一种诱导植物表达病程相关蛋白的有机肥及其应用

摘要

本发明涉及一种诱导植物表达病程相关蛋白的有机肥及其应用，该有机肥成分的重量百分比为：有机质89－92％，全氮6－8％，磷0.8－1.1％和钾1.2－2.1％；该有机肥的制备方法为：将医药工业生产青霉素的固－液混合废弃残渣倒入大水泥池，日晒2－5天，每隔2－4小时搅拌一次，直至残渣成为稀膏状；再将稀膏状的日晒残渣倒入沸腾炉中，在250－350℃温度下干燥1－4小时，粉碎后得到有机肥。该有机肥可以水提液灌根、基肥或追肥的形式施用，作为诱导植物表达病程相关蛋白从而产生抗病性的应用。本发明具有效果佳、有广泛应用领域等优点，特别适应于无公害种植的需要及大量农药才能控制病害的作物。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种诱导植物表达病程相关蛋白的有机肥及其应用，属生物肥料技术领域。

背景技术：

长期以来，植物病害的防治主要依赖于抗病品种和化学农药。但由于现代社会对环境保护的日益重视，限制或减少化学农药在农业上的使用已是大势所趋；植物的遗传抗病性状常常与其它农艺性状常常难以有机结合，选育既抗病又高产、优质作物品种的难度越来越大，例如至今也未能培育出抗黄萎病的棉花品种，而且现推广的转基因抗虫棉品种在获得高效抗虫性后，抗病性不仅没有增强，反而大都有所降低。因此，研究探索植物保护的新技术、新途径一直是世界范围内农业科技工作者的重要努力方向。植物诱导抗病性也称系统抗病性，是指经诱导物处理后，植物体本身产生的对多种有害病原菌抗性，而非专一抗性的现象，植物体内未直接接触诱导物的部位也被诱导表达PRs蛋白(病程相关蛋白，Pathogenesis relatedproteins)是其最重要的生理指标。植物诱导抗病性具有抗病谱广、持续时间长和利用安全方便等特点，被认为是植物病害防治的一种新途径、新技术，目前已成为国际上重要的农业研究领域。

为使植物诱导抗病性应用于农业生产，近20多年来国际上研究筛选有效的抗病诱导物，特别是能商业化生产的化学药剂，迄今已发现2，6-二氯异烟酸(INA)、苯并噻唑类制剂(BTH)和氨基丁酸(BABA)等化合物可诱导作物产生对黄萎病、枯萎病及叶斑病的抗性，其中苯并噻唑类制剂(BTH)已开始商业化生产；但因该诱导物为化学制剂，对多数农作物有药害，因此开发效果一般。而开发活的微生物作为诱导物虽可避免这个问题，但实际应用效果常常受到环境条件的影响，而且诱导物的制备工序复杂，成本较高，开发难度也很大。目前，研究开发无污染、施用安全的生物制剂是该领域的热点，而开发一种同时具备良好肥效，又可诱导植物产生系统抗病性的有机肥，不但具有良好的商业前景，还有深远的环保意义。

参考文献：

1.Huges，D.W.and Galau，A.G.(1988)，Preparation of RNA from cotton leaves andpollen.Plant Mol.Bio.Rep.6：253-257

2.Melissa K.Hill，Lyon Karin J.，Lyon Bruce R.(1999)Identification of disease response genesexpressed in Gossypium hirsutum upon infection with the wilt pathogen Verticillium dahliae.PlantMolecular Biology，40：289-296

3.Sambrook J，Russell DW(2001)Molecular cloning：a laboratory manual.3rd edn..Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork

发明内容：

本发明的目的是通过对可诱导植物系统表达PRs蛋白的灭活青霉素生产残渣的研究，开发诱导植物产生抗病性的有机肥料。

本发明的有机肥成分的重量百分比为：有机质89-92％，全氮6-8％，磷0.8-1.1％和钾1.2-2.1％；该有机肥由下列步骤制成；

(1)将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣倒入大水泥池，日晒2-5天，每隔2-4小时搅拌一次，直至残渣成为稀膏状；

(2)将稀膏状的日晒残渣倒入沸腾炉中，在250-350℃温度下干燥1-4小时，粉碎后得到有机肥。

本发明的有机肥以基肥、追肥或水提液灌根的形式施用，作为诱导植物表达病程相关蛋白从而产生抗病性的应用。

本发明是这样实现的：

本发明的有机肥的制备：

1、青霉素生产残渣的日晒浓缩：

将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣倒入大水泥池，日晒2-5天，每隔2-4小时搅拌一次，直至残渣成为稀膏状；

