提高醋酸细菌温度耐受性的基因、利用该基因培育的醋酸细菌以及利用该醋酸细菌生产醋的方法

摘要

本发明意在提供一种来源于醋酸细菌的新基因，它涉及温度耐受性；一种利用以上基因提高微生物，特别是一种醋酸细菌的温度耐受性的方法；以及一种利用温度耐受性得到提高的醋酸细菌有效生产具有较高醋酸浓度的醋的方法。在本发明中，从醋酸细菌的染色体DNA文库中，通过使用一种获得基因的方法从属于葡糖酸醋酸杆菌属的实用的醋酸细菌中克隆一种涉及温度耐受性的新基因，所述基因具有即使在通常不能生长的条件下也使生长成为可能的功能。另外，在将该基因导入醋酸细菌内的转化子中，温度耐受性显著提高，并且当转化子在乙醇存在的情况下进行通气搅拌培养时，最终的醋酸浓度可以显著提高。

说明书

技术领域

本发明涉及一种编码源自微生物的具有提高温度耐受性的蛋白质的基因，一种该基因的拷贝数得到扩增的微生物，特别是一种属于醋酸杆菌属(Acetobacter)或葡糖酸醋酸杆菌属(Gluconacetobacter)的醋酸细菌，以及一种通过利用这种微生物有效生产含有高浓度醋酸的醋的方法。

背景技术

在醋的工业生产中，利用微生物进行醋酸发酵。这些微生物具有乙醇氧化能力并且一般称为醋酸细菌。在醋酸细菌中，特别是属于醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸细菌被广泛用作工业醋酸发酵。

在醋酸发酵中，培养基中的乙醇被被醋酸细菌氧化并且转化为醋酸，结果，醋酸直接在培养基中积累。此时，产生大量的发酵热，结果，当不采取措施时发酵液中的温度升高。对于醋酸细菌来说最佳的发酵温度一般是30℃左右，所以，必须冷却发酵液以便不升高其温度，这导致需要能量进行冷却。因此，在醋酸发酵中需要生长能力和发酵能力即使在较高的温度下也不降低，即需要发展具有强温度耐受性的醋酸细菌。作为一种手段已经尝试过通过从自然界中筛选具有温度耐受性的醋酸细菌来寻找温度耐受的醋酸细菌(见，例如，非专利文献1)。

但是，很少发现对于醋酸细菌的温度耐受基因，希望获得一种编码具有能够在实践水平上提高醋酸细菌温度耐受性的功能的蛋白质的基因并且利用获得的温度耐受基因培育具有较强温度耐受性的醋酸细菌。

专利文献1

日本专利申请公开号60-9488

专利文献2

日本专利申请号2003-350265

非专利文献1

Agricultural and Biological Chemistry，44卷，2901-2906页，1980

非专利文献2

Trends in Genetics，5卷，185-189页，1989

非专利文献3

Applied and Environmental Microbiology，55卷，171-176页，1989

非专利文献4

Agricultural and Biological Chemistry，52卷，3125-3129页，1988

非专利文献5

Agricultural and Biological Chemistry，49卷，2091-2097页，1985

非专利文献6

Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，58卷，974-975页，1994

非专利文献7

Cellulose，153-158页，1989

非专利文献8

Journal of Bacteriology，175卷，6857-6866页，1993

本发明要解决的技术问题

如上所述，在此之前没有在遗传水平上阐明醋酸细菌的温度耐受性并且成功开发具有高度温度耐受性的实用性醋酸细菌的例子。但是，开发较高温度耐受性的醋酸细菌将允许在比常规更高的温度下进行醋酸发酵并且减少冷却的成本。所以，本发明人再次尝试在遗传水平上阐明提高醋酸细菌的温度耐受性。

作为从各方面考虑的结果，以及从这样的观点来看，即获得一种编码在实践水平上具有提高温度耐受性的功能的蛋白质的新型温度耐受基因，并且利用获得的温度耐受基因培育具有较强温度耐受性的醋酸细菌是重要的，本发明人新近设定了新的技术任务以提供一种新基因来提高温度耐受性，所述基因涉及温度耐受性并且源自醋酸细菌的微生物，并且提供一种通过利用该基因提高微生物的温度耐受性的方法，特别是一种提高属于醋酸细菌的微生物的温度耐受性的方法，进一步提供一种通过利用温度耐受性得到提高的醋酸细菌来有效生产醋的方法。

本发明人假定一种不存在于其它微生物中的涉及温度耐受性的特定基因存在于醋酸细菌中，所述醋酸细菌即使在高温下也能够生长和发酵，并且获得一种新的观念，即利用这种基因将允许比以往更有效地提高微生物的温度耐受性并且开发出一种有效的生产方法。

作为获得温度耐受基因的常规方法，常用一种筛选温度钝性突变体的方法。

但是，考虑到通过这种方法发现一种工业上有用的温度耐受基因是困难的，本发明了研究了其它获得方法。结果，通过构建醋酸细菌的染色体DNA文库，用这种染色体DNA文库转化醋酸细菌，筛选靶基因，发明人开发了一种获得基因的方法，所述基因使得一般仅在37℃左右生长于琼脂糖培养基上的醋酸细菌能够在38℃的温度下生长。

依照这种方法，本发明人首次成功克隆了编码一种新的温度耐受基因的DNA，所述温度耐受基因来自实践中用于生产醋中的葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸细菌，它具有在实践水平上提高温度耐受性的功能。

获得的温度耐受基因与一组在豆科植物细菌(leguminous bacteria)等中发现的称为酰基鞘氨醇葡糖转移酶的蛋白质显示同源性，作为在DDBJ/EMBL/Genbank中同源性检索的结果，推测它为一种编码酰基鞘氨醇葡糖转移酶的基因。

但是，获得的醋酸细菌的酰基鞘氨醇葡糖转移酶基因与在其它微生物如豆科植物细菌中发现的已知酰基鞘氨醇葡糖转移酶基因具有极低的同源性。所以，尽管它与其它酰基鞘氨醇葡糖转移酶基因在某种程度上相似，但获得的基因为一种醋酸细菌特异的编码一种新的蛋白质(有时称之为蛋白质GCS)的新基因。

此外，本发明人发现转化子在乙醇存在时进行通风培养的情况下，温度耐受性显著提高，最终的醋酸浓度可以显著提高等等，并且进一步成功测定了蛋白质的氨基酸序列和编码该蛋白质的基因的DNA的核苷酸序列，由此完成本发明。

