的方法也可以使用一种或多种竞争剂，该竞争剂与以下两类物质之间的相互作用发生竞争，其中一类物质为多克隆抗体、TSH或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段、或如本发明提供的具体方法实施方案中基本上如上所述的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体；另一类物质为结合对的第二分子、或TSH受体、或其一个或多个表位或该多肽。这样的竞争剂可以包含TSH、或与该TSH受体反应的一个或多个单克隆，例如与TSH受体反应的鼠单克隆。

优选地，上面提及的根据本发明的方法，进一步包括为根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是单克隆或重组抗体)和上述适当的一种或多种竞争剂提供标记方法，合适的标记方法包括酶标记、同位素标记、化学发光标记、荧光标记、染色或类似方法。

本发明还提供了一种试剂盒，以用于在获自受试者的体液样品中筛选TSH受体的自身抗体，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，所述试剂盒包含：

(a)一对或多对结合分子，其中所述结合对的第一分子包含根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)，所述结合对的第二分子包含结合区，该结合区与所述结合配偶体或另外的结合配偶体相互作用；

(b)用于将来自所述受试者的所述体液样品与所述一对或多对结合分子接触的单元，从而允许所述结合对的所述第二分子与以下相互作用：(i)存在于所述样品中的TSH受体的自身抗体，或(ii)TSH受体的所述结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)；和

(c)监测所述结合对的所述第二分子与存在于所述样品中的所述自身抗体的相互作用的单元，从而提供在所述样品中存在所述TSH受体的自身抗体的指示。

本发明还提供了一种试剂盒，以用于在获自受试者的体液样品中筛选TSH受体的自身抗体，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，所述试剂盒包含：

(a)一对或多对结合分子，其中所述结合对的第一分子包含根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)，所述结合对的第二分子包含结合区，该结合区与所述结合配偶体或另外的结合配偶体相互作用，其中所述结合分子的相互作用是使在所述样品中可检测到的自身抗体的滴度基本上相当于国际标准NIBSC 90/672的0.4U/L；

(b)用于将来自所述受试者的所述体液样品与所述一对或多对结合分子接触的单元，从而允许所述结合对的所述第二分子与以下相互作用：(i)存在于所述样品中的TSH受体的自身抗体，或(ii)根据本发明的所述TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)；和

(c)监测所述结合对的所述第二分子与存在于所述样品中的所述自身抗体的相互作用的单元，从而提供在所述样品中存在所述TSH受体的自身抗体的指示。

本发明还提供了一种试剂盒，以用于在获自受试者的体液样品中筛选TSH受体的自身抗体，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，所述试剂盒包含：

(a)一对或多对结合分子，其中所述结合对的第一分子包含TSH受体的人或非人多克隆抗体，所述结合对的第二分子包含结合区，该结合区与所述多克隆抗体相互作用，其中所述结合分子的相互作用是使在所述样品中可检测到的自身抗体的滴度基本上相当于国际标准NIBSC90/672的0.4U/L；

(b)用于将来自所述受试者的所述体液样品与所述一对或多对结合分子接触的单元，从而允许所述结合对的所述第二分子与以下相互作用：(i)存在于所述样品中的TSH受体的自身抗体，或(ii)所述多克隆抗体；和

(c)监测所述结合对的所述第二分子与存在于所述样品中的所述自身抗体的相互作用的单元，从而提供在所述样品中存在所述TSH受体的自身抗体的指示。

本发明还提供了一种试剂盒，以用于在获自受试者的体液样品中筛选TSH受体的自身抗体，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，所述试剂盒包含：

(a)一对或多对结合分子，其中所述结合对的第一分子包含TSH或其一种或多种变异体、类似物、衍生物或片段，所述结合对的第二分子包含结合区，该结合区与所述TSH或其一个或多个变异体、类似物、衍生物或片段相互作用，其中所述结合分子的相互作用是使在所述样品中可检测到的自身抗体的滴度基本上相当于国际标准NIBSC 90/672的0.4U/L；

(b)用于将来自所述受试者的所述体液样品与所述一对或多对结合分子接触的单元，以允许所述结合对的所述第二分子与以下相互作用：(i)存在于所述样品中的TSH受体的自身抗体，或(ii)TSH或其一个或多个变异体、类似物、衍生物或片段；和

(c)监测所述结合对的所述第二分子与存在于所述样品中的所述自身抗体的相互作用的单元，从而提供在所述样品中存在所述TSH受体的自身抗体的指示。

本发明还提供了一种试剂盒，以用于在获自受试者的体液样品中筛选TSH受体的自身抗体，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，所述试剂盒包含：

(a)一对或多对结合分子，其中所述结合对的第一分子包含对TSH受体的亲和力为10¹⁰/摩尔或更大的TSH受体的结合配偶体，所述结合对的第二分子包含结合区，该结合区与所述结合配偶体相互作用，其中所述结合分子的相互作用是使在所述样品中可检测到的自身抗体的滴度基本上相当于国际标准NIBSC 90/672的0.4U/L；

(b)用于将来自所述受试者的所述体液样品与所述一对或多对结合分子接触的单元，以允许所述结合对的所述第二分子与以下相互作用：(i)存在于所述样品中的TSH受体的自身抗体，或(ii)所述TSH受体的结合配偶体；和

(c)监测所述结合对的所述第二分子与存在于所述样品中的所述自身抗体的相互作用的单元，从而提供在所述样品中存在所述TSH受体的自身抗体的指示。

可意识到，一个或多个结合对的结合分子可以是抗原-抗体(例如，[TSH受体或表位]-[单克隆或重组TSH受体抗体])，抗独特型抗体-单克隆或重组TSH受体抗体，或新TSH受体抗体结合成员-单克隆或重组TSH受体抗体。优选该结合对的结合分子是抗原-抗体，也就是，[TSH受体或其一个或多个表位]-[单克隆或重组TSH受体抗体]，其中表位可以是“独立式”或存在于大量的支架多肽或其类似物中。

本发明优选提供一种在获自受试者的体液样品中筛选TSH受体的自身抗体的试剂盒，所述受试者被怀疑患有、易感、具有或恢复自与对于TSH受体的免疫反应相关的自体免疫疾病，所述试剂盒包含：

(a)全长TSH受体，或其一个或多个表位，或含有一个或多个TSH受体表位的多肽；

(b)根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地人单克隆或重组抗体)；

(c)用于将来自所述受试者的所述体液样品、所述TSH受体或所述其一个或多个表位或所述多肽，与所述TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)接触的单元，所述接触在允许TSH受体与针对TSH受体的应答而产生的自身抗体相互作用的条件下，以允许所述TSH受体或其所述一个或多个表位或所述多肽，与存在于所述样品中的TSH受体的自身抗体，或TSH受体的所述结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)的相互作用；和

(d)监测所述TSH受体或其所述一个或多个表位或所述多肽与存在于所述样品中的所述的自身抗体的相互作用的单元，从而提供在所述样品中存在所述TSH受体的自身抗体的指示。

在一些实施方案中，根据本发明的试剂盒可以进一步包含一种或多种竞争剂，该竞争剂在两类物质的相互作用发生竞争，所述一类物质为分别如上所述的多克隆抗体、TSH或其一种或多种突变体、类似物、衍生物或片段、或TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体，另一类物质为结合对的第二分子、或TSH受体、或其一个或多个表位或该多肽。这样的竞争剂可以包含TSH，或与TSH受体反应的一个或多个单克隆，例如与TSH受体反应的鼠单克隆。

适当地，上面提及的根据本发明的试剂盒还包含根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)的标记单元，其中合适的一种或多种竞争剂如上所述，恰当的标记方法基本上如前所述。

在存在TSH受体的自身抗体的情形下，在如前述的一种方法或试剂盒中，TSH受体与TSH受体的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)的结合将会降低。

根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)还可以被用于基本上如前所述的关于TSH和相关配基的检测方法和试剂盒中。

因此，本发明还提供了一种检测TSH和相关配基的方法，所述方法包括：

(a)提供被怀疑含有或含有TSH或相关配基的样品；

(b)提供一对或多对结合分子，其中所述结合对的第一分子含有根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)，所述结合对的第二分子含有结合区，该结合区与所述结合配偶体或另外的结合配偶体相互作用；

(c)将所述样品与所述一对或多对结合分子接触，以允许所述结合对的所述第二分子与以下相互作用：(i)存在于所述样品中的TSH或相关配基，或(ii)所述TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)；和

(d)监测所述结合对的所述第二分子与存在于所述样品中的TSH或相关配基的相互作用，从而提供在所述样品中存在TSH或相关配基的指示。

本发明还提供了一种用于测定TSH或相关配基的试剂盒，所述试剂盒包含：

(a)一对或多对结合分子，其中所述结合对的第一分子含有根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)，所述结合对的第二分子含有结合区，该结合区与所述结合配偶体或另外的结合配偶体相互作用；

(b)用于将被怀疑含有或含有TSH或相关配基的样品与所述一对或多对结合分子接触的单元，以允许所述结合对的所述第二分子与以下相互作用：(i)存在于所述样品中的TSH或相关配基，或(ii)所述TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)；和

(c)检测所述结合对的所述第二分子与存在于所述样品中的TSH或相关配基的相互作用的单元，从而提供在所述样品中存在TSH或相关配基的指示。

本发明还进一步提供了一种鉴定TSH受体的另外的结合配偶体的方法，该TSH受体的另外的结合配偶体能结合到TSH受体上并与基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体竞争性地结合到TSH受体上，该另外的结合配偶体不包含TSH，该方法包括：

(a)提供一对或多对结合分子，其中所述结合对的第一分子含有基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体，所述结合对的第二分子含有结合区，该结合区与所述结合配偶体相互作用；

(b)提供待测定的另外的结合分子，该结合分子作为TSH受体的潜在的另外的结合配偶体，所述结合分子与(a)的所述结合对的第一分子竞争性地结合到TSH受体上；

(c)将(b)的所述另外的结合分子与(a)的所述的一对或多对结合分子接触，从而允许(a)的所述结合对的所述第二分子与以下相互作用：(i)(b)的所述另外的结合分子，或(ii)(a)的所述结合对的所述第一分子；和

(d)监测(a)的所述结合对的所述第二分子与(b)的所述另外的结合分子的相互作用，从而评估(b)的所述另外的结合分子是否与(a)的所述结合对的所述第一分子竞争性结合到TSH受体上。

本发明还提供一种鉴定TSH受体的另外的结合配偶体的试剂盒，该另外的结合配偶体能结合到TSH受体上并与基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体竞争性地结合到TSH受体上，该另外的结合配偶体不包含TSH，该试剂盒包含：

(a)一对或多对结合分子，其中所述结合对的第一分子含有基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体，所述结合对的第二分子含有结合区，该结合区与所述结合配偶体相互作用；

(b)用于将(a)的所述一对或多对结合分子与待测定的另外的结合分子接触的单元，所述另外的结合分子用作TSH受体的潜在的另外的结合配偶体，其与(a)的所述结合对的所述第一分子竞争性地结合到TSH受体上，以允许(a)的所述结合对的所述第二分子与以下相互作用：(i)所述的另外的结合分子，或(ii)(a)的所述结合对的所述第一分子；和

(c)监测(a)的所述结合对的所述第二分子与所述另外的结合分子的相互作用的单元，从而评估所述另外的结合分子是否与(a)的所述结合对的所述第一分子竞争性地结合到TSH受体上。

根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)的进一步的应用是用于鉴定和提供新类型的TSH受体的抗体结合位点。因此，本发明还进一步提供了一种鉴定TSH受体的一个或多个表位区的方法，该方法包括将基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)与全长TSH受体或其一个或多个片段接触，以使所述TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体与所述全长TSH受体或所述其一个或多个片段相互作用，并鉴定与所述结合配偶体或另外的结合配偶体相互作用的所述全长TSH受体或所述其一个或多个片段的氨基酸。适当地，对结合配偶体或另外的结合配偶体与TSH受体的选择片段和全长TSH受体之间的相互作用进行分析，以鉴定与结合配偶体相互作用的TSH受体的氨基酸。

此外，本发明允许针对本发明的单克隆TSH受体抗体的结合TSH受体区域的抗体的产生。以这种方式产生的这样的抗独特型抗体可作为潜在的新配基用于测定TSH受体自身抗体、TSH和相关化合物。同样它们也可以是有效的用于调节TSH受体自身抗体、TSH和相关化合物的作用的体内试剂。因此，本发明还进一步提供了针对基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)的结合区而产生的一种或多种抗独特型抗体，其制备方法在实施例中进行进一步的描述。

其它用单克隆抗体来鉴定和提供新类型的抗体结合位点的方法是已知的。例如，采用如下述文献所描述的噬菌体展示的随机肽文库的抗体筛选，JC Scott和GP Smith“用表位文库寻找肽配基”，Science，1990，249(4967)：386～390和MA Myers，JM Davies，JC Tong，J Whisstock，M Scealy，IR MacKay，MJ Rowley，“通过肽噬菌体展示和分子模建鉴定的糖尿病自身抗原GAD₆₅上的构象性表位”(Conformational epitopes onthe diabetes autoantigen GAD₆₅ identified by peptide phage display andmolecular modelling)，免疫学杂志(Journal of Immunology)，2000，165：3830～3838。也可进行非肽化合物和非肽化合物文库的抗体筛选。

用这些方法鉴定和提供的新类型的TSH受体的抗体结合位点还可以在TSH受体自身抗体、TSH和相关化合物的测定中用作有用的新配基。此外，它们还可以是用于调节TSH受体自身抗体、TSH和相关化合物的作用的有效的体内试剂。

