法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-10-01
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/52 授权公告日:20090318 终止日期:20130805 申请日:20030805
专利权的终止
2009-03-18
授权
授权
2005-12-21
实质审查的生效
实质审查的生效
2005-10-26
公开
公开
发明背景
本发明涉及一种谷氨酸乙醛酸氨基转移酶(GGT)活性提高的植物。
本发明还涉及一种谷氨酸乙醛酸氨基转移酶(GGT)和/或编码GGT的基因的利用方法。
另外，本发明涉及提高植物和/或其种子中的氨基酸含量，尤其是提高选自丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)组成的组中的1种或1种以上的氨基酸含量的方法，以及氨基酸含量，尤其是选自丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)组成的组的1种或1种以上氨基酸的含量提高的植物，及该植物的制备方法。
本发明进一步涉及将本发明的植物和/或种子用于制造食品或饲料，及含有这些植物和/或种子的食品或饲料。
一般认为在消耗由RuBisco的加氧酶活性产生的乙醇酸的光合作用中，乙醇酸在过氧化物酶体中通过乙醇酸加氧酶转化为乙醛酸，而乙醛酸通过至少2种乙醛酸氨基转移酶进行代谢(Somerville：PNAS77：2684-2687，1980)。迄今为此，在过氧化物酶内起作用的乙醛酸氨基转移酶基因还未被确定，但最近Liepman等报告了在拟南芥(Arabidopsis thaliana)的光合作用系统中起作用的定位于过氧化物酶体中的丙氨酸：谷氨酸乙醛酸氨基转移酶(Plant.J.25：487-498)，但仍不了解谷氨酸乙醛酸氨基转移酶的基因。而且，也未必弄得清此谷氨酸乙醛酸氨基转移酶活性对包含以植物的谷氨酸为主的各种氨基酸含量、总氨基酸含量的增减、光合作用能、逆境耐性在内的植物特性有什么样的作用，也没有报导揭示通过对具有谷氨酸乙醛酸氨基转移酶活性的蛋白质或编码它的基因进行操作，能改善植物的种种特性的可能性，尤其是实际提高植物体或种子中总氨基酸含量和/或特定氨基酸的含量的可能性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高谷氨酸乙醛酸氨基转移酶(GGT)活性的植物及该植物的制备方法，以及这类植物的种子。
另外，本发明的目的还在于提供一种与在相同条件下栽培的同种野生植物相比，植物中的氨基酸含量，尤其是选自丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、谷氨酰胺(Gln)、天冬酰胺(Asn)组成的组中的1种或1种以上的氨基酸的含量提高的植物及该植物的制备方法、及该植物的种子。
本发明的另一个目的在于提供一种GGT及其编码基因的新型利用方法。
更具体而言，本发明的目的在于提供一种利用GGT及其编码基因提高植物中氨基酸含量的方法。
本发明的目的在于提供一种含有植物和/或种子的饲料或食品，该植物和/或种子中的氨基酸含量，尤其是选自Ser、Arg、Gln、Asn组成的组的1种或1种以上的氨基酸的含量提高，以及此类植物和/或其种子在饲料或食品制造中的使用。
本发明的进一步目的在于提供一种由上述氨基酸含量提高了的植物和/或种子中制备含有氨基酸，尤其是选自Ser、Arg、Gln、Asn组成的组的1种或1种以上的氨基酸的植物提取物的制备方法，以及上述氨基酸含量提高的植物和/或种子在制备氨基酸，尤其是选自Ser、Arg、Gln、Asn组成的组中的1种或1种以上的氨基酸中的用途。
本发明的目的还在于提供本发明的植物和/或其种子在作为以氨基酸为出发原料生产其他物质的基础或材料中的用途。
本发明提供一种植物，其谷氨酸乙醛酸氨基转移酶(GGT)的活性与同种野生型植物相比较有所提高。
本发明提供一种植物，其特征为与同种野生型植物相比，具有GGT活性的基因的转录量增大。
另外本发明提供一种以提高GGT活性为特征的，提高植物中的氨基酸含量、尤其是提高植物中选自的丝氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺组成的组的1种或1种以上的氨基酸含量的方法。
本发明还提供一种导入了基因构建体的转化植物，其与在相同条件下栽培的同种天然植物或对应的非转化植物相比GGT活性有所提高，所述的基因构建体是可以提高GGT基因表达的基因构建体，具体说来是可表达GGT基因的基因构建体和/或能提高具有内在GGT活性的基因的表达量的基因构建体。
本发明还是一种提高植物的GGT活性的方法，其特征为向植物中导入可以提高GGT基因表达的基因构建体，具体说来所述的基因构建体是表达GGT基因的基因构建体和/或可提高具有内在GGT活性基因的表达量的基因构建体。