附图简述

图1是显示通过利用限制酶Sal和Kpn的源自克隆的Gluconacetobacter entanii的基因片段(pG1)的限制性酶切图谱，GCS基因的定位以及pGCS和pGCS1的插入片段的示意图。

图2是显示转化子的醋酸发酵时间过程的图，其中GCS基因的拷贝数得到扩增。

图3是显示转化子的醋酸发酵时间过程的图，其中GCS基因的拷贝数得到扩增。

图4是显示由GCS基因编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的图。

图5是显示引物1的图。

图6是显示引物2的图。

图7是显示本发明的温度耐受基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)的图。

图8是显示pGI18的构建的图。

图9是显示pGI18的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)的图。

图10是显示由图9所示pGI18的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)的图的续。

图11是显示由图10所示pGI18的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)的图的续。

图12是显示引物A的图。

图13是显示引物B的图。

发明内容

即，本发明提供下列(1)到(10)作为实施方案的实施例。

(1)一种如下(A)或(B)所示的蛋白质GCS：

(A)一种具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质，

(B)一种由序列表SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入、添加或倒位一个或几个氨基酸所得的氨基酸序列组成的，并且具有提高温度耐受性的功能的蛋白质。

(2)一种编码如下(A)或(B)所示的蛋白质的新基因的DNA：

(A)一种具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质，

(B)一种由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入、添加或倒位一个或几个氨基酸所得的氨基酸序列组成的，并且具有提高温度耐受性的功能的蛋白质。

(3)上述(2)中所述基因的DNA，它是如下(a)或(b)所示的DNA：

(a)一种DNA，它包含由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的第73到1251位核苷酸组成的核苷酸序列，

(b)一种DNA，它与包含由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中的第73到1251位核苷酸组成的核苷酸序列的探针或其部分在严格条件下杂交，并且编码一种具有提高温度耐受性功能的蛋白质。

(4)一种微生物，它的温度耐受性通过扩增上述(2)或(3)中所述的DNA的细胞内拷贝数而得以提高。

(5)上述(4)中所述的微生物，其特征在于该微生物是一种属于醋酸杆菌属(Acetobacter)或葡糖酸醋酸杆菌属(Gluconacetobacter)的醋酸细菌。

(6)一种生产醋的方法，其特征在于在含乙醇的培养基中培养上述(4)或(5)中所述的微生物中的具有乙醇氧化能力的微生物，由此即使在高培养温度下也能生产并在培养基中积累醋酸。

(7)一种重组质粒pUCGCS(FERM BP-8217)，至少包括根据权利要求(2)或(3)的DNA。

(8)一种重组质粒pG1或pGCS，它通过分别将下述PCR扩增片段插入到例如醋酸细菌-大肠杆菌(Escherichia coil)穿梭质粒pGI18(见，例如，专利文献2)而不是如(7)中的大肠杆菌载体pT7Blue而获得，所述PCR扩增片段包含至少一种具有在序列表SEQ.ID No.1中所示的核酸序列(SalI-KpnI片段)或其编码区(第73到1251位核苷酸)。

(9)一种转化子，它通过将重组质粒pG1或pGCS导入醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)No.1023(FERM BP-2287)而获得。

(10)一种转化子，它通过将重组质粒pG1或pGCS导入Acetobacteraltoacetigenes MH-24(FERM BP-491)而获得。

根据本发明，对于一种微生物能够提供和增强对温度的耐受性。而且，在具有乙醇氧化能力的微生物中，特别是在醋酸细菌中，能够明显提高对温度的耐受性并且能够提供即使在高温下也能有效积累醋酸的能力。

实施本发明的最佳方式

下面，将对本发明进行详细描述。

本发明的DNA

本发明的DNA包含一种能够种编码具有提高温度耐受性的功能并且含有如序列表SEQ.ID No.2中所示氨基酸序列的蛋白质的核酸序列，它包含调节核酸序列的元件和该基因的结构部分。更详细地说，本发明涉及一种温度耐受基因，该温度耐受基因意为涉及温度耐受性和/或提高温度耐受性的基因。更具体地，该基因包含至少一种选自至少(i)具有序列表SEQ ID NO.1中所示核苷酸序列的DNA和(ii)包括在(i)中的并且编码GCS蛋白的基因(GCS基因)的核苷酸序列。

本发明的DNA可以通过本领域技术人员已知的方法进行制备。例如，这里在具体的核苷酸序列中所示的DNA可以通过，例如，使用醋酸细菌的染色体作为起始材料的鸟枪克隆进行制备。此时，根据其大小等将每个片段化的染色体DNA连接到适当的克隆载体如质粒载体或噬菌体载体上，并且通过合适的方法如电转化将这种载体转化到适当的宿主细胞如醋酸细菌中，由此可以制备克隆每一个染色体DNA片段的克隆文库。

另外，从这样的克隆文库中获得的每个染色体DNA片段的核苷酸序列的测定可以按照例已知的方法如化学降解法(Maxam-Gilbert方法)或双脱氧法来进行。

或者，本发明的DNA可以通过为本领域技术人员熟知的化学合成或使用基于本发明DNA的核苷酸序列或本文所述的氨基酸序列信息的引物采用PCR方法进行扩增来制备。

例如，本发明的DNA可以如下从Gluconacetobacter entanii的染色体DNA中获得。首先，获得Gluconacetobacter entanii，例如Acetobacteraltoacetigenes MH-24菌株(FERMBP-491)的染色体DNA。染色体DNA可以通过例如日本专利申请公开号NO.60-9489公开的方法获得。

其次，制备染色体DNA文库以从获得的染色体DNA中分离提高温度耐受性的基因。开始，用合适的限制酶对染色体DNA进行部分消化以获得各种染色体DNA片段混合物。对于限制酶，可以使用各种限制酶，并且酶切的程度可以通过根据所用的酶调节酶切反应时间进行控制。例如，染色体DNA在温度30℃或更高，优选为37℃，在不同时间段(1分钟到2小时)以1到10单位/ml的酶浓度通过Sau3AI的作用进行消化。同时，在下面提到的例子中使用SalI和KpnI。

随后，将染色体DNA的消化片段连接到能够在醋酸细菌中自主复制的载体DNA上。具体地，在37℃的温度和1-100单位/ml的酶浓度下通过限制酶的作用将该载体DNA完全消化1小时或更长，它产生与用于消化染色体DNA的限制酶，如SalI和KpnI互补的末端核苷酸序列。