基本上如前所述的根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)也被可效地用于治疗中。因此，本发明还进一步提供了治疗方法，该治疗方法包括施用基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)、包含基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)的药物组合物(同时含有一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)；以及还涉及基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)在制备药物或组合物中的用途。

TSH受体的结合配偶体，尤其是获自患者淋巴细胞的根据本发明的TSH受体的人单克隆抗体，对于理解突眼性甲状腺肿疾病的发病机理和发展测定TSH受体自身抗体的新方法是有价值的试剂，例如基本上如前所述那样，在竞争性结合实验中用作TSH的替代物。同样，当含有TSH受体的组织(例如甲状腺组织或甲状腺癌组织)需要刺激时，根据本发明的刺激性结合配偶体具有体内应用价值。因此，本发明提供了一种用于刺激甲状腺组织和/或含有TSH受体的组织的药物或组合物。尤其是，根据本发明的TSH受体的刺激性结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)可用于肿瘤学，尤其是用于甲状腺癌的诊断、控制和治疗。

可替换地，根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体可以是有效的TSH或自身抗体的拮抗剂(阻断性抗体)且当含有TSH受体的组织(例如甲状腺组织或甲状腺癌组织)的活性需要失活或需要使其对TSH、TSH受体自身抗体或其他刺激物没有反应性的时候，根据本发明的这样的阻断性TSH受体抗体对体内应用很有价值。

本发明还提供了基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体，以及一种或多种另外的试剂的组合，所述另外的试剂使含有TSH受体的组织对TSH、TSH受体自身抗体或其他刺激物失活或不具有反应性。典型地，该一种或多种另外的试剂独立于TSH受体而发生作用。

一种特别的治疗性应用，是在于治疗与对TSH受体的自体免疫相关的眼眶后组织(retro orbital tissue of eye)疾病，其中TSH受体自身抗体结合需要失活或抑制，及应用与TSH受体相互作用的阻断性抗体，例如9D33，来抑制TSH受体自身抗体结合，因而在这类疾病的治疗中有着重要治疗应用。需要抑制TSH受体自身抗体结合的自体免疫疾病的治疗，所述自体免疫疾病例如上面讨论的与对TSH受体的自体免疫相关的眼眶后组织疾病，可以选择性地使用针对如本发明所提供的结合配偶体或另外的结合配偶体的抗独特型抗体，如这里所述，所述的这样的抗独特型抗体形成本发明的一个重要方面且其进一步的制备细节由实施例提供。

因此，更具体地，本发明提供了TSH受体的另外的结合配偶体在与对TSH受体的自体免疫相关的眼眶后组织疾病的治疗中的用途，该另外的结合配偶体基本上抑制基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)结合到TSH受体上。本发明进一步提供了另外的TSH受体的结合配偶体在制备治疗与TSH受体的激活和/或刺激相关的眼眶后组织疾病的药物中的用途，该另外的结合配偶体基本上抑制基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)结合到TSH受体上。还提供了一种治疗与对TSH受体的自体免疫相关的眼眶后组织疾病的方法，该方法包括对患有或易感这样的疾病的患者施用治疗有效量的TSH受体的另外的结合配偶体，该另外的结合配偶体基本上抑制基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)结合到TSH受体上。用于本发明的实施方案中的另外的结合配偶体优选含有阻断性抗体，该阻断性抗体可基本上抑制本发明所提供的结合配偶体，就像该TSH受体自身抗体结合一样，结合到TSH受体上，并且优选这样的抗体可以包含文中所述的9D33。

本发明还提供了针对本发明的结合配偶体和另外的结合配偶体的结合区而产生的抗独特型抗体在与对TSH受体的自体免疫相关的眼眶后组织疾病的治疗中的用途。本发明还进一步提供了针对本发明的结合配偶体和另外的结合配偶体的结合区而产生的抗独特型抗体在制备治疗与TSH受体的激活和/或刺激相关的眼眶后组织疾病的药物中的用途。还提供了一种治疗与对TSH受体的自体免疫相关的眼眶后组织疾病的方法，该方法包括对患有或易感这样的疾病的患者施用治疗有效量的抗独特型抗体，该抗独特型抗体是针对本发明的结合配偶体和另外的结合配偶体的结合区而产生的。

如本发明所提供的单克隆抗体相对于TSH在所述体外和/或体内应用中的一个主要优势是这样的抗体可以被相对容易地操纵。例如对根据本发明的单克隆抗体的TSH受体结合区进行操纵，来改变其特性，例如亲和力和生物学特性，包括TSH激动剂或拮抗剂的活性程度。此外，根据本发明的单克隆抗体相对于TSH在体内具有长得多的半衰期，这将在体内应用中具有相当大的优势。另外，抗体的半衰期能够被操纵，例如抗体Fab片段相对于完整IgG具有短得多的半衰期。

根据本发明的药物组合物包括那些适于口服、非肠道注射和局部施用的药物组合物，尽管最佳的途径取决于患者的状况和正在治疗的具体疾病。待施用给患者的基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)的精确施用量将由主治医生来决定，尽管使用的剂量将取决于很多的因素，包括患者的年龄和性别、正在治疗的具体病情和基本上如前所述的给药途径。

本发明还进一步提供了一种刺激甲状腺组织，和/或含有TSH受体的组织的方法，该方法包括对需要这种刺激的患者施用诊断有效量或治疗有效量的基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)。

本发明还同时提供了基本上如前所述的TSH受体的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)与一种或多种另外试剂的组合以同时、独立、或顺序使用以用于刺激甲状腺组织和/或含有TSH受体的组织，所述另外的试剂能刺激甲状腺组织，和/或含有TSH受体的组织。优选这样的一种或多种另外的试剂包含重组人TSH和/或其一个或多个变异体、类似物、衍生物或片段，或该片段的变异体、类似物或衍生物。可选地，这样的一种或多种另外的试剂可以独立地结合到TSH受体上。

根据本发明的TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)也可以被用作需要含有TSH受体抗体的患者血清的替代源，来用于商业性试剂盒中。此外，TSH受体的结合配偶体或另外的结合配偶体(典型地是人单克隆或重组抗体)也可以根据本发明被提供在需要含有规定浓度的TSH受体的一种或多种抗体的制备物中，以这种方式，可以提供具有规定活性例如对TSH受体的刺激活性的制备物。任选地，这样的制备物还可以进一步含有一种或多种另外的人单克隆抗体，例如对GAD、TPO等的单克隆抗体。

提供以下示例性解释用以帮助理解文中所用的某些术语。提供这些解释是为了方便，不是对本发明的限制。

TSH受体的结合配偶体，描述的是一种具有对TSH受体的结合特异性的分子。文中所说的结合配偶体可以天然来源的，或全部或部分合成产生的。这样的结合配偶体具有结构域或区，它特异性地结合到TSH受体的一个或多个表位区，并因此与其互补。尤其是，文中所述的结合配偶体可以是TSH受体的单克隆或重组抗体，更具体地，可以是TSH受体的人单克隆或重组抗体。

C区，表示在抗体分子中氨基酸序列相对恒定的区域。

CDR，表示互补决定区，其同时存在于抗体分子的重链和轻链上并代表序列变异性最大的区域。CDR代表可变区的约15％～20％并代表抗体的抗原结合位点。

FR，表示阅读框区域，并代表不存在于CDR中的其它轻链可变区和重链可变区。

HC，表示抗体分子的部分重链，该部分重链含有重链可变区和IgG恒定区的第一区。

宿主细胞，是指已被外源多核苷酸序列转化或转染或能被其转化或转染的细胞。

同一性，如本领域所已知，通过对序列进行比较所决定两个或多个多肽序列之间，或两个或多个多核苷酸序列之间的关系。

LC，表示抗体分子的轻链序列。

NIBSC 90/672，是针对甲状腺刺激抗体的一个国际标准。该针对甲状腺刺激活性抗体的国际标准由包含来自单个病人的一批冻干血浆蛋白质的安瓿组成，所述患者具有高水平的TSH受体自身抗体。已经在国际合作研究中评估了该制备物，并显示出其同时拥有甲状腺刺激活性和甲状腺受体结合活性。在1995年的第46界会议中，WHO(世界卫生组织)的生物学标准专家委员会确定代码为90/672的制备物作为甲状腺刺激抗体的国际标准。每安瓿包含含有0.02M磷酸盐缓冲液和透析的人血浆蛋白质的1.0ml溶液的冻干残余物，根据定义每安瓿为0.1个国际单位(100/1000国际单位)。

文中所述用人单克隆抗体“刺激TSH受体”，是指它能结合到TSH受体上的能力及因此发挥作用的能力，例如作为上述结合到TSH受体上的结果而产生环状AMP。这样的刺激与所见到的TSH或TSH受体自身抗体结合到TSH受体上的反应是类似的，并且以这种方式，文中所述人单克隆抗体基本上提供与所见到的TSH或TSH受体自身抗体结合到TSH受体上的相同或相似的结合反应。

V区，表示抗体分子中氨基酸序列的高度可变的区域。

V_H区，表示抗体分子重链中的可变区或结构域。

V_L区，表示抗体分子轻链中的可变区或结构域。

具体实施方式

现在将通过以下附图和实施例来说明本发明，但这不以任何方式限制本发明的范围。

实施例

材料与方法

淋巴细胞的分离和人单克隆TSH受体自身抗体的克隆

血液获自突眼性甲状腺肿病和I型糖尿病患者，所述患者具有高水平的TSH受体的血清自身抗体(TRAb)。该研究已经获得伦理委员会的同意。在Ficoll-Paque(Amersham Biosciences，chalfont St Giles，HP8 4SP，UK)上从20mL血样中分离外周血淋巴细胞，然后用EB病毒(EBV)(欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)-ECACC；Porton Down，SP4 0JG，UK)感染，并如以前描述的那样，在鼠巨噬细胞饲养层上培养(N Hayakawa、LDKE Premawardhana、MPowell、M Masuda、C Arnold、J Sanders、M Evans、S Chen、JC Jaume、S Baekkeskov、B Rees Smith、J Furmaniak；“谷氨酸脱羧酶的人单克隆抗体的分离和表征(Isolation and characterization of human monoclonalautoantibodies to glutamic acid decarboxylase)”；自体免疫(Autoimmunity)2002；35：343～355)。随后将由EBV无限增殖的B淋巴细胞与鼠/人杂交细胞系K6H6/B5融合(WL Carroll，K Thilemans，J Dilley，R Levy；“鼠人异种杂交瘤作为融合配偶体与人B细胞瘤融合(Mouse×humanheterohybridomas as fusion partners with human B cell tumors)”；免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)1986；89：61～72)，并以5个细胞/孔有限稀释进行克隆两次，最后以0.5个细胞/孔有限稀释克隆一次，以获得单克隆(BJ Bolton，NK Spurr.“B淋巴细胞(B-lymphocytes)”，RI Freshney，MG Freshney(编辑)；无限增殖细胞的培养(Culture of immortalized cells)，Wiley-Liss，New York 1996；283～297)。原始细胞及随后的克隆通过对¹²⁵I-TSH结合到溶液化的TSH受体上的抑制来筛选TSH受体自身抗体(参见下文)。生产TSH受体自身抗体的单克隆在组织培养瓶中生长。

单克隆TSH受体抗体制备物的生产、纯化和标记

鼠TSH受体MAb如以前所述进行生产(Y Oda、J Sanders、M Evans、A Kiddie、A Munkley、C James、T Richards、J Wills、J Furmaniak、B ReesSmith；“用单克隆抗体对人促甲状腺素受体进行表位分析(Epitopeanalysis of the human thyrotropin(TSH)receptor using monoclonalantibodies)”；甲状腺(Thyroid)2000；10：1051～1059)，也可以用克隆到pcDNA3.1中的全长TSHR cDNA来免疫鼠而制备(UA Hasan、AMAbai、DR Harper、BW Wren、WJW Morrow；“核酸免疫：与第三代疫苗相关的概念和技术(Nucleic acid immunization：Concepts and techniquesassociated with third generation vaccines)”免疫学方法杂志(Journal ofImmunological Methods)1999；229：1～22)。

将IgG在Prosep A(Millipore UK Ltd.；Watford，WD18 8YH，UK)上，依照生产商的使用说明用亲和层析法从组织培养物上清液中纯化出来，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)测定其纯度。

人重链同种型用径向扩散法确定(The Binding Site，Birmingham，B29 6AT，UK)。人轻链同种型通过用抗人kappa(κ)链和抗人lambda(λ)链特异性鼠单克隆抗体(Sigma-Aldrich有限公司；Gillingham，SP84XT，UK)进行蛋白质印迹来确认。

经纯化的IgG制备物用汞合木瓜蛋白酶(Sigma-Aldrich)处理，酶/蛋白质比例界于1∶10到1∶100之间(取决于特定的单克隆抗体)，并通过Prosep A柱以从Fab制备物中除去任何完整的IgG或Fc片段(Y Oda、J Sanders、S Roberts、M Maruyama、R Kato、M Perez、VB Petersen、NWedlock、J Furmaniak、B Rees Smith；“TSH受体抗体的结合特性(Bindingcharacteristics of antibodies to the TSH receptor)”，分子内分泌学杂志(Journal of Molecular Endocrinology)1998；20：233～244)。完整的IgG在Fab制备物中用SDS-PAGE是不可检测的。单克隆抗体的IgG和Fab制备物如以前所述用¹²⁵I标记(Y Oda、J Sanders、S Roberts、M Maruyama、R Kato、M Perez、VB Petersen、N Wedlock、J Furmaniak、B Rees Smith；“TSH受体抗体的结合特性”，分子内分泌学杂志1998；20：233～244)。根据生产商的使用说明，IgG制备物用生物素酰肼(Pierce RockfordIL61105 USA)进行标记。获得人单克隆TSH受体自身抗体的Fab片段的晶体，且采用标准技术确定它们的晶体结构。