2、残渣的干燥、灭活：将稀膏状的日晒残渣倒入沸腾炉中250-350℃干燥1-4小时，粉碎后得到有机肥。该工序利用青霉素高于80℃分解的特性，高温分解残留的青霉素，全部杀死青霉菌。

3、制备成品的成分分析：样品送土肥站，按常规标准检测，结果如下：有机质89-92％，全氮6-8％，磷0.8-1.1％和钾1.2-2.1％。

诱导抗病性试验：

1、病原菌培养：

分别引起甜瓜、棉花枯萎病的病原菌Fusarium oxysporum f.sp.Melonis(race0、race1、race2、race1，2四个生理小种)；Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum接种到PDA培养基上，25℃黑暗培养，15天后收集孢子，用细胞计数器将孢子浓度调整到10⁶-10⁷个/ml。

2、病原菌的接种试验：

1)样品水提液的制备：

取该肥500g，加蒸馏水至10L，浸泡24小时，过滤得到5％浓度的水提液，或稀释到所需浓度。

2)对甜瓜枯萎病四个生理小种的抗病性实验：

甜瓜(Cucumis melo L.cv.En-Dor)、按常规栽培管理，每种处理选长势一致的健康苗200株，用2％的有机肥水提液灌根，分别按标准方法接种甜瓜枯萎病病原菌四个生理小种的孢子，以植株1/3以上部分出现枯萎症状作为指标，统计病株率，可知该样品对有关作物病害的防治效果。

试验结果：如图1所示，2％的该有机肥对于甜瓜枯萎病的四个生理小种均表现显著的防治作用，说明该有机肥所诱导的对甜瓜枯萎病不同生理小种的抗性没有选择性，符合诱导植物产生系统抗病性的一般规律。

3)对不同棉花品种抗枯萎病的试验：

四个品种棉花(Gossypium hirsutum L.cv.H552，Vered；Gossupium barbadenseL.cv.P906，PF15)，按常规栽培管理，每种处理选长势一致的健康苗200株，用5％的有机肥水提液灌根，分别按标准方法接种棉花枯萎病病原菌的孢子，以植株1/3以上部分出现枯萎症状作为指标，统计病株率，可知该样品对棉花病害的防治效果。

实验结果：如图2所示，虽然4个供试品种对棉花枯萎病的遗传抗病性差别很大，陆地棉H552、Vered为感病品种和海岛棉P906，PF15为抗病品种，但使用本发明的有机肥5％水提液关根后，发病株率皆比各自空白对照显著降低，说明品种的遗传抗病性并不影响该有机肥的防病效果。

3、病程相关蛋白基因的系统性诱导表达试验

1)样品水提液的制备：

取该肥500g，加蒸馏水至10L，浸泡24小时，过滤得到5％浓度的水提液。

2)棉苗的培养和诱导：

取陆地棉(Gossypium hirsutum L)品种鲁棉研21号的种子，采用常规沙培的方法于28℃的条件下培养。待棉苗子叶平展后，以浓度5％的诱导抗病性肥水提液灌根，以蒸馏水灌根为对照。于灌根后6、8、12、24和48h取下子叶，置液氮中冷冻固定，然后于-80℃下保存备测。

3)总RNA的提取：

根据Hughes和Galau(1988)的方法和Melissa(1999)的改进方法，分别提取各处理组的子叶总RNA。利用260/280光吸收值和琼脂糖电泳的方法确保各样品浓度和质量一致；

4)PR蛋白基因表达的检测：

每个样品取10μg RNA经过甲醛变性胶电泳后，转膜至Hybond-N⁺膜上，亚甲兰染色，根据28S rRNA的量，确保膜上每个样品RNA的浓度和质量得一致性。将8种不同PRs蛋白基因片段(见表1)以内切酶切下后，利用随机引物法将片段标记32p dCTP，作为探针，用于Northern杂交分析。Northern杂交根据标准方法进行(Sambrook et al.，2001)，杂交完成后压X-光片(Kodark)-80℃曝光5-6天。根据X-光片上的曝光强度可以直观的观察到不同处理时间各种PR蛋白基因的相对表达量。