将消化的载体DNA与染色体DNA片段混合物相混合，随后通过T4DNA连接酶的作用可以获得目标重组DNA(DNA文库)。偶而，T4DNA连接酶作用的条件可以设定于，例如，4-16℃的温度和1-100单位/ml的酶浓度持续1小时或更长，优选6到24小时。

利用获得的重组DNA，转化一种通常只能在37℃生长于琼脂糖培养基上的醋酸细菌No.1023(FERM BP-2287)并且在38℃进行培养。将形成的菌落接种到液体培养基中进行培养，随后从获得的细菌细胞中回收质粒，可以获得一种包括温度耐受基因的DNA片段。

关于本发明的DNA，具体例示包含序列表SEQ ID No.1中所示核苷酸序列的DNA，其中该核苷酸序列中第73-1251位核苷酸所组成的核苷酸序列是编码区。

作为在DDBJ/EMBL/Genbank和SWISS-PROT/PIR上关于SEQ IDNo.1中所示的核苷酸序列和SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列(图4：对应于第73-1251位核苷酸)的同源性检索的结果，发现它们在氨基酸水平显示与Mesorhizobium loti的神经酰胺糖基转移酶基因有41％的同源性并且与根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的神经酰胺糖基转移酶基因有39％的同源性，但是每个同源性都是低的(40％左右)，所以，显然这是一种新基因并且不同于编码这些蛋白质的基因。此外，完全不知道上面提及的神经酰胺糖基转移酶基因涉及温度耐受性。

本发明的DNA的核苷酸序列，例如，本发明的DNA还可以通过利用醋酸细菌的基因组DNA作为模板，在该核苷酸序列基因基础上合成的寡核苷酸作为引物的聚合酶链式反应(PCR反应)，或通过在该核苷酸基础上合成的寡核苷酸作为探针进行杂交等来获得。

关于寡核苷酸的合成，它可以例如利用商业上现有的各种DNA合成仪以常规方式进行合成。此外，可以利用Applied Biosystems生产的热循环仪基因扩增PCR系统9700和Taq DNA聚合酶(宝酒造公司生产生产)、KOD-Plus(东洋纺织公司生产)等以常规方式进行PCR反应。

关于编码具有提高温度耐受性功能的本发明的蛋白质的DNA，它可以是一种编码蛋白质的DNA，在所述蛋白质中于一个或几个位点上缺失、取代、插入或添加了一个或几个氨基酸，只要编码蛋白质的提高温度耐受性的功能不受损害。

编码一种与这种具有提高温度耐受性功能的蛋白质基本上相同的蛋白质的DNA还可以例如利用位点特异性诱变剂通过定点突变使特定位点上的氨基酸序列缺失、取代、插入、添加或反转而获得。另外，如上所述的修饰DNA还可以通过常规的突变处理来获得。

此外，由于通常已知一种蛋白质的氨基酸序列或编码该蛋白质的核苷酸序列在物种、株系、突变体和变异体之间稍微不同，所以编码基本上相同的蛋白质的DNA可以从一般的醋酸细菌，特别是从醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的物种、株系、突变体和变异体中获得。

具体地，编码一种与该蛋白质基本上相同的蛋白质的DNA可以从属于醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸细菌、进行突变处理的属于醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸细菌，或其天然突变体或变异体中，通过例如，分离DNA来获得，所述DNA在严格条件下与包含由序列表SEQ ID No.1中所示核苷酸序列内的第73-1251位核苷酸所组成的核苷酸序列杂交并且编码一种具有提高温度耐受性功能的蛋白质。

所谓严格条件是这样一种条件，即在该条件下形成所谓的特异性杂交而不形成非特异性杂交。尽管难于清楚地量化这种条件，但如果要举例子的话，例如这样一种条件，在该条件下具有高度同源性的DNA，例如具有70％或更高同源性的DNA杂交，而具有低于此的同源性的DNA不杂交，或这样一种条件，在该条件下进行杂交作用的一般性洗涤，例如洗涤在等同于60℃上1×SSC和0.1％SDS的盐浓度下进行。

具有提高温度耐受性的功能的确认可以通过，例如，如下面提及的实施例中所说明的用一种靶DNA转化醋化醋杆菌No.1023菌株(FERMBP-2287)并且研究它是否能够在38℃生长来进行，所述菌株一般仅在37℃左右生长于琼脂糖培养基上。

(2)本发明的醋酸细菌

本发明的醋酸细菌为属于醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸细菌，或者是温度耐受性得到提高的这类属于醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的细菌。

关于属于醋酸杆菌属的细菌，可以具体地举例醋化醋杆菌，例如，醋化醋杆菌No.1023菌株(保藏为FERM BP-2287，国际专利生物保藏机构)、醋化醋杆菌木亚种(Acetobacter aceti subsp.xylimum)IFO 3288和醋化醋杆菌IFO 3283菌株。

另外，对于属于葡糖酸醋酸杆菌属的细菌，例如，可以举例欧洲葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter europaeus)DSM6160和Gluconacetobacterentanii，以及例如Acetobacter altoacetigene MH-24菌株(保藏为FERMBP-491，国际专利生物保藏机构)。

温度耐受性可以，例如，通过扩增温度耐受基因的细胞内拷贝数，或通过利用重组DNA转化属于醋酸杆菌属的细菌而得以提高，所述重组DNA是通过将含有该基因的结构基因的DNA片段连接到一种在属于醋酸杆菌属的细菌中有效作用的启动子序列上来获得的。

此外，温度耐受性还可以通过用其它在属于醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的细菌中有效作用的启动子序列，例如来自醋酸细菌的乙醇脱氢酶(例如，见非专利文献8)的启动子序列或源自醋酸细菌之外的微生物的启动子序列，包括如质粒pBR322的抗氨苄青霉素基因、质粒pACYC177的抗卡那霉素基因、质粒pACYC184的抗氯霉素基因、来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因的启动子代替染色体DNA上基因的启动子序列而得以提高。

细胞内基因的拷贝数增加可以通过将保有该基因的多拷贝载体导入属于醋酸杆菌的细菌的细胞中进行，即，它可以通过将一种保持该基因的质粒、转座子等导入属于醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的细菌的细胞中而进行。

关于多拷贝载体，例如质粒、转座子等。关于质粒，例如pMV24(例如，见非专利文献3)、pGI18(例如，见非专利文献2)、pUF106(例如，见非专利文献7)、pTA5001(A)、pTA5001(B)(例如，见非专利文献1)等，再例如一种染色体整合型载体pMVL1(例如，见非专利文献4)。另外，关于转座子，例如Mu，IS1452等。