患者

对来自突眼性甲状腺肿患者不同疾病时期的血清进行了研究。所研究的患者血清显示出对¹²⁵I标记的TSH结合到TSH受体上的抑制(参见下文)。此外，研究了来自两名阿狄森氏病患者的血清(A1和A2)，所述患者具有高水平21-OH的自身抗体(113和1970个单位/mL，RSR试剂盒)；和来自两名1型糖尿病患者的血清(D1和D2)，所述患者具有高水平的GAD₆₅(3700和37.5单位/mL，RSR试剂盒)。该研究得到了患者的同意。还研究了来自健康献血者的血清(购自Golden WestBiologicals，Vista，CA 92083，USA)。TRAb第一国际标准制备物(90/672)获自国家生物标准与控制学会(National Institute for Biological Standardsand Control，NIBSC；Potters Bar，EN6 3QH，UK)。

对¹²⁵I-TSH和¹²⁵I-鼠TSHR MAb结合到TSH受体上的抑制

如以前所述，用TSH受体包被的试管进行结合抑制实验(J Sanders、Y Oda、S Roberts、A Kiddie、T Richards、J Bolton、V McGrath、S Walters、D Jaskolski、J Furmaniak、B Rees Smith；TSH受体自身抗体与¹²⁵I标记的TSH受体间的相互作用(The interaction of TSH receptor autoantibodieswith ¹²⁵I-labeled TSH receptor)；Journal of Clinical Endocrinology andMetabolism(临床内分泌学和代谢杂志)1999；84：3797～3802)(试剂来自RSR Ltd.)。简而言之，将100μL样品(组织培养物上清液、经纯化的IgG或Fab片段、患者血清或NIBSC 90/672标准)在TSH受体包被的试管中，于室温下轻摇孵育两小时。抽吸后，将试管用1mL测定缓冲液(50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl PH7.8、0.1％ Triton X-100)洗涤两次，然后添加100μL的¹²⁵I-TSH或¹²⁵I-MAb(5×10⁴cpm)，并于室温下振荡孵育1小时。然后将试管用1mL测定缓冲液洗涤两次，抽吸并在gamma(γ)计数器中计数。

结合的抑制通过下式计算：

所用对照物质是培养基、健康鲜血者血清池或其它指出的物质。

甲状腺刺激活性的分析

单克隆自身抗体制备物和患者血清对表达hTSH受体的CHO细胞(大约50,000个受体/每个细胞)中环腺苷酸(或cAMP)产生的刺激能力(Y Oda、J Sanders、S Roberts、M Maruyama、R Kato、M Perez、VBPetersen、N Wedlock、J Furmaniak、B Rees Smith；“TSH受体抗体的结合特性”，分子内分泌学杂志1998；20：233～244)，根据文献“R Latif，P Graves，TF Davies，人促甲状腺素受体的寡聚化作用(Oligomerizationof the human thyrotropin receptor)，生物化学杂志(Journal of BiologicalChemistry)2001；276：45217～45224”中所述的方法实施。简而言之，将CHO细胞接种到96孔板中(30,000细胞/孔)，并在含10％胎牛血清的DMEM(Invitrogen Ltd；Paisley PA4 9RF，UK)中孵育24小时。随后将培养物在不含有胎牛血清的DMEM中继续孵育24小时。然后移走DMEM，加入待测TSH、IgG、Fab和血清(100μL稀释在不含NaCl的含1g/L葡萄糖、20mmol/L Hepes、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白(BSA)和0.5mmol/L的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤pH7.4的Hank’s缓冲盐溶液中)并在37℃孵育1小时。移走待测溶剂后，将细胞溶解并用Biotrak酶免疫测定系统(Amersham Bioscience；Chalfont St Giles，HP84SP，UK)测定环腺苷酸。在一些实验中，测定患者血清和TSHR的鼠单克隆抗体对TSH或hMAb TSHR1的刺激活性的抑制能力。这通过将(a)TSH或hMAb TSHR1独自的刺激效应与(b)在患者血清或鼠单克隆抗体存在下的TSH或hMAb TSHR1的刺激效应进行比较来完成。

可变区基因分析

总RNA是由产生克隆的TSH受体自身抗体的1×10⁷个细胞，用酸性苯酚胍法(P Chomczynski，N Sacchi；“采用酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取的RNA分离的一步法(Single-step method of RNA isolation by acidguanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction)”；AnalyticalBiochemistry(分析生物化学)1987；162：156～159)制备；用寡脱氧胸苷酸(dT)磁珠制备mRNA(Dynal Biotech Ltd.；Wirral，CH62 3QL，UK)。用来自Invitrogen Ltd.；Paisley PA4 9RF，UK的试剂进行RT-PCR反应(反转录—聚合酶链式反应)。

用医学研究委员会的V-base数据库(www.mrccpe.cam.ac.uk)推荐的序列设计正义链寡核苷酸引物。对人IgG1重链和lambda轻链具有特异性的反义引物是基于编码DNA序列的恒定区。正义引物和反义引物两者都包括额外的5’限制性内切酶位点序列来促进PCR产物的克隆。IgG1重链和lambda轻链用成套的合适引物进行RT-PCR发应。所有的引物都由Invitrogen Ltd.合成。RT反应在50℃进行10分钟，随后马上进行40个循环的PCR(15秒94℃，30秒55℃，30秒72℃)。将RT-PCR产物克隆到pUC18和用Promega UK Ltd.；Southampton SO16 7NS，UK的Wizard试剂盒制备的DNA中，通过Sanger-Coulson法(F Sanger、SNicklen、AR Coulsen；“用链终止抑制剂进行DNA测序(DNA sequencingwith chain terminating inhibiors)”，美国国家科学研究院年报(Preceedingsof the National Academy of sciences of the USA，1977；74：5463～5467)进行测序。用Ig blast(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi)将V区序列与人Ig基因的可得到序列进行比较。

免疫沉淀测定(IPA)

将编码全长TSH受体的cDNA置于pYES2(Invitrogen)中T7启动子的下游，并用于体外TnT系统(Promega UK Ltd.)中以生产如前所述的用³⁵S-甲硫氨酸标记的TSH受体(L Prentice、J Sanders、M Perez、RKato、J Sawicka、Y Oda、D Jaskolski、J Furmaniak、B Rees Smith；“促甲状腺素(TSH)自身抗体不显示出结合到在体外转录/翻译系统中产生的TSH受体上(Thyrotropin(TSH)receptor autoantibodies do not appear tobind to the TSH receptor produced in an in vitro transcription/translationsystem)”；临床内分泌学和代谢杂志(Journal of Clinical Endocrinology andMetabolism)1997；82：1288～1292)。简而言之，加入稀释在HSB(150mmol/L Tris-HCL pH8.3，200mmol/L NaCl和10mg/ml含有1％Tween 20的牛血清白蛋白)中的50μL的³⁵S标记的TSH受体(25,000～30,000cpm)以使50μL的等份的经稀释待测样品加倍，并在室温孵育2小时。然后免疫复合物通过添加蛋白A琼脂糖(Sigma-Aldtich)而沉淀并在闪烁计数器中计数。

TSH受体制备物与蛋白质印迹

在CHO-K1细胞中表达全长人TSH受体，将其用1％ Triton X-100提取，如以前所述用TSH受体单克隆抗体亲和层析法纯化(Y Oda、JSanders、M Evans、A Kiddie、A Munkley、C James、T Richards、J Wills、J Furmaniak、B Rees Smith；“用单克隆抗体对人促甲状腺素(TSH)受体进行表位分析”；甲状腺2000；10：1051～1059)。

将纯化的CHO细胞产生的TSH受体在9％SDS-PAGE凝胶上进行电泳，将其印迹杂交到硝酸纤维素上，如以前所述与待测抗体反应(YOda、J Sanders、M Evans、A Kiddie、A Munkley、C James、T Richards、J Wills、J Furmaniak、B Rees Smith；“用单克隆抗体对人促甲状腺素(TSH)受体进行表位分析”；甲状腺2000；10：1051～1059)。

用TSH受体肽进行表位分析

各自长度为25个氨基酸的覆盖了人TSH受体的整个胞外区的26个肽由J Morris博士惠赠(JC Morris、ER Bergert、DJ McCormik，“人促甲状腺素受体的结构-功能研究，用合成的人TSH受体肽抑制标记的促甲状腺素(TSH)的结合(Structure-fuction studies of the human thyrotropinreceptor.Inhibition of binding of labeled thyrotropin(TSH)by synthetichuman TSH receptor peptides”；生物化学杂志1993；268：10900～10905)。将结合到M21-OH5Mab(S Chen、J Sawicka、L Prentice、JF Sanders、HTanaka、V Petersen、C Betterle、M Volpato、S Roberts、M Powell、B ReesSmith、J Furmaniak；“用一组单克隆抗体分析类固醇21-羟化酶上的自身抗体表位(Analysis of autoantibody epitopes on steroid 21-hydroxylase usinga panal of monoclonal antibodies)”；临床内分泌学和代谢杂志(Journal ofClinical Endocrinology and Metabolism)1998；83：2977～2986)上的人21-OH肽(C1，SSSRVPYKDRARLPL)用作阳性对照，将GAD₆₅的人单克隆抗体(N Hayakawa、LDKE Premawardhana、M Powell、M Masuda、C Arnold、J Sanders、M Evans、S Chen、JC Jaume、S Baekkeskov、B ReesSmith、J Furmaniak；“谷氨酸脱羧酶的人单克隆抗体的分离和表征”；自体免疫2002；35：343～355)用作阴性对照。如以前所述，进行肽ELISA(Y Oda、J Sanders、M Evans、A Kiddie、A Munkley、C James、T Richards、J Wills、J Furmaniak、B Rees Smith；“用单克隆抗体对人促甲状腺素(TSH)受体进行表位分析”；甲状腺2000；10：1051～1059)。

单克隆TSHR自身抗体制备物与包被到塑料试管上或ELISA板的孔上的TSH受体的相互作用

(a)¹²⁵I标记的自身抗体

将包括患者血清的待测样品(100μl)在TSH受体包被的试管(RSRLtd.)中，于室温轻摇孵育2小时。抽吸后，将试管用1mL测定缓冲液洗涤两次，然后加入100μL的已标记的自身抗体制备物(30,000cpm)，并于室温下振荡孵育1小时。然后将试管用1mL测定缓冲液洗涤两次，抽吸并在gamma计数器中计数。对¹²⁵I标记的自身抗体结合的抑制用对TSH结合的抑制的公式计算(见上)。

(b)生物素标记的单克隆自身抗体和生物素标记的TSH

使用以前描述的方法(J Bolton、J Sanders、Y Oda、C Chapman、RKonno、J Furmaniak和B Rees Smith；“通过ELISA测定甲状腺刺激激素受体自身抗体(Measurement of thyroid-stimulating hormone receptorautoantibodies by ELISA)”；临床化学(Clinical Chemistry)1999；45：2285～2287)。简而言之，在ELISA板振荡器上，将包括患者血清的待测样品(75μl)在TSH受体包被的ELISA板的孔(RSR Ltd.)中，振荡(振荡200次/每分钟)孵育2小时。然后移走待测样品，并用测定缓冲液洗涤所述孔两次。然后加入生物素标记的单克隆TSH受体自身抗体(100μl中1ng)或生物素标记的猪TSH(RSR Ltd.；100μl中5ng)并将其于室温下继续孵育25分钟但不振荡。将所述孔洗涤一次，并加入100μl的链亲和素-过氧化物酶(RSR Ltd.；100μl中10ng)并于室温下继续孵育20分钟但不振荡。然后，将所述孔洗涤三次，加入过氧化物酶底物四甲基联苯胺(RSR Ltd.；100μl)。于室温下不振荡地孵育30分钟后，加入50μl的0.5M H₂SO₄以终止底物的反应，在ELISA平板读数器上读取每孔在450nm处的吸光度。对生物素酰化的MAb或TSH结合的抑制用如下计算的指标表示：

单克隆自身抗体结合到TSH受体包被的试管的斯卡查德分析

将50μl测定缓冲液中的非标记IgG或Fab，和50μl的¹²⁵I标记的hMAb IgG或Fab(测定缓冲液中30,000cpm)在室温下轻摇孵育2小时，用1mL的测定缓冲液洗涤两次，并在gamma计数器中计数。对结合的IgG或Fab的浓度相对于结合的/游离的IgG或Fab的浓度进行制图(GScatchard；“蛋白质对小分子和离子的吸引(The attraction of proteins forsmall molecules and ions)”，纽约科学研究院年报(Annals of the New YorkAcademy of Sciences)1949；51：660～672)以得出缔合常数。

TSH受体结合到用单克隆TSH受体自身抗体包被的试管上

将包括患者血清的待测样品(100μl)和去污剂溶解的TSH受体(20μl)在室温孵育1小时。然后将50μl(两等份)的孵育混合物加入塑料试管(Nunc Maxisorp)中，该试管已经用单克隆TSH受体自身抗体Fab所包被(200μl的10μg/mL Fab，4℃过夜，随后进行洗涤和后包被)。在室温轻摇孵育1小时后，洗涤试管，加入100μl(40,000cpm)¹²⁵I标记的TSH受体C末端单克隆抗体4E31(J Sanders、Y Oda、A Kiddie、TRichards、J Bolton、V McGrath、S Walters、D Jaskolski、J Furmaniak、BRees Smith；TSH受体自身抗体与¹²⁵I标记的TSH受体间的相互作用；临床内分泌学和代谢杂志1999；84：3797～3802)，并继续再轻摇孵育1小时。然后，洗涤试管并对¹²⁵I进行计数。