                                  表1、用于标记探针的质粒

 基因  片段大  小    质粒    限制性内切酶 PR-1a  809bp    pBs    EcoR I PR-1b  约550bp    pBs    EcoR I PR-2  1204bp    pBs    Bam H I/Hind III PR-3  1020bp    pBs    EcoR I PR-4  645bp    pBs    EcoR I Pr-5  900bp    pBs    EcoR V/Pst I 酸性几丁质酶(A-C)  1018bp    pBs    EcoR I 碱性几丁质酶(B-C)  1064bp    pBs    EcoR I

5)试验结果

由图1可见，经亚甲兰染色的Hybond-N⁺膜，RNA样品质量很好，上样量基本一致，可以用于杂交。如图2所示，Northern杂交后压成的X-光片上8种PR蛋白均存在本底表达，说明在正常情况下棉花子叶中就有PR蛋白基因的表达。经过对棉花根部不同时间的水提掖处理，远离根部的子叶中也出现了部分PR蛋白基因的表达：其中，PR-4和PR-5在各处理组中均为本底表达，没有诱导表达情况出现；PR-2基因随时间的增加表达量增加，在12h时达到最大值，但12小时后表达量逐渐减至本底表达的量，表现为瞬时诱导，PR-1a、PR-1b、酸性几丁质酶和碱性几丁质酶都表现为较为明显的诱导表达，基本上在12-24小时以后出现最大的表达量。

已知PRs蛋白的易位累积，均不是通过转移从感染部位或诱导物处理部位移动到其它部分的，因此在未直接处理物的子叶检出部分PR蛋白的大量表达，说明本发明制作的有机肥能够诱导棉花产生系统抗病性(systemic acquired resistance)，而不仅仅是局部抗性(local resistance)。

本发明具有效果佳、有广泛应用领域等优点，特别适应于无公害种植的需要及大量农药才能控制病害的作物。

附图说明：

图1为用2％水提液对甜瓜不同生理小种的防治作用效果图。图中：CK为对照，PEN为本发明的有机肥。

图2为用5％水提液对棉花不同品种的防治作用效果图。图中：CK为对照，PEN为本发明的有机肥。

图3为亚甲兰染色的膜。图中可以看到转到膜上的RNA样品质量很好，上样量基本一致。

图4为利用不同的探针进行Northern杂交的结果。

具体实施方式：

以下是本发明的实施例，但本发明的内容并不局限于此。

实施例一：

将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣倒入大水泥池，日晒2天，每隔2小时搅拌一次，直至残渣成为稀膏状；将稀膏状的日晒残渣倒入沸腾炉中，在350℃温度下干燥1小时，粉碎后得到有机肥。有机肥成分的重量百分比为：有机质90％，全氮6.9％，磷1％和钾2.1％。

将本发明的有机肥干粉作为基肥，用常规方法，以每亩100公斤/亩的用量施入大田土壤中，常规栽培、管理棉花品种鲁棉研21号，结果表明：病株率比对照下降35％，产量增加11％。

实施例二：

将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣倒入大水泥池，日晒3.5天，每隔3小时搅拌一次，直至残渣成为稀膏状；将稀膏状的日晒残渣倒入沸腾炉中，在300℃温度下干燥2.5小时，粉碎后得到有机肥。有机肥成分的重量百分比为：有机质92％，全氮6％，磷0.8％和钾1.2％。

将本发明的有机肥干粉作为基肥，以每亩100公斤/亩的用量施入大田土壤中，蕾期追施20公斤/亩，常规栽培、管理棉花品种鲁棉研21号，病株率比对照下降52％，产量增加16％。

实施例三：

将医药工业生产青霉素的固-液混合废弃残渣倒入大水泥池，日晒5天，每隔4小时搅拌一次，直至残渣成为稀膏状；将稀膏状的日晒残渣倒入沸腾炉中，在250℃温度下干燥4小时，粉碎后得到有机肥。有机肥成分的重量百分比为：有机质89％，全氮8％，磷1.1％和钾1.9％。

将本发明的有机肥干粉作为基肥，以每亩100公斤/亩的用量施入大田土壤中，蕾期追施20公斤/亩，常规栽培、管理棉花品种鲁棉研21号，病株率比对照下降52％，产量增加16％。

实施例四：

基本同发明内容中诱导抗病性试验3的过程。不同之处为：取西瓜(Citrulluslanatus cv.Malali)种子进行试验。

本发明的有机肥可以诱导植物表达PR-1a、PR-1b、酸性几丁质酶和碱性几丁质酶，产生系统抗病性，本身又是一种很好的生物有机肥，具备了很好的应用开发前景。