将DNA导入属于醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸细菌中可以通过氯化钙法(例如，见非专利文献5)、电转化法(例如，见非专利文献6)等来进行。

以上述方式提高属于具有乙醇氧化能力的醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的醋酸细菌中的温度耐受性能够提高醋酸的生产效率。

(3)生产醋的方法

本发明的生产醋的方法，其特征为培养微生物，由此生产并在培养基中积累醋酸，所述微生物是通过扩增温度耐受基因的拷贝数选择性提高其温度耐受性的属于醋酸杆菌属或葡糖酸醋酸杆菌属的细菌，在培养基中具有乙醇氧化能力。

可以用与常规的醋酸细菌发酵方法相同的方式实施该方法。含有乙醇的培养基意为含有醇如乙醇、碳源、氮源、无机物质等的培养基，可以使用具有与在所谓醋酸发酵中所用的培养基相似组分的培养基。它可以是合成的培养基或天然的培养基，只要它含有所用细菌菌株生长所需的适量营养。关于碳源，可以使用各种糖类如葡萄糖和蔗糖以及各种有机酸。关于氮源，可以使用天然氮源如胨、发酵细菌的降解产物等。

此外，可以根据通常的方法如在静态培养、振荡培养和在好氧条件下的通气搅动培养来进行。培养温度是20-40℃，优选25-35℃，一般设定为30℃。培养基的pH一般在2.5到7.0范围之内，优选在2.7到6.5范围之内，它可以用各种酸、碱、缓冲液等根据需要进行调节。

如上所述，在本发明中，通过在含有乙醇的培养基中进行培养，可以在培养基中生产和积累醋酸。通常，通过1到21天的培养，在培养基中以较高浓度生产和积累醋酸。

(4)本发明的实施方案

已把将根据本发明的ORF(SEQ ID No.1中的第73-1251位核苷酸)或包含该ORF的温度耐受基因(SEQ ID No.1)的一部分插入到大肠杆菌载体(多拷贝载体)pT7Blue(Novagen Co.生产)而制得的重组质粒pUCGCS保藏为FERM BP-8217国际专利生物保藏单位，从而本领域技术人员可以容易地获得根据本发明的DNA，并实施本发明。此外，如果需要，利用这种重组质粒，将根据本发明的ORF或含有该ORF的温度耐受基因递送到一种能够在醋酸细菌中自主复制的载体中，将该载体导入醋酸细菌中并且培养该醋酸细菌，由此即使在高温条件下也可以进行醋酸发酵并且可以降低冷却成本。

另外，如上所述和下述实施例阐明了提高温度耐受性的基因来源的保藏、该基因的核苷酸序列、对应于该基因的蛋白质的氨基酸序列、PCR的实施方案、质粒载体和重组载体的制备、宿主细菌的保藏等，它们的每一种都可以轻易地获得、操作和处理，所以如果参考实施例进行每种操作和处理，就可以获得目标温度耐受性转化子。使用该转化子即使在高温条件下也能够生产醋酸。

下面，将参考实施例对本发明作更加具体地解释。

实施例

(实施例1)从Gluconacetobacter entanii中克隆温度耐受基因并且测定核苷酸序列和氨基酸序列

染色体DNA文库的产生

将Gluconacetobacter entanii的一种菌株，Acetobacter altoacetigenesMH-24菌株(FERM BP-491)，在添加了6％的醋酸和4％乙醇的YPG培养基中(包含3％葡萄糖，0.5％酵母提取物和0.2％蛋白胨)于30℃摇动培养240-336小时。培养后，将培养基离心(7,500g，10分钟)获得细菌细胞。通过日本专利申请No.60-9489中公开的方法从获得的细菌细胞中制备染色体DNA。

用限制酶SalI和KpnI(Takara Bio Inc生产)消化上述获得的染色体DNA和大肠杆菌-醋酸细菌穿梭载体(pMV24)。将这些DNA足量地混合并利用连接试剂盒(Takara DNA连接试剂盒Ver.2，Takara BioInc生产)进行连接，由此构建Acetobacter altoacetigens MH-24的染色体DNA文库。

(2)温度耐受基因的克隆

以用上述方式获得的Acetobacter altoacetigenes MH-24的染色体DNA文库，转化通常只能在最高37℃左右的生长温度生长于琼脂培养基上的醋化醋杆菌No.1023菌株(FERM BP-2287)。随后将转化的醋化醋杆菌No.1023菌株在添加了100μg/ml氨苄青霉素的YPG琼脂培养基上于38℃培养4天。

随后，将形成的菌落接种入包含100μg/ml氨苄青霉素的YPG培养基中，进行培养，从获得的细菌细胞中收回质粒。结果，可以回收质粒，在所述质粒中克隆了如图1中所示的大约1.6kb的SalI-KpnI片段，这种质粒称为pG1。

以这种方式，获得了提高温度耐受性的DNA，它使得通常只能在最高37℃左右生长于琼脂培养基上的醋化醋杆菌No.1023菌株即使在38℃也能生长。

(3)克隆DNA片段的核苷酸序列和氨基酸序列的测定

将上述描述的克隆SalI-KpnI片段插入pUC19的SalI-KpnI酶切位点，用Sanger的双脱氧链终止法测定该片段的核苷酸序列。在DNA双链的所有区域都进行核苷酸序列的测定，并且以酶切位点重叠的方式进行核苷酸序列的测定。

结果，测定了在序列表SEQ.ID.No.1所示的核苷酸序列。在序列表SEQ.ID No.1所示核苷酸序列的第73-1251位核苷酸中，确认了编码由序列表SEQ.ID No.2所示的393个氨基酸所组成的的氨基酸序列的开放阅读框(ORF)的存在。

(实施例2)用来自Gluconacetobacter entanii的温度耐受基因转化的转化子温度耐受性的提高

(1)醋化醋杆菌的转化

使用KOD-Plus(东洋纺织公司生产)通过PCR方法扩增如上述实施例1中克隆的源自Acetobacter altoacetigenes MH-24菌株(FERM BP-491)的提高温度耐受的基因。随后，通过将扩增片段插入到醋酸细菌-大肠杆菌穿梭载体pMV24(例如，见非专利文献3)的限制酶Sma I酶切位点构建pGCS。插入到pGCS中的扩增片段的概要图显示于图1。该扩增片段包括在SalI-KpnI片段中(提高温度耐受的基因，其核苷酸序列显示于SEQ.ID No.1中)，并且包括第73-1251位核苷酸的编码区(ORF)的上游和下游区的部分。

