一种海洋绿藻在提取抗肿瘤活性环肽组分中的应用

摘要

本发明涉及抗肿瘤活性环肽组分，具体地说是一种单细胞多核海洋绿藻在提取抗肿瘤活性环肽组分中的应用；本发明优点为：原料易得，资源丰富；制备的抗肿瘤环肽组分毒副作用小，抗肿瘤活性较好；制备工艺简单；成本低；可开发潜力大，应用性好。

说明书

技术领域

本发明涉及抗肿瘤活性环肽组分，具体地说是一种单细胞多核海洋绿藻在提取抗肿瘤活性环肽组分中的应用。

背景技术

癌症、心血管疾病、爱滋病是威胁人类健康的三大类主要疾病，因而也是当前全球研究最热门的三种疾病。针对这三类疾病目前所用的药物大多是化学合成药物，毒副作用极大，而且至今尚没有得到一种特别理想的合成药物。从天然药源生物中筛选具有抗肿瘤、抗病毒活性的化合物，进而通过化学修饰或半合成成为具有独特疗效的天然药物及药源，其意义特别重大。

环肽是指一类主要由α-氨基酸和一些不常见的非蛋白氨基酸以肽键形成的环状天然小分子化合物。环肽的结构同大环超分子如冠醚、环糊精、杯芳烃等有所相似，容易形成氢键网络；此外，环肽还存在内在构象约束，因而在超分子化学及分子识别方面引起了人们的广泛注意。

专利号为93108015.0、94103298.1、95105200.4、97194526.8、96192543.4、97195724.X、01817777.8等中国专利中分别就一些已有环肽结构进行了修饰，产生了一定的活性，但是化学修饰的环肽构型多没有天然存在环肽构型稳定，并且化学修饰或合成的环肽具有一定毒性，又容易污染环境。

以往专利中环肽多来源于陆地动物、植物、微生物，资源有限、种类单一，如CN99815515.2、CN02114663.2等。海洋生物以其物种的多样性及其代谢产物的化学结构的多样性为优势，已经成为生物活性物质的巨大宝库。海洋生物不同于陆地生物，海洋生物中蕴藏着大量结构新颖、化学性质特殊、生物活性极其强烈的物质。海洋生物所含的肽类化合物，特别是环肽类化合物，在抗肿瘤、抗病毒、抗菌以及酶抑制剂活性方面显示了巨大的潜力，这方面的研究一直是海洋天然产物化学研究中最吸引人、最活跃的领域之一。目前就已经在海洋生物中鉴定的200多个环肽类化合物而言，主要来源于海鞘、海绵、软体动物、蓝藻以及微生物，其中大部分化合物来源于软体动物海鞘和海绵，但是海鞘和海绵资源有限、养殖困难，因而限制了环肽类化合物的制备及利用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种单细胞多核海洋绿藻在提取抗肿瘤活性环肽组分中的应用，分离出的环肽组分具有较好抗肿瘤活性、毒副作用小，且其制备工艺简单。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种海洋绿藻在提取抗肿瘤活性环肽组分中的应用。

具体过程为：取新鲜海洋绿藻Bryopsis sp.清洗、挤干，用甲醇或乙醇浸提，过滤得甲醇或乙醇溶液，减压浓缩后依次用的正丁醇和氯仿萃取；取正丁醇层，减压浓缩真空干燥得组分1；氯仿层减压浓缩至干后加甲醇-水和正己烷萃取，待静置分层后取甲醇层，调节甲醇体积浓度为50～80％，然后再加入氯仿静置分层，减压浓缩氯仿层，真空干燥得组分2；

通过分级分离制备的具活性的两组分分别在氯仿和正丁醇中，通过茚三酮丙酮试剂(0.2％)检测两组分(组分1和2)为环肽类物质。

所述甲醇-水的体积比通常为7.5～9∶1～2.5；海洋绿藻Bryopsis sp.通常为藓羽藻Bryopsis hypnoides、塔形羽藻Bryopsis plumosa、假根羽藻Bryopsiscorticulans或Bryopsis maxima。

本发明具有如下优点：

1.原料易得。Bryopsis sp.是一种极其特殊的绿藻，主要分布在热带、亚热带浅海区，每年7月到11中旬月繁殖速度较快，资源丰富，适合于大批量采集储存，而且这种绿藻具有多种繁殖方式，人工养殖也较容易。因此以Bryopsis sp.为材料大批量制备抗肿瘤活性物质提供了极大的资源优势，不存在材料供应不足的问题。

2.环肽组分毒副作用小。Bryposis sp.本身安全、可食，本发明从Bryopsissp.中制备的抗肿瘤环肽类组分具有较好的抗肿瘤活性，其为天然活性物质，与其它化学合成药物相比更具有毒副作用小，因此其可作为保健品和药剂口服，特别是可作为抗肿瘤试剂以片剂、胶囊、液体、糖浆等的形式口服。

3.制备工艺简单。通过简单的有机试剂分级分离、制备Bryposis sp.环肽具有资源优势、工艺简洁等特点。

4.成本低。所用试剂为乙醇或甲醇、正丁醇、氯仿等，所以生产成本低，由此可以降低这种肿瘤治疗药物的价格。

5.应用性好。本发明由海洋绿藻——Bryopsis sp.中发现并制备两具有抗肿瘤活性的环肽组分，两环肽类组分在疾病治疗上具有潜在的利用价值，属于极有潜力的海洋天然活性物质，可在治疗肿瘤、抗病毒及功能性食品、保健品上应用。两活性环肽组分还可进一步分离、纯化，鉴定结构，进行适当的修饰或以其本身制备更加高效的抗肿瘤药物。