在E Coli(大肠杆菌)中克隆和表达重组hMAb TSHR1 Fab

将hMAb TSHR1重链的RT-PCR产物(参见可变区基因分析部分)用XhoI和SpeI限制性内切酶进行酶切，将hMAb TSHR1轻链的PCR产物用ScaI和XbaI限制性内切酶进行酶切，将重链和轻链cDNA均克隆到Immunozap H/L载体中(Stratagene Europe；Amsterdam，Netherlands)(I Matthews，G Sims，S Ledwidge，D Stott，D Beeson，N Willcox，AVincent；“患有肌无力的经产妇女中的乙酰胆碱受体抗体：被胎儿抗原免疫的证据(Antibodies to acetylcholine receptor in parous women withmyasthenia：evidence for immunization by fetal antigen)”，LaboratoryInvestigation(实验室研究)2002；82：1～11)，并位于lacZ启动子的控制下。将质粒DNA用Qiagen midi质粒纯化试剂盒(Qiagen Ltd.；Crawley，RH10 9AX，UK)制备，hMAb TSHR1重链和轻链cDNA的存在通过Sanger-Coulson法(F Sanger、S Nicklen、AR Coulsen；“用链终止抑制剂进行DNA测序”，美国国家科学研究院年报1977；74：5463～5467)测序进行确认。将质粒DNA转化到2个不同的E Coli菌株中：(a)XL1-BlueMRF’(Stratagene)和(b)HB2151(Amersham Biosciences)，并在LB氨苄青霉素(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，100μg/ml的终浓度氨苄青霉素)琼脂平板(15g/L琼脂)上于37℃培养过夜。将预培养物(于3mL的LB氨苄青霉素+1％葡萄糖中的一个菌落)在37℃振荡过夜培养。在葡萄糖的存在下，重组Fab的产生受到抑制。将过夜孵育后的预培养以1/100(50ml LB氨苄青霉素中0.5mL)稀释，并于37℃培养直至OD₆₀₀为0.4～0.6。将这些培养物置于30℃振荡20分钟。然后，加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)直至终浓度为1mmol/L，将培养物继续于30℃振荡孵育过夜(16小时)。然后，将培养物于4℃、3000rpm离心30分钟，并回收培养物上清液和沉淀。将沉淀通过涡旋而重悬在1mL冰浴TES缓冲液(0.2mol/L Tris-HCl pH8.0，0.5mol/LEDTA和0.5mol/L蔗糖)中。再加入1.5mL在水中稀释5倍的冰浴TES缓冲液，将混合物再次涡旋并在冰上孵育30分钟，随后再次离心以提供第二次上清液或周质成分(PF)。将培养物上清液和PF通过0.45μm的过滤器过滤，并过夜渗析到pH为7.5的10mmol/L Tris和50mmol/L NaCl中。还制备来自以下细胞的上清液和PF：未转化的XL-1 Blue MRF’和HB2151细胞，用培养时含葡萄糖但不含IPTG(即，未诱导的)的hMAbTSHR1质粒转化的XL1-Blue MRF’(XL-1 Blue MRF’/hMAb TSHR1)和用hMAb TSHR1质粒转化的HB2151(HB2151/hMAb TSHR1)。对培养物上清液和PF进行以下分析：(a)它们抑制TSH结合到TSHR上的能力，(b)它们在表达TSHR的CHO细胞中刺激环腺苷酸生产的能力，和(c)通过放射性免疫测定的总重组Fab浓度。在该分析中，将稀释在测定缓冲液(50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl Ph7.8、0.1％ TritonX-100)中的校准物和包括培养物上清液和PF(100μL，两份)的待测物质于室温在用Fab特异性羊抗人IgG(来自Sigma Aldrich，Poole，BH124QH，UK)包被的塑料试管中孵育1小时。然后将试管用测定缓冲液(2×1mL)洗涤两次，加入100μL的¹²⁵I标记的hMAb TSHR1 Fab(30,000cpm)，然后在室温孵育。1小时后，再次洗涤(2×1mL)试管并对¹²⁵I进行计数。将结合的计数针对校准物(5ng/mL～500ng/mL)中的Fab(杂交瘤产生的hMAb TSHR1 Fab)的浓度进行制图且从该校准曲线读出各种待测物质中的重组Fab的浓度。该分析的检测限是5ng/mL～10ng/mL的Fab。

重组4B4(谷氨酸脱羧酶或GAD的人MAb)和重组杂交Fab(混合的hMAb TSHR1和4B4的HC和LC)的克隆和表达

重组4B4 Fab(N Hayakawa、LDKE Premawardhana、M Powell、MMasuda、C Arnold、J Sanders、M Evans、S Chen、JC Jaume、S Baekkeskov、B Rees Smith、J Furmaniak，谷氨酸脱羧酶的人单克隆抗体的分离和表征，自体免疫2002；第35卷，第343～355页中详细描述了4B4)且通过将各自的HC和LC克隆到Immunozap H/L载体中并如上述重组体hMAbTSHR1 Fab那样在HB2151细胞中被表达来生产重组杂交Fab。对培养物上清液和周质成分进行以下分析：(a)它们抑制TSH结合到TSHR上的能力，(b)它们在表达TSHR的CHO细胞中刺激环腺苷酸产生的能力，和(c)如上述的总重组体Fab浓度。此外，按照如下所述测定GAD Ab活性。

培养物上清液和周质成分中的重组GAD Ab Fab活性的测定

使用基于以下情况的测定：GAD Ab Fab制备物抑制¹²⁵I标记的GAD(来自RSR Ltd.，Cardiff，CF23 8HE，UK)结合到GAD的人单克隆抗体(4B4)上的能力。在该测定中，将稀释在GAD Ab测定缓冲液(150mmol/L NaCl、50mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.1体积％Tween 20、1g/L牛血清白蛋白和0.5g/L NaN₃)中的待测样品(50μL，两份)与¹²⁵I标记的GAD(50μL GAD Ab测定缓冲液中30,000cpm)于室温孵育1小时。然后，加入50μL的4B4 IgG(在GAD Ab测定缓冲液中为0.1μg/mL)，并继续在室温孵育24小时。然后，将固相蛋白A(在GAD Ab测定缓冲液中，为50μL；来自RSR Ltd.)加入到4B4 IgG-¹²⁵I标记的GAD的沉淀复合物中(蛋白A不与Fab和¹²⁵I标记的GAD的复合物反应)。在使与蛋白A的反应在室温下进行1小时后，通过离心使沉淀物沉淀(4℃，1500g离心30分钟)，用1mL的GAD Ab测定缓冲液洗涤并对¹²⁵I进行计数。在没有4B4 IgG的情况下，¹²⁵I标记的GAD结合是所加入的总cpm的4％～5％。

hMAb TSHR1的抗独特型抗体的生产

将6～8周龄BALB/c鼠用完全弗氏佐剂中的50μg hMAb TSHR1 Fab进行腹膜内免疫，随后在25天后用不完全弗氏佐剂中的50μg hMAbTSHR1 Fab进行第二次腹膜内免疫，并在移走脾脏前4天进行再一次的50μg hMAb TSHR1 Fab注射。将来自抗体阳性鼠的脾脏细胞(见下述)与鼠骨髓瘤细胞系融合并如上述分离的TSHR MAb的方法分离单克隆抗体。通过对¹²⁵I-hMAb TSHR1 Fab结合到TSHR包被的试管上的抑制来测定鼠血清和培养孔中的抗独特型抗体的水平。尤其是，将60μL待测样品(两等份，在测定缓冲液中稀释，所述测定缓冲液为50mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl pH7.8、0.1％ Triton X-100)与60μL ¹²⁵I-hMAb TSHR1Fab(稀释在测定缓冲液中，为30,000cpm)于室温下孵育1小时。将100μL的混合物转移到具有20μL起始缓冲液(见上)的两个同样的由TSHR包被的试管(RSR Ltd.)中，并于室温继续再振荡孵育两小时。然后，将试管用2×1mL测定缓冲液洗涤并对¹²⁵I进行计数。从待测样品对标记的hMAb TSHR1 Fab结合到TSHR包被的试管上的抑制能力明显看出与hMAb TSHR1反应的抗独特型抗体的存在。

结果

获自20mL患者血液的淋巴细胞(30×10⁶)以1×10⁶个细胞/孔铺在48孔平板上，所述孔中具有在鼠巨噬细胞饲养层上的200μL EBV上清液。在EBV感染后第11天，监测上清液对¹²⁵I-TSH结合的抑制。发现一个孔的结合抑制呈阳性，到第16天抑制水平升高至超过90％并维持这一水平直到第24天，此后，该水平下降。使培养物展平并在EBV感染后第21、23、26和27天与K6H6/B5细胞融合；总共进行了7个融合实验。每一融合在3块96孔板(即，总共21块板)间铺板，并获得一个孔，该孔稳定生产具有¹²⁵I-TSH结合抑制活性的抗体。随后进行3轮的再克隆以获得生产人单克隆抗体的单克隆，该抗体抑制被标记的TSH结合到TSH受体上。将该人单克隆TSH受体自身抗体称为hMAb TSHR1，且属于具有lambda轻链的IgG1亚型。

不同浓度的hMAb TSHR1 IgG和Fab抑制被标记的TSH结合到TSH受体上的能力如图1所示。如图1所示，低至1ng/mL的这些制备物对TSH结合的抑制超过用1000ng/mL所获得的抑制的90％。如图2所示，TSMAb TSHR1 IgG和Fab同样刺激用TSH受体转染的CHO细胞中的环腺苷酸的产生。低至1ng/mL的hMAb TSHR1 IgG或Fab引起对环腺苷酸的强烈刺激。用0.1ng/mL的猪TSH和10ng/mL的人TSH也观察到了相似的抑制水平。对于来自最初淋巴细胞供体的血清(在获取用于淋巴细胞分离的血样的同时获取的)抑制被标记的TSH结合到TSH受体上的能力，和刺激TSH受体转染的CHO细胞中的环腺苷酸产生的能力的比较如图3所示。TSH结合的抑制可以用稀释500倍的血清检测到，然而对环腺苷酸的刺激可以用稀释5000倍的血清检测到。

¹²⁵I-标记的hMAb TSHR1 IgG结合到TSH受体包被的试管上，斯卡查德分析显示缔合常数为5×10¹⁰/mol。该结合被来自突眼性甲状腺肿患者的血清所抑制，该患者具有TSH受体自身抗体(可以通过对TSH受体结合的抑制来检测)(表1)。¹²⁵I-标记的hMAb TSHR1 Fab也结合到TSH受体包被的试管上(进行斯卡查德分析，缔合常数＝4.5×10¹⁰/mol)，且该结合被TSH受体自身抗体阳性的突眼性甲状腺肿患者的血清所抑制(表2)。此外，去污剂溶解的制备物能够结合到用hMAb TSHR1包被的塑料试管上，且该结合可以被含有TSH受体自身抗体的血清所抑制(表3)。

如表4所示，hMAb TSHR1-生物素结合到TSH受体包被的ELISA板上且该结合被国际参考制备物NIBSC 90/672和来自突眼性甲状腺肿患者的血清所抑制。在来自健康献血者的血清中没有观察到对结合的抑制。图3a表示基于hMAb TSHR1-生物素的TSHR自身抗体的检测与以前的检测之间的比较曲线图。基于hMAb TSHR1-生物素的测定灵敏度明显超过根据国际标准NIBSC 90/672可检测的浓度。这在对来自72个突眼性甲状腺肿患者的血清进行的研究中得以确认，如图3b所示。在该研究中，健康献血者血清(n＝100)和来自非甲状腺疾病的患者的血清(n＝43)分别给出了达10％的对hMAb TSHR1结合的抑制和达11％的对TSH结合的抑制。

hMAb TSHR1 IgG既没有在蛋白质印迹分析中与全长TSH受体制备物反应，也没有在免疫沉淀反应或TSH受体肽ELISA中与¹²⁵S标记的全长TSH受体反应。该反应性的缺乏表明hMAb TSHR1与TSH受体上的构象表位而不是线性表位发生反应。

对编码hMAb TSHR1的基因进行序列分析，表明重链V区基因属于VH5家族，D基因属于D6-13家族，J基因属于JH5家族；对于轻链，V基因区来自VL1-11种系，J基因区来自JL3b种系。重链核苷酸和氨基酸序列分别如图4和图5所示，轻链核苷酸和氨基酸序列分别如图6和图7所示。这些序列是用简并PCR引物测定的HC和LC核苷酸序列的改进。具体地，鉴定了核苷酸115～120的HC测序人工构造体。测序显示为cacgtg(转录成氨基酸His Val)，而其晶体结构更可靠地显示氨基酸为GlnLeu(相应的碱基为cagctg)。晶体结构分析还使得HC和LC来源的氨基酸序列，尤其是在简并PCR引物区中的氨基酸序列得以改进。在通过RT-PCR发现LC的氨基酸2为Pro的情况下，但通过晶体结构发现为Thr。在通过RT-PCR发现HC的氨基酸2为Met的情况下，但通过晶体结构发现为Val。