如下实施PCR方法；即，利用源自上述醋酸细菌作为模板并且利用引物1(其核苷酸序列显示于SEQ ID No.3(图5)中)和引物2(其核苷酸序列显示于SEQ ID No.4(图6)中)在下列条件下实施PCR方法。

(PCR条件)

该PCR方法进行30个循环，一个循环由94℃15秒、60℃30秒和68℃2分钟所组成。

通过电转化方法(例如，见非专利文献6)用这种pGCS转化醋化醋杆菌No.1023(FERM BP-2287)。通过将其在加入100μg/ml的氨苄青霉素的YPG琼脂糖培养基上于38℃的培养温度进行培养来筛选转化子。

通过以常规的方式从转化子中提取质粒并且对它进行分析，确定生长于选择性培养基上的具有氨苄青霉素抗性的转化子保有具有温度耐受基因(GCS基因)的质粒。

实施例(3)用源自Gluconacetobacter entanii的温度耐受基因转化的转化子的醋酸发酵测试

(1)转化子的温度耐受性

将实施例2中获得的具有质粒pGCS的氨苄青霉素抗性转化子与只导入穿梭载体pMV24的醋化醋杆菌No.1023的起始菌株就培养温度改变时在YPG培养基中的生长情况进行了比较。

具体地，使用2L的微小发酵罐(Mitsuwa Rikagake KogyoCo.；KMG-2A)在1L包含1％醋酸、4％乙醇和100μg/ml氨苄青霉素的1LYPG培养基中于400rpm和0.2vvm进行通气-振荡培养，并且将培养基中醋酸的浓度和转化子的生长(通过测量660nm下的吸收值)与起始菌株进行比较。开始培养温度为30℃，随后发酵在33℃进行，直到醋酸浓度达到约3％。随后温度进一步升至36℃，并且进行发酵直到醋酸浓度达到3％。其后，温度以2℃的增量上升，进行醋酸发酵。当醋酸浓度达到3％时，除了留在微小发酵罐中的100ml培养基外，去除其余的培养基。向剩余的100ml培养基中加入900mlYPG培养基，所述加入是以这样一种方式来进行的，即醋酸、乙醇和氨苄青霉素的终浓度分别为1％、4％和100μg/ml，并且以上述方式来改变温度，重新开始醋酸发酵。

结果，如图2中显示，尽管在醋化醋杆菌No.1023菌株的起始菌株中，细菌的生长和醋酸发酵仅仅能够确认为最高37℃，但是在转化子中，细菌的生长和醋酸发酵即使在38℃也是可能的，而且，获得了甚至在40℃也可确认生长的结果，由此GCS基因的提高温度耐受性的功能得以确认。

(实施例4)用源自Gluconacetobacter entanii的温度耐受基因转化的转化子温度耐受性的提高

(1)醋化醋杆菌的转化

使用KOD-Plus(东洋纺织公司生产)通过PCR方法扩增如上述实施例1中克隆的源自Acetobacter altoacetigenes MH-24菌株(FERM BP-491)的提高温度耐受的基因。随后，插入到醋酸细菌-大肠杆菌穿梭载体pGI18(例如，见非专利文献2)限制酶Sma I的酶切位点来构建pGCS1。插入到pGCS1的扩增片段的概要显示于图1中。该扩增片段包括在SalI-KpnI片段中(提高温度耐受的基因，其核苷酸序列显示在SEQ.ID No.1中)，并且包括第73-1251位核苷酸的编码区(ORF)的上游和下游区的部分。

如下实施PCR方法；即，利用源自醋酸细菌的上述基因组DNA作为模板并且利用引物1(其核苷酸序列显示于SEQ ID No.3(图5)中)和引物2(其核苷酸序列显示于SEQ ID No.4(图6)中)在下列条件下实施PCR方法。

(PCR条件)

实施PCR方法30个循环，一个循环由94℃15秒、60℃30秒和68℃2分钟所组成。

通过电转化方法(例如，见非专利文献6)用pGCS1转化醋化醋杆菌No.1023(FERM BP-2287)。通过将其在加入100μg/ml的氨苄青霉素的YPG琼脂糖培养基上于38℃的培养温度进行培养来筛选转化子。

通过以常规的方式从转化子中提取质粒并且对它进行分析，确定生长于选择性培养基上的具有氨苄青霉素抗性的转化子保有具有温度耐受基因(GCS基因)的质粒。

通过图8所示的方法构建醋酸细菌的载体pGI18。

这一载体pGI18是由质粒pGI1和pUC18构建而来。首先，构建质粒pGI1。

即，将Gluconacetobacter entanii的一个菌株Acetobacter altoacetigenesMH-24菌株(FERM BP-491)，在添加了6％醋酸和4％乙醇的YPG培养基(包含3％葡萄糖、0.5％酵母提取物和0.2％蛋白胨)中30℃摇动240小时到336小时进行培养。获得的细菌细胞用氢氧化钠或十二烷基硫酸钠进行酶切，然后用苯酚并且进一步用乙醇处理，由此对质粒DNA进行纯化。

用不同的限制酶消化获得的质粒DNA(Takara Bio Inc生产)(37℃和1单位/ml的酶浓度)，并且通过琼脂糖电泳来测定获得的DNA片段的碱基对大小。

获得的质粒DNA是一种由具有三个Hinc II识别位点和一个Sfi I识别位点的环状双链DNA所组成的质粒，该质粒的整体大小约为3100bp。此外，它没有EcoRI、Sal、KpnI、SmaI、BamHI、XbaI、SalI、PstI、SphI和HindIII的识别位点。获得的质粒DNA命名为质粒pGI1并且用于载体pGI18的构建(图8)。

使用KOD-Plus(YOYOBO Co.，LTD)以PCR方法对上面获得的质粒pGI1进行扩增，并且使用AatII进行消化。

如下实施PCR方法；即，利用实施例1中制备的质粒pGI1作为模板并且利用具有AatII识别位点的引物A和引物B作为引物在下列条件下实施PCR方法。引物A和引物B的核苷酸序列分别在SEQ.ID No.6(图12)和SEQ.ID No.7(图13)中显示。