附图说明

图1为Bryposis sp.环肽组分制备工艺流程。

具体实施方式

实施例1

参见图1所示，Bryopsis sp.环肽组分的制备工艺流程。

新鲜Bryopsis sp.，用蒸馏水迅速清洗2～3遍、挤干，称重约1kg；每次用2L甲醇回流提取3次，各2h，过滤，合并3次所得甲醇滤液，减压浓缩至体积1～1.5L，然后依次用等体积的正丁醇和氯仿萃取；正丁醇层再用等体积蒸馏水洗1～2次，静置分层取正丁醇层，减压浓缩，真空干燥为组分1。氯仿层减压浓缩至干后加甲醇-水(体积比9∶1)和正己烷各1L，待静置分层后取甲醇层，调节甲醇浓度到60％，然后再加入等体积的氯仿静置分层；减压浓缩氯仿层，真空干燥得组分2。

以水合茚三酮为显色剂，采用薄层原位化学反应方法(浓盐酸，110℃，1～2h)，对组分1、2检测确认为环肽类化合物。这类化合物易结晶，熔点大多高于200℃，多为左旋体，亲脂性较强，可溶于弱及中等极性的溶剂，如氯仿、甲醇、乙酸乙酯、苯等溶剂，因而可以用这类有机试剂分级提取。

抗肿瘤活性体外筛选实验：

1)四氮咪盐(Microculture Tetrozolium，MTT)还原法：

细胞株：P388小鼠白血病；作用时间：48小时；结果分析：组分1与组分2对P388小鼠白血病都具有抑制作用。组分1在1mg/ml作用明显；组分2在1mg/ml、0.25mg/ml、0.063mg/ml活性较强。

                表1环肽组分对P388小鼠白血病细胞生长的影响

                          对肿瘤细胞的抑制率％

浓度(mg/ml)  样品编号                         P388  品价  4  1  0.25  0.063  0.016    组分1  74.3  85.4  50.6  44.1  25.0  有活性    组分2  45.6  90.4  92.4  96.9  76.7  有活性

2)磺酰罗丹明B(Sulfor Rodamine B，SRB)蛋白染色法

细胞株：A-549人肺癌细胞；作用时间：72h：结果分析：组分1、对A-549人肺癌细胞生长具有较好的抑制效果，组分2在0.25mg/ml作用明显。

                表2环肽类组分对A-549人肺癌细胞生长影响

                        对肿瘤细胞的抑制率％

浓度(mg/ml)  样品编号                          A-549  品价  4  1  0.25  0.063  0.016    组分1  86.1  92.5  39.2  23.0  0  有活性    组分2  71.4  73.0  83.0  66.4  49.1  有活性

由以上结果表明，通过简单的有机试剂分级分离、制备Bryposis sp.环肽具有资源优势、工艺简洁等特点；Bryposis sp.本身安全、可食，并且已制备两环肽组分具有较好的抗肿瘤活性。

实施例2

取新鲜藓羽藻(Bryopsis hypnoides)，用蒸馏水迅速清洗2遍、挤干，称重约1kg；每次用3L乙醇提取3次，各2h，过滤，合并3次所得乙醇滤液，减压浓缩至体积1～1.5L，然后依次用等体积的正丁醇和氯仿萃取。正丁醇层再用等体积蒸馏水液洗1～2次，取正丁醇层，减压浓缩，真空干燥为组分1。氯仿层减压浓缩至干后加甲醇-水(体积比8.5∶1.5)2L和正己烷1L，待静置分层后取甲醇层，调节甲醇浓度到80％，然后再加入等体积的氯仿静置分层；减压浓缩氯仿层，真空干燥得组分2。

实施例3

取新鲜塔形羽藻(Bryopsis plumosa)，用蒸馏水迅速清洗2遍、挤干，称重约1kg；每次用2.5L乙醇提取2次，各4h，过滤，合并2次所得乙醇滤液，减压浓缩至体积1～1.5L，然后依次用等体积的正丁醇和氯仿萃取；正丁醇层再用等体积蒸馏水洗1次，取正丁醇层，减压浓缩，真空干燥为组分1。氯仿层减压浓缩至干后加甲醇-水(体积比8.5∶1.5)和正己烷各0.8L，待静置分层后取甲醇层，调节甲醇浓度到80％，然后再加入等体积的氯仿静置分层；减压浓缩氯仿层，真空干燥得组分2。

实施例4

取新鲜假根羽藻(Bryopsis corticulans)，用蒸馏水迅速清洗4遍、挤干，称重约1kg；每次用2L乙醇提取4次，各2h，过滤，合并4次所得乙醇滤液，减压浓缩至体积1～1.5L，然后依次用等体积的正丁醇和氯仿萃取；正丁醇层再用等体积蒸馏水洗3次，取正丁醇层，减压浓缩，真空干燥为组分1。氯仿层减压浓缩至干后加甲醇-水(体积比9∶1)和正己烷各1.2L，待静置分层后取甲醇层，调节甲醇浓度到70％，然后再加入等体积的氯仿静置分层；减压浓缩氯仿层，真空干燥得组分2。

实施例5

取新鲜Bryopsis maxima，用蒸馏水迅速清洗4遍、挤干，称重约1kg；每次用3L乙醇提取2次，各3h，过滤，合并2次所得乙醇滤液，减压浓缩至体积1～1.5L，然后依次用等体积的正丁醇和氯仿萃取；正丁醇层再用等体积蒸馏水洗2次，取正丁醇层，减压浓缩，真空干燥为组分1。氯仿层减压浓缩至干后加甲醇-水(体积比9∶1)和正己烷各1.5L，待静置分层后取甲醇层，调节甲醇浓度到50％，然后再加入等体积的氯仿静置分层；减压浓缩氯仿层，真空干燥得组分2。