在抑制被标记的TSH结合方面对hMAb TSHR1 IgG制备物和TSH受体自身抗体的国际标准进行的比较如表5所示。这使得当在血清中进行测定时，hMAb TSHR1 IgG的特异性活性估测为NIBSC 90/672的138个单位/mg蛋白质；当在测定缓冲液中进行测定时，估测为NIBSC 90/672的163个单位/mg(两者的平均值＝150个单位/mg)。hMAb TSHR1 Fab制备物在血清和测定缓冲液中分别为288和309个单位/mg(二者的平均值＝300个单位/mg)。表6显示了对淋巴细胞供体血清和供体血清IgG进行的相似的分析。可见供体血清含有的平均值为NIBSC 90/672的0.38个单位/mL(在血清和测定缓冲液中分别为0.36和0.4)，供体血清IgG具有的特异性活性的平均值为0.059个单位/mg蛋白质。将这些结果总结在表7中，与hMAb TSHR1 IgG的特异性活性(150个单位/mg)进行比较，表明单克隆抗体IgG在抑制TSH结合方面的活性比淋巴细胞供体血清IgG的活性高于2500倍。

关于不同IgG和血清制备物在被TSH受体转染的CHO细胞中刺激环腺苷酸的活性方面的最初评价也在表7中示出。对环腺苷酸的刺激测定的特征在于，测定中和测定间的变化性相当大。这涉及几个因素，包括在最初接种到96孔板中的细胞的数目和质量的不同，及接种的细胞在随后48小时期间生长率的不同。因此，对hMAb TSHR1 IgG和Fab、淋巴细胞供体血清、血清IgG和NIBSC 90/672的测定重复进行，结果概括在表8中。在刺激测定中hMAb TSHR1 IgG的特异性活性为318个单位/mg，与之相比，淋巴细胞供体血清IgG的特异性活性为0.1个单位/mg；即单克隆自身抗体IgG在刺激环腺苷酸生产方面大约是供体血清IgG的3000倍。该值与对TSH结合的抑制测定所观测到值为2500倍合理吻合(参见上述表5和表6)。表9表示hMAb TSHR1 IgG和Fab和淋巴细胞供体血清IgG的TSH受体刺激效应的进一步分析。

猪TSH和hMAb TSHR1 IgG在表达TSH受体的CHO细胞中对环腺苷酸生产的刺激可以另外参见表10所示的结果。

用参考制备物NIBSC 90/672刺激环腺苷酸生产测定中所观察到的典型结果如表11所示。

表12和13表示不同的E.Coli培养物上清液分别在抑制被标记的TSH结合和刺激环腺苷酸生产方面的效应。转化的(用hMAb TSHR1质粒)和IPTG诱导的两个E.Col菌株培养物产生的重组hMAb TSHR Fab量足以用作TSH结合的有效抑制剂(表12)和环腺苷酸生产的有效刺激剂(表13)。对照培养物上清液(来自未转化的细胞和被转化但未被诱导的细胞)不产生可检测水平的结合抑制(表12)或刺激(表13)活性。

在其它的对照组实验中，对重组人抗体Fab进行分析，所述重组人抗体Fab通过克隆和表达GAD的人单克隆抗体(4B4)的HC和LC而产生。对培养物上清液和周质成分进行测定，表明重组4B4 Fab不具有可检测的对TSH结合的抑制活性(表14和15)或TSHR刺激活性(表16和17)。此外，由(a)hMAb TSHR1 HC和4B4 LC(b)hMAb TSHR1LC和4B4 HC组成的杂合Fab在任何测定中都不显示与TSHR的相互作用(表14～17)。在这些不同的重组Fab制备物中GAD Ab活性的测定仅能够在用4B4 HC和4B4 LC转化的细胞中检测到GAD Ab的表达(表18和19)。重组hMAb TSHR1 Fab不显示可检测到的GAD Ab活性，由4B4和hMAb TSHR1 HC和LC组成的混合物构成的重组Fab杂合体也不显示可检测到的GAD Ab活性(表18和19)。

hMAb TSHR1对用TSHR转染的CHO细胞中的环腺苷酸生成的刺激能力被含有TSHR自身抗体的患者血清所抑制，所述TSHR自身抗体担当TSH拮抗剂(图8)。此外，TSHR的鼠单克隆抗体(9D33)能阻断hMAb TSHR1刺激活性(表20)，然而另一TSHR鼠MAb(2B4)是无效的(表20)。然而，2B4能够如9D33那样阻断TSH的刺激活性(表21)。表22显示2B4和9D33抑制¹²⁵I标记的TSH和¹²⁵I标记的hMAbTSHR1结合到TSHR塑料试管上的能力。9D33能够非常有效地抑制标记的TSH的结合和标记的hMAb TSHR1的结合(10μg/mL时高于50％的抑制)。2B4是标记的TSH结合到TSHR上的有效的抑制剂(1μg/mL时高于80％的抑制)，但对hMAb TSHR1结合(1μg/mL时11％的抑制)或对9D33结合(1μg/mL时22％的抑制)仅有较小的效应。标记的9D33与TSHR包被的试管的结合被来自突眼性甲状腺肿患者的含有TSHR自身抗体的血清所抑制(通过对标记的TSH结合到TSHR上的抑制来测定)，但是健康献血者血清和来自其它自体免疫疾病患者的血清几乎没有效应或没有效应(表23)。标记的9D33与TSHR的结合被具有TSH激动剂或拮抗剂特性的TSHR自身抗体(表24)和国际标准NIBSC 90/672(表25)所抑制。斯卡查德分析表明9D33和2B4对包被到塑料试管上的TSH受体分别具有2×10¹⁰/mol和1×10¹⁰/mol的亲和力。

用hMAb TSHR1 Fab免疫鼠导致在鼠的血清中产生抗体(多克隆抗体)，该抗体能够以这样的方式结合到hMAb TSHR1 Fab上从而抑制Fab结合到TSHR上的能力(表26)。此外，从用hMAb TSHR1 Fab免疫的鼠的脾脏细胞产生的单克隆抗体也能抑制Fab结合到TSHR上(表27)。

我们所有的分析表明人单克隆自身抗体hMAb TSHR1具有存在于淋巴细胞供体血清中的TSH受体自身抗体的TSH受体结合和甲状腺刺激特性。如上详述那样，单克隆抗体也能被制备为重组Fab制备物。

结论

(a)我们已经制备了TSH受体的人单克隆自身抗体，它与供体患者的血清中的TSH受体自身抗体具有相似的特性。该单克隆抗体也被制备为重组Fab制备物。

(b)单克隆抗体IgG和Fab和重组Fab制备物是有效的甲状腺刺激物和标记的TSH结合到TSH受体上的有效抑制剂。

(c)标记的MAb IgG、Fab制备物与TSH受体的结合被来自突眼性甲状腺肿患者的TSH受体自身抗体阳性血清所抑制，但未被健康献血者血清或来自其它自体免疫疾病患者的血清所抑制。基于对标记的hMAb TSHR1结合到TSH受体上的抑制的用于TSHR自身抗体的测定系统比迄今为止所描述的其它测定的灵敏度更高。

(d)用作TSH拮抗剂的TSH受体自身抗体和用作TSH激动剂的TSH受体自身抗体抑制标记的hMAb TSHR1结合到TSH受体上。

(e)包被到塑料试管上的hMAb TSHR1制备物结合TSH受体，且这种结合被在不同患者血清中的TSH受体自身抗体所抑制。

(f)还发现抑制hMAb TSHR1结合到TSHR上的鼠单克隆抗体(9D33)也阻断hMAb TSHR1和TSH的刺激活性。

(g)已制备了hMAb TSHR1的鼠多克隆和单克隆抗体，该多克隆和单克隆抗体以这样的方式结合hMAb TSHR1以阻止其结合到TSHR受体上。因此这些抗独特型抗体与TSHR竞争hMAb TSHR1，这样，它们在需要TSHR自身抗体的结合配偶体的应用中可以是TSHR的有用替代物。

(h)这些结果表明hMAb TSHR1和/或其衍生物和/或其竞争剂可在以下情况中用作TSH的替代物：

(i)对TSH受体自身抗体、TSH和相关配基的测定。

(ii)各种体内应用，包括提供TSH激动剂和拮抗剂活性。

(iii)鉴定和提供新类型的TSH受体自身抗体结合位点。

表1  患者血清对¹²⁵I-标记的hMAb TSHR1 IgG结合到TSH受体上的影响及其与对¹²⁵I-标记的TSH结合到TSH受体上的影响的比较

   待测   物质 对标记的hMAb TSHR1结合的    抑制 对TSH结合 的抑制  待测  物质 对标记的hMAb TSHR1结合的     抑制  对TSH结合   的抑制  G1  62  80  N1  3.1  7.7  G2  91  93  N2  2.4  2.6  G3  91  76  N3  -1.0  4.5  G4  94  92  N4  -11  6.5  G5  93  94  N5  1.7  5.0  G6  76  85  N6  2.8  1.7  G7  87  90  N7  5.2  -0.8  G8  65  45  N8  3.5  0.2  G9  88  90  N9  2.8  -0.6  G10/10  83  59  N10  4.5  2.2  G10/20  69  43  D1  -4.8  2.2  G10/40  56  29  A1  -3.1  1.3  G10/80  42  19  A2  -3.5  -3.0  G11/10  75  73  G11/20  59  54  G11/40  39  33  G11/80  22  18

G1～G11是来自具有突眼性甲状腺肿病史的患者的血清。

G9血清具有高水平的TSH阻断(即TSH拮抗剂活性)。

G10和G11具有高水平的甲状腺刺激活性。

G10是淋巴细胞供体血清。

/10、/20等表示在健康献血者血清的池中的稀释因子。

N1～N10是来自健康献血者的血清。

D1来自1型糖尿病患者(谷氨酸脱羧酶抗体呈阳性)。

A1和A2来自阿狄森氏病的患者(类固醇21-羟化酶自身抗体呈阳性)。

在存在健康献血者血清池时，大约25％的¹²⁵I-标记的MAb IgG结合到TSHR包被的试管上。

表2  患者血清对¹²⁵I-标记的hMAb TSHR1 Fab结合到TSH受体上的影响及其与对¹²⁵I-标记的TSH结合到TSH受体上的影响的比较

  待测物质 对标记的Fab结合 的抑制  对TSH结合  的抑制  稀释在健康献血者血清池中的  NIBSC 90/672  至1U/L  17  13  至2U/L  27  24  至4U/L  47  44  至8U/L  61  65  健康献血者血清A  -3  ＜10  健康献血者血清B  3  ＜10  健康献血者血清C  4  ＜10  健康献血者血清D  -4  ＜10  健康献血者血清E  0  ＜10  突眼性甲状腺肿患者血清F  64  78  突眼性甲状腺肿患者血清G  42  54  突眼性甲状腺肿患者血清H  49  69  突眼性甲状腺肿患者血清I  24  36  突眼性甲状腺肿患者血清J  76  88

表3  TSHR与用hMAb TSHR1 Fab包被的塑料试管的结合和用含有TSHR自身抗体的血清抑制TSHR结合

  待测物质  结合的cpm¹  健康献血者血清A  8406  健康献血者血清B  8430  TSHR自身抗体阳性血清1  1527  TSHR自身抗体阳性血清2  1131  TSHR自身抗体阳性血清3  1199

¹用TSHR C-末端的¹²⁵I-标记的鼠单克隆抗体来检测TSHR结合；总cpm＝39,000/试管

表4  患者血清样品对生物素标记的hMAb TSHR1和生物素标记的TSH结合到用TSHR包被的ELISA板孔上的影响

     hMAb TSHR1生物素      TSH生物素  OD₄₅₀  抑制％  OD₄₅₀  抑制％  HBD池  1.852  0  1.778  0  HBD池加1U/mL  1.46  21  1.489  16  HBD池加2U/mL  1.168  37  1.304  27  HBD池加4U/mL  0.792  57  0.947  47  HBD池加8U/mL  0.539  71  0.492  72  HBD池加40U/mL  0.118  94  0.233  87  血清P1  1.415  24  1.397  21  血清P2  1.264  32  1.256  29  血清P3  0.558  70  0.408  77  血清P4  0.763  59  0.907  49  血清P5  1.047  43  -  血清P6  0.843  55  -  血清P7  1.429  23  -  HBD 1  1.745  6  1.713  4  HBD 2  1.807  2  -  HBD 3  1.779  4  1.626  9  HBD 4  1.821  2  -  HBD 5  1.841  1  1.660  7  HBD 6  1.762  5  1.777  0  HBD 7  1.799  3  1.767  1  HBD 8  1.783  4  1.703  4  HBD 9  1.792  3  1.669  3

HBD＝健康献血者血清

U/mL是NIBSC 90/672的单位

血清P1～P7来自突眼性甲状腺肿患者

表5  用WHO参考制备物NIBSC 90/672和hMAB TSHR1 IgG和Fab制备物抑制TSH结合

  样品          稀释在血清中的样品¹         稀释在测定缓冲液中的样品  抑制  ％  单位  /L  单位  /mg  平均  单位/mg  抑制  ％  单位  /L  单位  /mg  平均  单位/mg  NIBSC 90/672  0.125个单位/L  2  0.25个单位/L  4  0.5个单位/L  11  1.0个单位/L  15  19  2.0个单位/L  28  38  4.0个单位/L  48  64  8.0个单位/L  69  83  40.0个单位/L  95  94  hMAb TSHR1  IgG  0ng/mL  1  0  0.3ng/mL  1  2  1ng/mL  3  3  3ng/mL  7  10  0.46  10ng/mL  21  1.48  148  33  1.73  173  30ng/mL  46  3.9  130  138  70  4.8  160  163  100ng/mL  81  13.5  135  92  15.6  156  300ng/mL  92  95  ＞40  hMAb TSHR1  Fab  0.3ng/mL  5  -2  1ng/mL  5  1  3ng/mL  16  1.05  351  16  0.8  265  10ng/mL  36  2.77  277  52  2.9  291  309  30ng/mL  69  8.0  267  288  86  9.6  372  100ng/mL  89  23.7  237  92  16.9  300ng/mL  93  94  2G4 IgG²  0.3ng/mL  2  -3  3ng/mL  1  -6  30ng/mL  0  -5  300ng/mL  3  -4  2G4 Fab²  0.3ng/mL  4  -5  3ng/mL  4  -6  30ng/mL  1  -5  300ng/mL  2  -6