PCR条件为30个循环，一个循环由94℃30秒、60℃30秒和68℃3分钟所组成。

另一方面，以AatII消化(于37℃和1单位/ml的酶浓度)具有氨苄青霉素(Amp)-抗性基因(宝酒造公司生产生产：2686bp)的pUC18，并且用T4DNA连接酶连接到质粒pGI1上。随后，在连接后使用反应溶液以常规方式转化大肠杆菌JM109菌株(宝酒造公司生产生产)，并且通过在包含100μg/ml氨苄青霉素钠的LB培养基(10g胨、5g酵母膏提取物和5gNacl)上进行选择来获得具有Amp抗性的转化子。从获得的转化子中制备质粒，并且对其限制酶酶切方式进行分析。在图8中，显示了获得质粒的限制酶图谱。在图8中，“AatII”和“SfiI”表示限制酶识别位点。此外，MCS表示多克隆位点，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因位点，括号中的数字表示bp单位所代表的核苷酸组分的数目。另外，中间的“pUC18”、“pGI1”和“pGI18”表示质粒的名字，而“2.7kbp”、“3.1kbp”和“5.8kbp”表示质粒的总碱基数。

由图8显而易见，获得的质粒包含pUC18和pGI1二者，并且其总的大小为约5800bp(5.8kbp)。醋酸细菌的这个质粒命名为pGI18。

该载体pGI18的核苷酸序列显示在SEQ.ID No.5(图9、图10和图11)中。

(2)转化子的温度耐受性

将以上述方式获得的具有质粒pGCS的氨苄青霉素抗性转化子与只导入穿梭载体pGI18的醋化醋杆菌No.1023的起始菌株就培养温度改变时在YPG培养基中的生长情况进行了比较。

具体地，使用2L的微小发酵罐(Mitsuwa Rikagake KogyoCo.；KMG-2A)在1L包含1％醋酸、4％乙醇和100μg/ml氨苄青霉素的1LYPG培养基中于400rpm和0.2vvm进行通气-振荡培养，并且将培养基中醋酸的浓度和转化子的生长(通过测量660nm下的吸收值)与起始菌株进行比较。开始培养温度为30℃，随后发酵在33℃进行，直到醋酸浓度达到约3％。随后温度进一步升至36℃，并且进行发酵直到醋酸浓度达到3％。其后，温度以2℃的增量上升，进行醋酸发酵。当醋酸浓度达到3％时，除了留在微小发酵罐中的100ml培养基外，去除其余的培养基。向剩余的100ml培养基中加入900mlYPG培养基，所述加入是以这样一种方式来进行的，即醋酸、乙醇和氨苄青霉素的终浓度分别为1％、4％和100μg/ml，并且以上述方式来改变温度，重新开始醋酸发酵。

结果，如图3中显示，尽管在醋化醋杆菌No.1023菌株的起始菌株中，细菌的生长和醋酸发酵仅仅能够确认为最高37℃，但是在转化子中，细菌的生长和醋酸发酵即使在38℃也是可能的，而且，获得了甚至在40℃也可确认生长的结果，由此GCS基因的提高温度耐受性的功能得以确认。

实施例(5)用源自Gluconacetobacter entanii的温度耐受基因转化的转化子的醋酸发酵测试

(1)Acetobacter altoacetigenes的转化

通过电转化方法(例如，见非专利文献6)用如在实施例4中获得的质粒pGCS1转化Gluconacetobacter entanii的一种菌株Acetobacteraltoacetigenes MH-24菌株(FERM BP-491)。用含有0.55％琼脂糖的加入100μg/ml氨苄青霉素、4％的醋酸和4％的乙醇的YPG琼脂糖培养基来选择转化子。

通过以常规的方式从转化子中提取质粒并且对它进行分析，确定生长于选择性培养基上的具有氨苄青霉素抗性的转化子保有具有提高温度耐受性的基因的质粒。

(2)醋酸发酵测试

在醋酸发酵能力方面，将具有在(1)中获得的质粒pGCS1的抗氨苄青霉素转化子与仅导入了穿梭质粒pGI18的AcetobacteraltoacetigenesMH-24起始菌株进行比较。

具体地，使用5L的微小发酵罐(Mitsuwa Rikagaku Kogyo Co.；KMJ-5A)在2.5L的含有100μg/ml氨苄青霉素的原材料培养基中(7％醋酸，3％乙醇，0.2％酵母提取物和0.2％的葡萄糖)于30℃，500rpm和0.20vvm进行通气-振荡培养。当确认了细菌的明显生长并且剩余的乙醇浓度达到2％时，加入含有乙醇的溶液(1％的醋酸，50％的乙醇，0.2的酵母提取物和0.2％的葡萄糖)，由此将发酵液中的乙醇浓度保持在2％。通过这种醋酸发酵方法，将转化子的醋酸发酵能力与起始菌株的能力相比较。结果总结于表1中。

(表1)

  最终醋酸浓度(％)  具体生长速率  生产率(％/小时)  (OD600/小时)  起始菌株  15.6  0.0061  0.31  转化子  17.2  0.0061  0.26

从表1的结果，确定了转化子在最终醋酸浓度上显著占优。

(3)醋化醋杆菌木亚种的转化

通过电转化方法(例如，见非专利文献6)用如在实施例4中获得的质粒pGCS1转化醋化醋杆菌木亚种的一种菌株醋化醋杆菌木亚种IFO3288菌株。用加入100μg/ml的氨苄青霉素的YPG琼脂糖培养基来选择转化子。

通过以常规的方式从转化子中提取质粒并且对它进行分析，确定生长于选择性培养基上的具有氨苄青霉素抗性的转化子保有具有提高温度耐受性的基因的质粒。

(4)醋酸发酵测试

在醋酸发酵能力方面，将具有在(3)中获得的质粒pGCS1的抗氨苄青霉素转化子与仅导入了穿梭质粒pGI18的醋化醋杆菌木亚种IFO3288菌株的起始菌株相比较。

具体地，在5L的微小发酵罐(Mitsuwa Rikagaku Kogyo Co.；KMJ-5A)中使用一种原材料培养基中于30℃，500rpm和0.20vvm进行通气-振荡培养，在7.2％醋酸浓度连续发酵，所述原材料培养基是通过以这样的比率(乙醇的浓度：7.8％，醋酸的浓度：0.26％)混合17.9％糖化的大米溶液、3.2％发酵的moromi、用于酿造的7.8％乙醇和71.1％的水制备的。比较于7.2％醋酸浓度上的连续发酵中添加培养基的速率，结果显示于表2中。此外，于7.2％醋酸浓度上的连续发酵中当对于转化子与起始菌株的原材料添加速率一致时比较醋酸发酵能力。结果显示于表3中。

(表2)

  醋酸浓度(％)  OD660  原材料培养基添  加速率(g/小时)  起始菌株  7.17  0.538  84.7  转化子  7.26  0.612  96.3

(表3)

  醋酸浓度(％)  OD660  原材料培养基添  加速率(g/小时)  起始菌株  7.24  0.502  82.3  转化子  7.61  0.437  82.0

从表2和表3的结果，确认了在连续的醋酸发酵中，转化子在生产率(原材料培养基添加速率)和生产醋酸的浓度上也是显著占优的。

工业实用性

根据本发明，可以提供一种涉及温度耐受性的新基因，另外通过利用该基因可以获得一种在较高温度条件下能够高效生产醋酸的培育菌株，并且利用该培育菌株可以提供在较高温度条件下高效生产醋酸的方法。

                                  序列表

<110>Mitsukan Group Corporation

<120>提高醋酸细菌温度耐受性的基因、利用该基因培育的醋酸细菌以及利用该醋酸细菌生产醋的方法

<130>

<141>2003-12-04

<160>7

<210>1

<211>1313

<212>DNA

<213>Glucoracetobacter entanii

<400>1

gaagagtgat attacacttc cctgacgccg ttttctaatt tgctccatac gcgggacctt      60

gccggaaaga taatgtctgt tttcaacgct cttgtttcac ccgccggact ggccgcgacc     120

gttgcggtcg ccgggtgcat gcaggcagcg cttggcactt ttctggtctc gcgtttccgg     180

tggcaggaaa aacgcatgga ccgggcggtg cccatgcctc cggtttccgt gctcaagccc     240

ctccacggcg atgaaccgct gctggaggaa gcgcttgaaa gcttctgcac gcaggattac     300

ccgcagatgc agatcgtctt tggcgtacag gccgaagacg atgcggcgat cccgatcgta     360

caacggttga tggaacgcca cccggatgtg cagatggaac tggtgattga ccccaccttc     420

cacgggctca accgcaagat cggcaacctg atcaacatca tgacgcgcgt gaagcatgat     480

gtcctggtca tttccgattc ggatatccac gttgcccccg attacctgcg gcatgtggtg     540

ggcgccatgg tgcccgacaa tgtcggcctg gtcacgacgc tgtacgcggg gctgcccgcg     600

tcatccacgc tgccgcgcct gctggccgca tgccagatca accataactt cctgcccggc     660

gtgatgctgt cactctacct cgggcggcag gactgccttg gggcgacaat ggcgctgcgg     720

cgttccatgc tggacgaaat cggcgggctg gaagccctcg tgccgcatgt ggccgatgat     780

gcgatactgg gccgttacgt gcgtgaccgt ggcaaggata tcgccattgc cgcgtgcatg     840

acctggacca ccgtgggcga gacctcgatg cgtgaggtgc tggcgcatga actgcgctgg     900

ggccggaccg tcaagacgct ggagcctgcg ggttatgccg catccgccat ccagctgccc     960

ctgttctggg ccagcgtcgc cgtgcttgcc gcgccgcatg cgacctggac atggtccttc    1020

tttcttggtg catggggatg gcgggccgtg tgttccttca tcctggaccg tacgctggcg    1080

caacgtagtc tggtgctgcc gtcactgctt ctgccactgc gcgactggat ctcggccgcc    1140

gtcatggtgg gcagtgtcac tggcacgcgg gttgcatggc gtgggcagac aatgcatgtc    1200

acgccccatt cggtcatgac accacgatcg caaccggctt cccccggtga ctgacccgcc    1260

gtcagcaggc tgaactgctt gagaattcca accctgtcgt taataagaac ggg           1313

<210>2

<211>393

<212>PRT

<213>Gluconacetobacter entanii

<400>2

Met Ser Val Phe Asn Ala Leu Val Ser Pro Ala Gly Leu Ala Ala Thr

                  5                  10                 15

Val Ala Val Ala Gly Cys Met Gln Ala Ala Leu Gly Thr Phe Leu Val

             20                  25                  30

Ser Arg Phe Arg Trp Gln Glu Lys Arg Met Asp Arg Ala Val Pro Met

         35                  40                  45

Pro Pro Val Ser Val Leu Lys Pro Leu His Gly Asp Glu Pro Leu Leu

     50                  55                  60

Glu Glu Ala Leu Glu Ser Phe Cys Thr Gln Asp Tyr Pro Gln Met Gln

 65                  70                  75                  80

Ile Val Phe Gly Val Gln Ala Glu Asp Asp Ala Ala Ile Pro Ile Val

                 85                  90                  95

Gln Arg Leu Met Glu Arg His Pro Asp Val Gln Met Glu Leu Val Ile

            100                 105                 110

Asp Pro Thr Phe His Gly Leu Asn Arg Lys Ile Gly Asn Leu Ile Asn

        115                 120                 125

Ile Met Thr Arg Val Lys His Asp Val Leu Val Ile Ser Asp Ser Asp

    130                 135                 140

Ile His Val Ala Pro Asp Tyr Leu Arg His Val Val Gly Ala Met Val

145                 150                 155                 160

Pro Asp Asn Val Gly Leu Val Thr Thr Leu Tyr Ala Gly Leu Pro Ala

                165                 170                 175

Ser Ser Thr Leu Pro Arg Leu Leu Ala Ala Cys Gln Ile Asn His Asn

            180                 185                 190

Phe Leu Pro Gly Val Met Leu Ser Leu Tyr Leu Gly Arg Gln Asp Cys

        195                 200                 205

Leu Gly Ala Thr Met Ala Leu Arg Arg Ser Met Leu Asp Glu Ile Gly

    210                 215                 220

Gly Leu Glu Ala Leu Val Pro His Val Ala Asp Asp Ala Ile Leu Gly

225                 230                 235                 240

Arg Tyr Val Arg Asp Arg Gly Lys Asp Ile Ala Ile Ala Ala Cys Met

                245                 250                 255

Thr Trp Thr Thr Val Gly Glu Thr Ser Met Arg Glu Val Leu Ala His

            260                 265                 270

Glu Leu Arg Trp Gly Arg Thr Val Lys Thr Leu Glu Pro Ala Gly Tyr

        275                 280                 285

Ala Ala Ser Ala Ile Gln Leu Pro Leu Phe Trp Ala Ser Val Ala Val

    290                 295                 300

Leu Ala Ala Pro His Ala Thr Trp Thr Trp Ser Phe Phe Leu Gly Ala

305                 310                 315                 320

Trp Gly Trp Arg Ala Val Cys Ser Phe Ile Leu Asp Arg Thr Leu Ala

                325                 330                 335

Gln Arg Ser Leu Val Leu Pro Ser Leu Leu Leu Pro Leu Arg Asp Trp

            340                 345                 350

Ile Ser Ala Ala Val Met Val Gly Ser Val Thr Gly Thr Arg Val Ala

        355                 360                 365

Trp Arg Gly Gln Thr Met His Val Thr Pro His Ser Val Met Thr Pro

    370                 375                 380

Arg Ser Gln Pro Ala Ser Pro Gly Asp

385                 390         393

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

gaagagtgat attacacttc cctgacgccg

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

cccgttctta ttaacgacag ggttgg

<210>5

<211>5734

<212>DNA

<213>Gluconacetobacter entanii(Acetobacter altoacetigenes MH-24)