¹健康献血者血清池，在仅有该血清池存在的条件下，14.9％的总cpm结合到TSHR上；在仅有缓冲液存在的条件下，14.7％的总cpm结合到TSHR上。

²2G4是甲状腺过氧化物酶的人单克隆自身抗体。

表6  用淋巴细胞供体血清和供体血清IgG抑制TSH结合

   样品           稀释在血清中的样品¹           稀释在测定缓冲液中的样品¹  抑  制  ％  单  位  /L²  单位/mg或  (未稀释血  清中的单  位/mL)  平均单位  /mg或(单  位/mL)  抑  制  ％  单位  /L²  单位/mg  或(未稀释  血清中的  单位/mL)  平均单位  /mg或(单  位/mL)  供体血清  稀释1000×  6  10  稀释300×  18  1.2  (0.36)  28  1.3  (0.39)  稀释100×  42  3.2  (0.32)  (0.36)  62  3.9  (0.39)  (0.40)  稀释30×  78  11.3  (0.39)  91  13.5  (0.41)  稀释10×  93  34  95  ＞40  供体血清  IgG  0mg/mL  0  0  0  0.01mg/mL  7  19  0.87  0.03mg/mL  23  1.6  0.053  37  1.9  0.063  0.1mg/mL  57  5.1  0.051  0.054  78  6.4  0.064  0.063  0.3mg/mL  85  17  0.057  93  19  0.063  1mg/mL  96  43  96  ＞40  健康献血者  血清池血清  稀释1000×  0  3  稀释100×  1  4  稀释10×  1  11  健康献血者  血清池血清  IgG  0.01mg/mL  2  2  0.1mg/mL  1  5  1mg/mL  3  7

¹健康献血者血清池血清，在仅有该血清池存在的条件下，14.7％的总cpm结合到TSHR上；在仅有缓冲液存在的条件下，16.3％的总cpm结合到TSHR上。

²所示单位是NIBSC 90/672国际TSHR自身抗体参考制备物。

表7  hMAb TSHR1、淋巴细胞供体血清和IgG制备物的特异性活性

     对TSH结合的抑制的测定   对环腺苷酸的刺激的测            定  制备物 单位/mg^1，2 单位/nmol^1，2  单位/mg¹  单位/nmol¹  hMAb TSHR1 IgG 150 22  180  26  hMAb TSHR1 Fab 300 15  700  35  供体血清IgG 0.059 0.009  0.33  0.048  供体血清  (单位/mL)           0.38          1.8

¹所示单位是NCBSC 90/672。

²该值是在血清和测定缓冲液中所获得的结果的平均值(参见表5和6)。

表8  在多个对环腺苷酸的刺激的测定中确定的hMAb TSHR1、淋巴细胞供体血清和血清IgG的特异性活性的概要

  制备物  平均单位/mg  测定数目  标准差  hMAb TSHR1 IgG  318  16  189  hMAb TSHR1 Fab  492  10  184  供体血清IgG  0.10  10  0.08  供体血清  (单位/mL)  0.9  4  0.6

表9  在环腺苷酸刺激测定中对hMAb TSHR1 IgG和Fab及淋巴细胞供体血清IgG的影响的进一步分析

  样品  每孔环腺苷酸   平均值(pmol)   测定数目    标准差  hMAb TSHR1 IgG 0ng/mL  0.96  6  0.048 0.3ng/mL  1.25  6  0.12 1ng/mL  1.84  6  0.16 3ng/mL  3.4  5  0.37 10ng/mL  6.6  5  0.62 hMAb TSHR1 Fab 0ng/mL  0.60  6  0.068 0.3ng/mL  1.11  6  0.11 1ng/mL  1.99  6  0.39 3ng/mL  4.9  6  0.44 10ng/mL  10.6  6  0.86 对照人MAb(2G4)¹ IgG  0ng/mL  0.72  11  0.19 IgG  10ng/mL  0.61  11  0.16 Fab  10ng/mL  0.61  4  0.044 淋巴细胞供体血清IgG 3μg/mL  1.67  6  0.38 10μg/mL  4.20  6  0.93 30μg/mL  6.22  6  0.73 健康献血者血清池血清IgG 30μg/mL  0.38  6  0.10

¹2G4是甲状腺过氧化物酶的人单克隆自身抗体。

表10  TSH和hMAb TSHR1 IgG在对环腺苷酸的刺激的测定中的加和效应

           实验1            实验2  样品  环腺苷酸¹  (pmol/孔)  样品  环腺苷酸¹  (pmol/孔)  A  仅有缓冲液  0.57  A  仅有缓冲液  0.42  B  猪TSH  (0.1ng/mL)  1.07  B  猪TSH  (0.05ng/mL)  1.07  C  hMAb TSHR1  (1ng/mL)  1.41  C  hMAb TSHR1  (0.5ng/mL)  0.92  B加C  2.08  B加C  1.92

¹所显示的值是非常相符的重复测定的平均值

表11  NCBSC 90/672在环腺苷酸刺激测定中的效应

  样品  平均环腺苷酸/孔(pmol)  测定数目  标准差  仅有缓冲液  0.60  6  0.068  0.1个单位/L  1.09  6  0.085  0.3个单位/L  1.49  5  0.11  1.0个单位/L  3.52  5  0.46  3.0个单位/L  8.16  6  1.39

表12  在两个不同的大肠杆菌菌株(XL-1 Blue MRF’和HB2151细胞)中表达的重组hMAb TSHR1 Fab对¹²⁵I-TSH结合到TSHR包被的试管上的抑制

  样品  培养物上清液的稀释²  结合％  抑制％³  仅有测定缓冲液¹  12.1  0  未转化的XL1-Blue MRF’  细胞培养物上清液  4×  11.6  3.9  8×  11.5  4.5  16×  11.9  1.5  32×  11.9  1.5  64×  11.9  1.0  128×  12.1  -0.5  转化的但未诱导的XL1-Blue MRF’  细胞培养物上清液  4×  11.5  5.0  8×  11.6  4.2  16×  11.8  2.2  32×  11.1  8.4  64×  11.7  3.4  128×  11.1  8.0  转化的且诱导的XL1-Blue MRF’  细胞培养物上清液  4×  1.5  87.4  8×  2.3  81.3  16×  4.7  60.9  32×  7.2  40.2  64×  8.9  26.4  128×  10.3  14.8  未转化的HB2151细胞培养物上清液  ×4  11.2  7.3  ×8  11.1  8.1  ×16  10.9  9.7  ×32  10.8  10.2  ×64  10.8  10.2  ×128  10.6  12.3  转化的但未诱导的HB2151细胞培养  物上清液  4×  10.7  11.6  8×  10.5  13.3  16×  10.6  11.8  32×  10.7  11.4  64×  10.9  9.6  128×  10.6  11.8  转化的且诱导的HB2151细胞培养物  上清液  4×  1.0  92.0  8×  1.0  91.4  16×  1.3  89.0  32×  2.2  82.0  64×  4.3  64.1  128×  6.7  44.8

¹测定缓冲液＝50mmol/L Nacl、10mmol/L Tris-HCl pH7.8

²所有稀释都在测定缓冲液中

3对结合的抑制用以下公式计算：

其中，A＝在待测样品存在下的结合

      B＝在测定缓冲液存在下的结合

表13  表达在两个不同的大肠杆菌菌株(XL-1 Blue MRF’和HB2151细胞)中的重组hMAb TSHR1 Fab对由TSHR转染的CHO细胞中的cAMP产生的刺激

  样品   培养物上清  液的稀释²  pmol/细  胞孔  平均  值  ×基底³  仅有测定缓冲液¹  0.54  0.49  1  0.44  未转化的XL-Blue MRF’  细胞培养物上清液  10×  0.32  0.33  0.68  0.35  转化的但未诱导的XL-Blue  MRF’细胞培养物上清液  10×  0.52  0.62  1.3  0.73  50×  0.50  0.49  0.99  0.48  转化的且诱导的XL1-Blue  MRF’细胞培养物上清液  10×  ＞6.4  ＞6.4  ＞13.1  ＞6.4  50×  3.5  3.6  7.3  3.6  未转化的HB2151细胞培养物上  清液  10×  0.39  0.37  0.76  0.35  转化的但未诱导的HB2151细胞  培养物上清液  10×  0.29  0.37  0.76  0.45  50×  0.37  0.37  0.76  0.37  转化的且诱导的HB2151细胞培  养物上清液  10×  ＞6.4  ＞6.4  ＞13.1  ＞6.4  50×  ＞6.4  ＞6.4  ＞13.1  ＞6.4

¹测定缓冲液＝含有1g/L葡萄糖、20mmol/L HEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白(BSA)和0.5mmol/L 2-异丁基-1-甲基-黄嘌呤的Hank’s缓冲盐溶液(不含NaCl)，pH7.4

²在测定缓冲液中稀释

³基底＝在仅有测定缓冲液的条件下产生的cAMP

表14  重组hMAb TSHR1 Fab、重组4B4 Fab(一种GAD的人MAb)和重组杂合Fabs(两种Fab的混合HC和LC)对¹²⁵I-TSH结合到TSHR包被的试管上的抑制。在大肠杆菌HB2151细胞中表达。

                            周质成分的测定

  待测样品 周质成分(PF)稀释和(未 稀释PF中的总Fab浓度)  ¹²⁵I-TSH结  合％  抑制  ％1  仅有测定缓冲液  11.5  0  未转化的细胞  4×  8×  (ud)  16×  11.8  11.8  12.2  -2.7  -2.7  -5.9  hMAb TSHR1 HC/LC转化  的但未诱导的细胞  4×  8×  (177ng/mL)  16×  1.6  3.6  6.4  86^a  68  45  hMAb TSHR1 HC/LC  转化的且诱导的细胞  4×  8×  (364ng/mL)  16×  0.95  1.4  2.7  92  88  77  hMAb TSHR1 HC/4B4 LC  转化的但未诱导的细胞  4×  8×  (ud)  16×  12.0  12.1  12.4  -3.9  -4.8  -7.8  hMAb TSHR1 HC/4B4 LC  转化的且诱导的细胞  4×  8×  (83ng/mL)  16×  11.4  11.8  11.7  0.9  -2.1  -1.8  4B4 HC/hMAb TSHR1 LC  转化的但未诱导的细胞  4×  8×  (ud)  16×  11.9  12.2  12.4  -3.5  -6.1  -7.8  4B4 HC/hMAb TSHR1 LC  转化的且诱导的细胞  4×  8×  (850ng/mL)  16×  11.8  11.2  11.9  -2.8  3.1  -3.2  4B4 HC/LC转化的但未诱  导的细胞  4×  8×  (ud)  16×  12.1  12.0  12.1  -5.4  -4.0  -4.8  4B4 HC/LC转化的且诱导  的细胞  4×  8×  (265ng/mL)  16×  11.7  11.7  12.0  -1.2  -1.4  -4.2

¹对结合的抑制用以下公式计算：

其中，A＝在待测样品存在下的¹²⁵I-TSH结合百分比

      B＝在测定缓冲液存在下的¹²⁵I-TSH结合百分比

^a在未诱导的细胞中的TSHR Ab活性的检测是由于启动子的组成活性，它在没有IPTG的条件下提供低水平的Fab表达。

ud＝不可检测

表15  重组hMAb TSHR1 Fab、重组4B4 Fab(一种GAD的人MAb)和重组杂合Fab(两种Fab的混合HC和LC)对¹²⁵I-TSH结合到TSHR包被的试管上的抑制。在大肠杆菌HB2151细胞中表达。

                     培养物上清液的测定

  待测样品 培养物上清液稀释和(未 稀释上清液中的总Fab 浓度)  ¹²⁵I-TSH结  合％  抑制％¹  仅有测定缓冲液  11.1  0  未转化的细胞 4× 8×(ud) 16×  11.8  13.1  11.1  -6.5  -18  -0.3  hMAb TSHR1 HC/LC  转化的但未诱导的细  胞 4× 8×(ud) 16×  10.8  12.1  11.9  2.1  -9.8  -8.1  hMAb TSHR1 HC/LC  转化的且诱导的细胞 4× 8×(421ng/mL) 16×  1.1  1.2  1.1  91  90  90  hMAb TSHR1 HC/4B4  LC转化的但未诱导的  细胞 4× 8×(ud) 16×  11.8  12.5  12.0  -7.0  -13.0  -1.3  hMAb TSHR1 HC/4B4  LC转化的且诱导的细  胞 4× 8×(262ng/mL) 16×  10.8  11.1  11.3  2.7  -0.4  -2.6  4B4 HC/hMAb TSHR1  LC转化的但未诱导的  细胞 4× 8×(ud) 16×  11.9  12.7  11.8  -7.4  -15  -7.0  4B4 HC/hMAb TSHR1  LC转化的且诱导的细  胞 4× 8×(84ng/mL) 16×  10.5  10.8  11.2  4.8  2.4  -0.9  4B4 HC/LC转化的但  未诱导的细胞 4× 8×(ud) 16×  11.9  12.6  12.0  -7.5  -14  -9.0  4B4 HC/LC  转化的且诱导的细胞 4× 8×(522ng/mL) 16×  10.5  11.0  11.0  -4.7  0.7  0.5

¹参见表14的脚注

ud＝不可检测

表16  重组hMAb TSHR1 Fab、重组4B4 Fab(一种GAD的人MAb)和重组杂合Fab(两种Fab的混合HC和LC)对在由TSHR转染的CHO细胞中的环腺苷酸产生的刺激。在大肠杆菌HB2151细胞中表达。

                          培养物上清液的测定

  待测样品¹   培养物上清液的稀释² 和(未稀释上清液中的 总Fab浓度)  pmol  cAMP/  细胞孔  平均pmol  cAMP/细  胞孔  ×基底  刺激³   仅有测定缓冲液¹    0.35  0.25  0.33   0.31    1   未转化的细胞   10× (ud)   0.51  0.67  0.48  0.55   1.8   hMAb TSHR1  HC/LC转化的但未  诱导的细胞 10× (ud)   0.84  1.80  2.13   1.59    5.1^a   hMAb TSHR1  HC/LC转化的且诱  导的细胞 10× (421ng/mL)  ＞6.4  ＞6.4  ＞6.4   ＞6.4    ＞20   hMAb TSHR1  HC/4B4 LC转化的  但未诱导的细胞 10× (ud)   0.55  0.63  0.58  0.59  1.9  hMAb TSHR1  HC/4B4 LC转化的  且诱导的细胞 10× (262ng/mL)  0.47  0.47  0.52   0.48    1.6   4B4 HC/hMAb  TSHR1 LC转化的  但未诱导的细胞 10× (ud)   0.65  0.59  0.60   0.61    2.0   4B4 HC/hMAb  TSHR1 LC转化的  且诱导的细胞 10× (84ng/mL)   0.51  0.37  0.38  0.42    1.4   4B4 HC/LC转化的  但未诱导的细胞  10× (ud)   0.65  0.73  0.64   0.67    2.2   4B4 HC/LC转化的  且诱导的细胞  10× (522ng/mL)   0.55  0.41  0.35   0.44    1.4 

¹测定缓冲液＝含有1g/L葡萄糖、20mmol/L HEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白(BSA)和0.5mmol/L 2-异丁基-1-甲基-黄嘌呤的Hank’s缓冲盐溶液(不含NaCl)，pH7.4

²在测定缓冲液中稀释

³基底＝在仅有测定缓冲液的条件下产生的环腺苷酸

^a在未诱导的细胞中的环腺苷酸刺激活性的检测是由于启动子的组成活性，它在没有IPTG的条件下提供低水平的Fab表达。总重组Fab水平是不能检测到的(检测限＝5ng/mL～10ng/mL)，而对环腺苷酸的刺激的测定可以检测到低至0.3ng/mL的hMAb TSHR1 Fab。

ud＝不可检测

表17  重组hMAb TSHR1 Fab、重组4B4 Fab(一种GAD的人MAb)和重组杂合Fab(两种Fab的混合HC和LC)对在由TSHR转染的CHO细胞中的环腺苷酸产生的刺激。在大肠杆菌HB2151细胞中表达。

                              周质成分的测定

  待测样品 周质成分(PF)稀释² 和(未稀释PF中的总 Fab浓度)  pmol  cAMP/  细胞孔  平均pmol  cAMP/细  胞孔  ×基底  刺激³  仅有测定缓冲液¹  0.35  0.25  0.33   0.31    1   未转化的细胞 10× (ud)  0.31  0.22  0.35   0.29    0.9   hMAb TSHR1  HC/LC转化的但未  诱导的细胞 10× (177ng/mL)   ＞6.4  ＞6.4  ＞6.4   ＞6.4    ＞20.6^a   hMAb TSHR1  HC/LC转化的且诱  导的细胞 10× (364ng/mL)  ＞6.4  ＞6.4  -   ＞6.4   ＞20.6  hMAb TSHR1  HC/4B4 LC转化的  但未诱导的细胞 10× (ud)  0.40  0.33  0.33   0.35   1.1   hMAb TSHR1  HC/4B4 LC转化的  且诱导的细胞 10× (83ng/mL)  0.31  0.31  0.41   0.34   1.1  4B4 HC/hMAb  TSHR1 LC转化的  但未诱导的细胞 10× (ud)  0.29  0.31  0.29   0.30   1.0  4B4 HC/hMAb  TSHR1 LC转化的  且诱导的细胞 10× (850ng/mL)  0.23  0.25  0.24   0.24   0.8  4B4 HC/LC转化的  但未诱导的细胞 10× (ud)  0.33  0.35  0.29  0.32   1.0  4B4 HC/LC转化的  且诱导的细胞 10× (265ng/mL)  0.40  0.38  0.32   0.37   1.2  hMAb TSHR1 IgG  1ng/ml  (杂交瘤产生的)  2.0  2.0  2.0   2.0   6.4

ud＝不可检测；^1，2，3参见表16的脚注。

^a在未诱导的细胞中的TSHR Ab活性的检测是由于启动子的组成活性，它在没有IPTG的条件下提供了低水平的表达。

表18  重组hMAb TSHR1 Fab、重组4B4 Fab和重组杂合Fab(两种Fab的混合HC和LC)对4B4 IgG(一种由杂交瘤产生的GAD的人MAb)结合到¹²⁵I-GAD上的抑制。在大肠杆菌HB2151细胞中表达。

                        周质成分的测定

添加了4B4 IgG和¹²⁵I-GAD的待测样品 周质成分(PF)稀释² 和(未稀释PF中的总 Fab浓度)  ¹²⁵I-GAD  结合(％)  抑制  (％)¹GAD Ab测定缓冲液  28  04B4F(ab′)₂  1μg/ml(杂交瘤      0.1μg/ml产生的)      0.01μg/ml             0.001μg/ml  5.5  12  24  29  80  57  14  -3.9未转化的细胞 4× 8×(ud) 16×  27  28  29  0.9  -1.7  -6.3hMAb TSHR1 HC/LC转化的但未诱导的细胞 4× 8×(177ng/mL) 16×  28  28  28  -2.6  -0.5  -0.8hMAb TSHR1 HC/LC转化的且诱导的细胞 4× 8×(364ng/mL) 16×  27  27  29  0.7  1.4  -4.2hMAb TSHR1 HC/4B4 LC转化的但未诱导的细胞 4× 8×(ud) 16×  28  28  27  -1.1  -0.2  1.1hMAb TSHR1 HC/4B4 LC转化的且诱导的细胞 4× 8×(83ng/mL) 16×  28  28  28  -1.4  -0.7  -2.44B4 HC/hMAb TSHR1 LC转化的但未诱导的细胞 4× 8×(ud) 16×  28  28  28  -2.9  -3.2  -3.14B4 HC/hMAb TSHR1 LC转化的且诱导的细胞 4× 8×(850ng/mL) 16×  27  28  28  1.7  -0.2  -1.04B4 HC/LC转化的但未诱导的细胞 4× 8×(ud) 16×  29  28  27  -4.4  -1.5  1.74B4 HC/LC转化的且诱导的细胞 4× 8×(265ng/mL) 16×  21  24  26  23.2  12.5  5.6

¹对结合的抑制用以下公式计算：

其中，A＝在待测样品存在下的¹²⁵I-GAD结合

      B＝在测定缓冲液存在下的¹²⁵I-GAD结合

ud＝不可检测

表19  重组hMAb TSHR1 Fab、重组4B4 Fab和重组杂合Fab(两种Fab的混合HC和LC)对4B4 IgG(一种由杂交瘤产生的GAD的人MAb)结合到¹²⁵I-GAD上的抑制。在大肠杆菌HB2151细胞中表达。

                        培养物上清液的测定

  添加了4B4 IgG和¹²⁵I-GAD  的待测样品  培养物上清液稀释和  (未稀释上清液中的  总Fab浓度)  ¹²⁵I-GAD  结合(％)  抑制  (％)¹  测定缓冲液  26  0  4B4F(ab′)₂  1μg/ml  (杂交瘤      0.1μg/ml  产生的)      0.01μg/ml               0.001μg/ml  5.2  11  22  28  80  58  15  -5.2  未转化的HB2151细胞  4×  8×(ud)  16×  28  29  28  -5.5  -9.1  -6.3  hMAb TSHR1 HC/LC转化  的但未诱导的细胞  4×  8×(ud)  16×  28  29  28  -7.0  -9.5  -5.2  hMAb TSHR1 HC/LC转化  的且诱导的细胞  4×  8×(421ng/mL)  16×  28  28  28  -7.0  -6.4  -5.6  hMAb TSHR1 HC/4B4 LC  转化的但未诱导的细胞  4×  8×(ud)  16×  29  29  28  -9.0  -7.9  -7.6  hMAb TSHR1 HC/4B4 LC  转化的且诱导的细胞  4×  8×(262ng/mL)  16×  27  28  28  -2.2  -5.5  -5.1  4B4 HC/hMAb TSHR1 LC  转化的但未诱导的细胞  4×  8×(ud)  16×  28  28  28  -4.4  -7.0  -5.5  4B4 HC/hMAb TSHR1 LC  转化的且诱导的细胞  4×  8×(84ng/mL)  16×  27  28  27  -2.0  -5.7  -2.5  4B4 HC/LC转化的但未诱导  的细胞  4×  8×(ud)  16×  28  28  27  -4.8  -4.8  -1.7  4B4 HC/LC转化的且诱导的  细胞  4×  8×(522ng/mL)  16×  11  14  17  59  46  34

¹参见表18脚注

ud＝不可检测

表20  TSHR的鼠单克隆抗体对表达TSHR的CHO细胞中的对环腺苷酸生产的刺激的影响，所述刺激由hMAb TSHR1所诱导

  待测样品¹  pmol cAMP/  细胞孔  平均pmol  cAMP/细胞孔  SD(标  准差)  ×基底  刺激²  hMAb TSHR1 Fab  (5ng/mL)加上：  (a)测定缓冲液¹  3.252  2.418   2.835   -   3.9  (b)2G2³  4.278  3.392  3.116   3.595   0.496   4.9  (c)2B4⁴  3.320  2.632  2.864   2.939   0.286   4.0  (d)9D33⁴  0.506  0.394  0.428   0.443   0.047   0.61  仅有测定缓冲液¹  0.696  0.742  0.742   0.727   0.02   1  仅有2G2³  0.252  0.306  0.376   0.311   0.051   0.43  仅有2B4⁴  0.298  0.318  0.376   0.331   0.033   0.46  仅有9D33⁴  0.280  0.318  0.340   0.313   0.025   0.43

¹全部稀释都在测定缓冲液中完成(该测定缓冲液＝含有1g/L葡萄糖、20mmol/L HEPES、222mmol/L蔗糖、15g/L牛血清白蛋白(BSA)和0.5mmol/L 2-异丁基-1-甲基-黄嘌呤的Hank’s缓冲盐溶液(不含NaCl)，pH7.4)

²基底＝在仅有测定缓冲液的条件下的环腺苷酸产生

³2G2是甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(100μg/mL的IgG制备物)

⁴2B4和9D33是TSHR的鼠单克隆抗体(100μg/mL的IgG制备物)

表21  TSHR的鼠单克隆抗体对表达TSHR的CHO细胞中的对cAMP产生的刺激的影响，所述刺激由pTSH所诱导

  待测样品¹  pmol CAMP/  细胞孔  平均pmol  cAMP/细胞孔  SD  ×基底  刺激²  pTSH(0.5ng/mL)  加上：  (a)测定缓冲液¹  4.016  2.746  4.960   3.91   0.91   11.5  (b)2B4⁴  0.878  0.710  0.742   0.78   0.07   2.3  (c)9D33⁴  0.436  0.436  0.410   0.43   0.01   1.3  仅有测定缓冲液¹  0.384  0.318  0.318   0.34   0.03   1  仅有2B4⁴  0.446  0.486  0.552   0.49   0.04   1.4  仅有9D33⁴  0.332  0.362  0.304   0.33   0.02   0.97

^1，2，4参见表20的脚注。在一个单独的实验中，作为对照的甲状腺球蛋白的鼠MAb(2G2 IgG 100μg/mL)显示对pTSH(0.5ng/mL)刺激环腺苷酸产生没有影响(pTSH加上测定缓冲液＝12.7×基底；pTSH加上2G2＝11.7×基底)。

表22  不同MAb对¹²⁵I-TSH、¹²⁵I-hMAb TSHR1或¹²⁵I-9D33结合到TSHR包被的试管上的抑制

  待测IgG和浓度  (μg/mL)¹  对¹²⁵I-TSH  结合的抑制  对¹²⁵I-hMAb  TSHR1结合  的抑制  对¹²⁵I-9D33  结合的抑制  9D33 IgG  0.001  0.01  0.1  1  10  0  17  34  58  68  0  3  21  44  56  4  9  35  64  71  2B4 IgG  0.001  0.01  0.1  1  10  15  36  62  83  85  0  0  0  11  18  4  5  15  22  22  hMAb  TSHR1 IgG  0.001  0.01  0.1  1  10  13  60  89  94  95  41  70  88  93  94  1.1  18  72  90  93

¹所有稀释均在健康献血者血清池中(HBD池)