<400>5

catggggcgt cacccccagc ggccagcttg gctacctgat ggacagggcg ggccttctgc    60

aagccctcgg ccactgccat ctgccgggat atgaggccaa atacgaaccg aaggaaaagc   120

gcaccttctg ctaccccacc cagaacgcca gcggctgggc tgtgcagcca tgatcgccaa   180

cccctccctc ttcctgagca attcggaaga gcgatttccg ccgactgaac acgtcgaaaa   240

tggcagtttt ccaccgaaaa aaggaaagga ccataggaaa ggattaatat cttattttta   300

tctaggggtt tgccgatccg cgattttcgc tgggaaaccg ccaaaaatgg cttgccatta   360

ggtcgcacca catgcgacca taaagtcgca cagtgtgcga cctattcggc ccatatacag   420

aggttcccca catgcggaat gtcacccgtc tcaagacccg caaagaccgg ctccgcgagg   480

accaagccga cctgttgaag caagcccttc tgcccttcgc agaggacgat ggaccgatgc   540

gggatgcggt cggacggctc tacgtccaga tcaagaacct caccacccca gaccccggaa   600

ccacggagcc gttcgtcatg atccgtcccg cccagaatcg cgccgtcacc ctctggctgc   660

tgaagaacag taagcggccc atgaaggccg tggacgtatg gacgctgctg ttcgaccacc   720

tgtttcccca taccggccag atcatgctga cccgtgagga aatcgcggaa aaagtcggta   780

tccgggtcaa cgaagttaca gccgtcatga acgagctggt gagcttcggc gcgattttct   840

ccgagcgcga gaaggtggcc ggaatgcgcg ggccgggcct cgcccgctac tacatgaacc   900

ggcatgtggc cgaggtcggc agccgcgcca cgcaggaaga acttgcccta atcccacgcc   960

ccggcgccaa gctggcagtc gtgcagggtg gcaaggctta acccatgaag gtttcggaac  1020

tggacgtgtt cgacagcgcc aaggcggcac aagacccgtt ggtgcgggaa gaactgctgc  1080

aagcagcgca ggcggacggc cacggccccg ccctcgctca tgcccgttcc gtcatagcca  1140

aggcgcgggc cgggcaggac gccaaggctt aacggccccg ccctctcccg cctcgatccc  1200

ggcgggcctg tagcatctcc tgatgctcct tggcgttttt ggcccgctgc tcggcccgct  1260

ctttctcggc cgctgcggct cttaggcgct cttcggccag ccgcatccgc tcgtccatct  1320

gacgtttccg atctgcctcg gcatccttgg cggctcctgc cttcagccct ttgctgaaag  1380

ccatccactt attggcggtt ttctcggctt tctgctgtat cggcggggtc agccggtcaa  1440

atgcctgggc caccctctcg aagccctcac gcatggcgtt gacggcctgc gccagtttag  1500

ccagggcgaa atctatcacc tcggcccgct gggcgttctc ggcccggata cgccggttgt  1560

ggttgccggt cggggtctgg tggcccttcc gttccagagc caccacattc ggccccatgt  1620

gccgctctgg aacgcggtct agcccctgct ccgcattgct ccggtgatct atccgggcct  1680

cttgcccagc ccgctctagc gcggcattgg caaggcccgc ccatagctgc cggatttcct  1740

tcacctcgtc ggcggccttc cccagtccca tgccctgccg cttcttgtcg gacagttcga  1800

tggttgattt gtctccaaag gacagcttgc catcggcccc ccgctccacc gtgcgggtgg  1860

tggtcatgat gtgcgcgtga tgattccggt cgtcgccctc gtcacccgga agatgcacgg  1920

ccacgtccac ggccaccccg taccgctgga ccaactcacg cgcgaaactg tccgccagtt  1980

cggcccgctg ctcgctggtg agttcatgag ggagggccac aacccattcc ctcccggtgc  2040

gggcgtcctt gcgtttctct gatcgctccg cgtcattcca caattccgaa cggtcagcgg  2100

tgccaccccc cggaatgaaa attgccttat gggcaacgct attctgcctg gggctgtatt  2160

tgtgttcgtg cccgtcaacc tcgttggtca aatcctcgcc agcacgatac gcagccgcag  2220

ccacaacgga acgccctgcg ctccggctga tcggtttcgt ttctgcgcga tagattgcca  2280

cggatcgagc gcctaccttt tggagttaaa cggggggttc aggggggcga agccaccatg  2340

acgcaggact tgcacttgtg caagtcgtaa ctgcgccctt aatacctgac ggcatcaagg  2400

gatatgtggt attcgtttga aacggaacgg ctccacggtg aggatgatat gagcgatatt  2460

gcgaaagaga ttgagaacgc caaaaggatc atagctgaac agaaaaagcg catcaaagat  2520

gcccagaagg aagcagctaa agcggaatca aagttgaggg accgtcagaa ctacatcttg  2580

ggcggcgcac tggtaaaact tgccgaaaca gatgaacggg ccgtccgcac tattgaaaca  2640

cttttgaagc tggtggatcg tccatcagac cggaaggcgt ttgaggtgtt ttcccgtctc  2700

ccatccctct ccctgcccac gcagccagca ccggacaccg gccatgagtg aggcactgga  2760

agaagatccg tttgaactgt tcaaaagggt cgaaaaaagc ctgtccacgg ccaccgccag  2820

catggagcgg ctggccgccg aacaagatgc caggtgcaag accatttcag acgccgccgg  2880

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gatgatctgg acggccctct gcgcggctct gctggtctgt ggcgggtggt tggcgggtta  3000

ttggctggga caccgtgacg gttgggcctc tggcacggcc cacgacgtct aagaaaccat  3060

tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg  3120

tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg  3180

tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg  3240

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gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc  3360

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tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct  5340

cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca  5400

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ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg  5580

gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta  5640

ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc  5700

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<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cgctgacgtc gtgggccgtg ccagaggccc                         30

<210>7

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

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