²对结合的抑制用以下公式计算：

其中，A＝在待测样品存在下的结合百分比

      B＝在HBD池存在下的结合百分比

作为对照的甲状腺球蛋白的鼠MAb(2G2 0.001μg/mL～100μg/mL)对标记的TSH、hMAb TSHR1或9D33的结合没有影响

表23  患者血清对¹²⁵I-9D33和¹²⁵I-TSH结合到TSHR包被的试管上的影响

  待测血清¹  结合的¹²⁵I-9D33(所  加入的总计数％)  对¹²⁵I-9D33结  合的抑制(％)²  对¹²⁵I-TSH结合  的抑制(％)²  HBD池  11  0  0  G1  2.2  79  90  G2  4.3  74  59  G3  3.2  69  78  G4  5.8  45  50  G5  4.0  62  78  G6  5.1  67  51  G7  5.9  44  74  G8  2.6  75  82  G9  2.0  81  90  G10  5.5  48  62  G11  3.1  62  59  G12  4.0  43  51  G13  6.0  50  59  G14  5.3  71  80  G15  3.1  77  98  G16  2.4  80  93  G17  2.1  84  94  G18  1.7  73  83  G19  2.9  80  94  G20  2.1  71  80  A1  10  1.9  0  A2  10  2.3  0  D1  11  0  0  D2  10  4.5  0  N1  12  -15  6.7  N2  7.9  25  4.1  N3  11  0  6.3  N4  11  -5.0  6.5  N5  9.1  14  6.3  N6  11  -2.1  7.2  N7  14  -37  -1.4  N8  11  -2.1  5.9  N9  12  -9.8  6.7

¹HBD池＝健康献血者血清池

G1～G20是来自突眼性甲状腺肿患者的血清

D1和D2来自1型糖尿病患者(对谷氨酸脱羧酶自身抗体呈阳性)

A1和A2来自阿狄森氏病患者(对类固醇21-羟化酶自身抗体呈阳性)

N1～N9来自单个健康献血者

²对结合的抑制用以下公式计算：

其中，A＝在测试血清存在下的结合百分比

      B＝在健康献血者血清池存在下的结合百分比

表24  具有TSH激动剂和TSH拮抗剂活性的患者血清对¹²⁵I-9D33结合到TSHR包被的试管上的影响

  待测样品和稀释¹结合的¹²⁵I-9D33(所加入的总计数％)对¹²⁵I-9D33结合的抑制(％)²  HBD池  11  0  血清A    1∶320  6.4  39           1∶160  4.7  55           1∶80  3.3  69           1∶40  2.8  73           1∶20  2.4  77           1∶10  2.0  82  血清B    1∶320  9.1  13           1∶160  8.3  21           1∶80  6.4  39           1∶40  4.9  53           1∶20  3.8  64           1∶10  2.5  76  血清C    1∶320  9.7  7.6           1∶160  8.9  15           1∶80  8.0  24           1∶40  6.3  40           1∶20  5.1  51           1∶10  3.7  65  血清D    1∶320  9.4  11           1∶160  8.2  22           1∶80  7.2  32           1∶40  5.2  51           1∶20  4.3  59           1∶10  3.3  69

¹HBD池＝健康献血者血清池，待测血清在该池中稀释

血清A和B具有TSH拮抗剂活性

血清C和D具有TSH激动剂活性

²对结合的抑制利用表23中所用的公式进行计算

表25  NIBSC90/672对¹²⁵I-9D33和¹²⁵I-TSH结合到TSHR包被的试管上的影响

  90/672的  浓度1  结合的¹²⁵I-9D33(所  加入的总计数％)  对¹²⁵I-9D33结合  的抑制(％)²  对¹²⁵I-TSH结合  的抑制(％)²  40U/L  4.1  72  92  8U/L  7.1  52  68  2U/L  11  28  23  1U/L  13  10  12  0U/L  15  0  0

¹90/672稀释在健康献血者血清池中

²对结合的抑制利用表23中所用的公式进行计算

表26  来自用hMAb TSHR1 Fab免疫的鼠的血清中的多克隆hMAbTSHR1抗独特型抗体对¹²⁵I-hMAb TSHR1 Fab结合到TSHR包被的试管上的抑制

  待测样品  待测样品的稀释¹  对¹²⁵I-hMAb TSHR1  Fab结合到TSHR上  的抑制(％)²  测定缓冲液  0  来自用hMAb  TSHR1 Fab免疫的  鼠的血清  1∶100000  1∶50000  1∶10000  1∶5000  1∶1000  1.3  7.9  49.8  73.0  94.8  未免疫的鼠的血清  1∶500  -0.8

¹待测样品稀释在测定缓冲液中。在测定缓冲液存在下的结合为43％

²对结合的抑制用以下公式计算：

其中，A＝在待测样品存在下的¹²⁵I-hMAb TSHR1结合百分比

      B＝在测定缓冲液存在下的¹²⁵I-hMAb TSHR1结合百分比

表27  鼠单克隆抗特异型抗体7E51 IgG对¹²⁵I-hMAb TSHR1 Fab结合到TSHR包被的试管上的抑制

  待测样品  ¹²⁵I-hMAb  TSHR1 Fab与  TSHR的结合％  对¹²⁵I-hMAb  TSHR1 Fab结  合的抑制％¹  仅有测定缓冲液  16.3  0  稀释在测定   1μg/mL  缓冲液中的   10μg/mL  7E51 IgG     100μg/mL  14.5  6.4  1.7  11.0  60.7  89.4

¹参见表26的脚注

                                  序列表

<110>RSR有限公司

<120>促甲状腺素受体的抗体及其用途

<130>FCI05GB0399

<150>GB 0227964.4

<151>2002-11-29

<150>GB 0302140.9

<151>2003-01-29

<150>GB 0315147.9

<151>2003-06-27

<160>38

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>121

<212>PRT

<213>人(human)

<400>1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1               5                   10                  15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Arg Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe

    50                   55                 60

Lys Gly His Val Thr Val Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Glu Pro Gly Tyr Ser Ser Thr Trp Ser Val Asn Trp Gly

            100                 105                 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

        115                 120

<210>2

<211>5

<212>PRT

<213>人

<400>2

Ser Tyr Trp Ile Asn

1               5

<210>3

<211>17

<212>PRT

<213>人

<400>3

Arg Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>人

<400>4

Leu Glu Pro Gly Tyr Ser Ser Thr Trp Ser Val Asn

1               5                   10

<210>5

<211>131

<212>PRT

<213>人

<400>5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1               5                   10                  15

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Arg Gly Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr

            20                  25                  30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

        35                  40                  45

Gly Arg Ile Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe

    50                  55                  60

Lys Gly His Val Thr Val Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ala Arg Leu Glu Pro Gly Tyr Ser Ser Thr Trp Ser Val Asn Trp Gly

            100                 105                 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

        115                 120                 125

Val Phe Pro

    130

<210>6

<211>111

<212>PRT

<213>人

<400>6

Leu Thr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Arg Gln

1               5                   10                  15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn

            20                  25                  30

Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

        35                  40                  45

Ile Tyr Tyr Asp Asp Gln Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Arg Gly Leu Gln

65                  70                  75                  80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Trp Asp Asp Ser Leu

                85                  90                  95

Asp Ser Gln Leu Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu Gly

            100                 105                 110

<210>7

<211>13

<212>PRT

<213>人

<400>7

Ser Gly Asn Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Asn

1               5                   10

<210>8

<211>7

<212>PRT

<213>人

<400>8

Tyr Asp Asp Gln Leu Pro Ser

1               5

<210>9

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>9

Thr Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asp Ser Gln Leu

1               5                   10

<210>10

<211>363

<212>DNA

<213>人

<400>10

caaatgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc     60

tcctgtaggg gttctggata caggtttacc agctactgga tcaactgggt gcgccagctg    120

cccgggaaag gcctagagtg gatgggcagg attgatccta ctgactctta taccaactac    180

agtccatcct tcaaaggcca cgtcaccgtc tcagctgaca agtccatcaa cactgcctac    240

ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accggcatgt attactgtgc gaggctcgaa    300

ccgggctata gcagcacctg gtccgtaaat tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc    360

tca                                                                  363

<210>11

<211>15

<212>DNA

<213>人

<400>11

agctactgga tcaac                                                      15

<210>12

<211>51

<212>DNA

<213>人

<400>12

aggattgatc ctactgactc ttataccaac tacagtccat ccttcaaagg c              51

<210>13

<211>36

<212>DNA

<213>人

<400>13

ctcgaaccgg gctatagcag cacctggtcc gtaaat                               36

<210>14

<211>394

<212>DNA

<213>人

<400>14

caaatgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc     60

tcctgtaggg gttctggata caggtttacc agctactgga tcaactgggt gcgccagctg    120

cccgggaaag gcctagagtg gatgggcagg attgatccta ctgactctta taccaactac    180

agtccatcct tcaaaggcca cgtcaccgtc tcagctgaca agtccatcaa cactgcctac    240

ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accggcatgt attactgtgc gaggctcgaa    300

ccgggctata gcagcacctg gtccgtaaat tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc    360

tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccc                                394

<210>15

<211>333

<212>DNA

<213>人

<400>15

ctgcctgtgc tgactcagcc accctcggtg tctggagccc ccaggcagag ggtcaccatc     60

tcctgttctg gaaacagctc caacatcgga aataatgctg taaactggta ccagcagctc    120

ccaggaaagg ctcccaaact cctcatttat tatgatgatc aactgccctc aggggtctct    180

gaccgattct ctggctccag gtctggcacc tccgcctccc tggccatccg tgggctccag    240

tctgaggatg aggctgatta ttactgtaca tcatgggatg acagcctgga tagtcaactg    300

ttcggcggag ggaccaggct gaccgtccta ggt                                 333

<210>16

<211>39

<212>DNA

<213>人

<400>16

tctggaaaca gctccaacat cggaaataat gctgtaaac                            39

<210>17

<211>21

<212>DNA

<213>人

<400>17

tatgatgatc aactgccctc a                                               21

<210>18

<211>33

<212>DNA

<213>人

<400>18

acatcatggg atgacagcct ggatagtcaa ctg                                  33

<210>19

<211>119

<212>PRT

<213>鼠(mouse)

<400>19

Asp Val Gln Ile Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

            20                  25                  30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ser Arg Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

        115

<210>20

<211>5

<212>PRT

<213>鼠

<400>20

Thr Tyr Trp Met His

1               5

<210>21

<211>17

<212>PRT

<213>鼠

<400>21

Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1               5                   10                  15

Gly

<210>22

<211>10

<212>PRT

<213>鼠

<400>22

Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1               5                   10

<210>23

<211>124

<212>PRT

<213>鼠

<400>23

Asp Val Gln Ile Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1               5                   10                  15

Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

            20                  25                  30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

        35                  40                  45

Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

    50                  55                  60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65                  70                  75                  80

Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

                85                  90                  95

Ser Arg Asn Tyr Gly Ser Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

            100                 105                 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro

        115                 120

<210>24

<211>106

<212>PRT

<213>鼠

<400>24

Gly Val Glu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

            100                 105

<210>25

<211>10

<212>PRT

<213>鼠

<400>25

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1               5                   10

<210>26

<211>7

<212>PRT

<213>鼠

<400>26

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1               5

<210>27

<211>9

<212>PRT

<213>鼠

<400>27

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr

1               5

<210>28

<211>110

<212>PRT

<213>鼠

<400>28

Gly Val Glu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

            20                  25                  30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

        35                  40                  45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

    50                  55                  60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Thr Glu

65                  70                  75                  80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr

                85                  90                  95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Leu Met Leu

            100                 105                 110

<210>29

<211>357

<212>DNA

<213>鼠

<400>29

gacgtccaga tccagcagcc tgggactgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgagactg     60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc acctactgga tgcactgggt gaagcagagg    120

cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tactaactat    180

aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac    240

atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aagaaactac    300

ggtagtggct actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca       357

<210>30

<211>15

<212>DNA

<213>鼠

<400>30

acctactgga tgcac                                                      15

<210>31

<211>51

<212>DNA

<213>鼠

<400>31

gagattgatc cttctgatag ttatactaac tataatcaaa agttcaaggg c              51

<210>32

<211>30

<212>DNA

<213>鼠

<400>32

aactacggta gtggctacta ctttgactac                                      30

<210>33

<211>373

<212>DNA

<213>鼠

<400>33

gacgtccaga tccagcagcc tgggactgag cttgtgaagc ctggggcttc agtgagactg     60

tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc acctactgga tgcactgggt gaagcagagg    120

cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tactaactat    180

aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca aatcctccag cacagcctac    240

atgcacctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgttc aagaaactac    300

ggtagtggct actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctcagcc    360

aaaacaacac ccc                                                       373

<210>34

<211>318

<212>DNA

<213>鼠

<400>34

ggcgttgaga tgacacagtc gccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc     60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc    120

acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc    180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggagactgaa    240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgtggacgtt cggtggaggc    300

accaaactgg aaatcaaa                                                  318

<210>35

<211>30

<212>DNA

<213>鼠

<400>35

agtgccagct caagtgtaag ttacatgcac                                      30

<210>36

<211>21

<212>DNA

<213>鼠

<400>36

gacacatcca aactggcttc t                                               21

<210>37

<211>27

<212>DNA

<213>鼠

<400>37

cagcagtgga gtagtaaccc gtggacg                                         27

<210>38

<211>331

<212>DNA

<213>鼠

<400>38

ggcgttgaga tgacacagtc gccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc     60

atgacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc    120

acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc    180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggagactgaa    240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgtggacgtt cggtggaggc    300

accaaactgg aaatcaaacg gctgatgctg c                                   331