本发明还提供一种制备GGT活性提高的植物的方法，其特征为通过使与同种野生型植物相比GGT活性提高的植物、或与对应的非转化植物相比GGT活性提高的植物的种子发芽，或使上述植物或来自转化植物细胞的植物体再生，或通过营养繁殖使上述植物或转化植物进行繁殖。
本发明中GGT活性特别是指在过氧化物酶体中的GGT活性。
此处，本说明书中“非转化植物”是指与导入使GGT基因表达提高的基因构建体的转化植物相比，“未导入GGT基因表达提高了的基因构建体的植物”。此“未导入提高GGT基因的表达的基因构建体的植物”中，除野生型植物以外，还包括导入使GGT基因表达提高的基因构建体以外的基因构建体的转化植物。另外，“使GGT基因表达提高的基因构建体”包括能表达GGT基因的基因构建体，例如含有功能性连接到适当启动子上的GGT基因的基因构建体以及可以提高GGT基因转录量的基因构建体，例如含有增强子的构建体。此处，本说明书中的“基因构建体”指以任意形态遗传至子代的构建体，尤其指核酸分子，如果是含有基因的基因构建体，有时特别指“基因构建体”。因此，在“基因构建体”中，除含有基因的核酸分子外，还包括含有转录活化元件、增强子等的核酸片段。
更具体而言，本发明为一种植物，它含有与序列编号2或4中所述的氨基酸序列具有60％或60％以上同源性的氨基酸序列，并且与相同条件下栽培的同种野生型植物相比GGT活性提高。
本发明尤其指一种植物，其中具有序列编号2或4所述的氨基酸序列的GGT活性，与相同条件下栽培的野生型植物相比GGT活性提高。
另外，本发明为一种转化植物，其中导入了含有可与序列编号1或3所述多聚核苷酸在严紧条件下杂交的核苷酸序列的基因构建体，与相同条件下栽培的对应的非转化植物相比较，该转化植物的GGT活性提高。
另外，本发明特别为一种转化植物，其中导入了含有序列编号1或3所述核苷酸序列的基因构建体，与相同条件下栽培的对应的非转化植物相比较，该转化植物的GGT活性提高。
另外，本发明涉及提高植物和/或其种子中的氨基酸含量，尤其是选自Ser、Arg、Gln、Asn组成的组中的1种或1种以上的氨基酸含量提高的方法，所述方法包含通过导入能够表达GGT的基因构建体，制备转化植物的步骤，其中，与在相同条件下栽培的对应的非转化植物相比，上述基因构建体可提高上述转化植物中的GGT活性。本发明还涉及总氨基酸含量提高的植物，尤其是选自Ser、Arg、Gln、Asn组成的组中的1种或1种以上的氨基酸含量提高的植物和/或其种子。
本发明中的植物的GGT活性，与在相同条件下栽培的对应的野生型植物或非转化植物相比，在对应组织中的GGT活性水平优选提高约1.2倍或1.2倍以上，更优选提高约3倍或3倍以上，尤其优选提高约5倍或5倍以上。
附图说明
图1为高等植物中光呼吸途径的模式图。用箭头表示谷氨酸乙醛酸氨基转移酶的催化反应。
图2为来源于拟南芥谷氨酸乙醛酸氨基转移酶的氨基酸序列的比较。同一的氨基酸位点以星号表示。
图3示出来源于拟南芥谷氨酸乙醛酸氨基转移酶的基因结构以及插入pBI101中的位点。外显子以黑长方块表示。用PCR反应对基因组区域5089bp进行扩增，使用基因组上的BamHI与引物上的HindIII位点克隆至pBI101(-GUS/-NOS-ter)中。使用此载体由土壤杆菌导入至GGT1基因破坏株(ggt1-1)中。
图4示出对照株与GGT1导入株生长的比较结果。对于在通常培养条件下培养2周的野生型非转化体(对照)和GGT1导入株，各测定95个植株的(ggt1-1/GGT1)地上部分的重量并进行了比较。
图5为对导入了表达GGT1的构建体的转化植物与野生型非转化植物在GGT1 mRNA水平上进行对比的图表。
图6为导入了表达GGT1的构建体的转化植物与野生型非转化植物的GGT1酶活性水平的对比图表。
图7示出对在PNS培养基上70μmol m-2 s-1的光照条件下发育2周的幼芽的氨基酸含量进行测定的结果。A：主要氨基酸含量(nmol/mgFW)，B：幼芽中的总氨基酸含量(nmol/mg FW)。
图8示出对以PNS作为肥料，在石棉上70μmol m-2 s-1的光照条件下，栽培42天的植物体莲座叶中的氨基酸含量进行测定的结果。A：主要氨基酸含量(nmol/mg FW)，B：幼芽中的总氨基酸含量(nmol/mgFW)。
图9表示在GGT1 mRNA水平上，对在野生型植株中导入表达GGT1的构建体的转化植物和野生型非转化植物进行比较的图表。
图10为向野生型植株导入了表达GGT1的构建体的的转化植物与野生型非转化植物的GGT酶活性(A)及HPR活性(B)的对比图表。以野生型非转化植物的各种酶活性为1。
图11示出对在PNS培养基上，在70μmol m-2 s-1的光照条件下，生长2周的幼芽的丝氨酸含量进行测定的结果。
图12示出分别对向野生型植株导入了表达GGT1的构建体的转化植物与野生型非转化植物的GGT的mRNA水平、GGT酶活性水平、Ser含量进行对比的结果。所示了各种值的相关系数和回归方程式。A：示出对应于GGT1 mRNA相对量的GGT相对酶活性的图表；B：示出对应于GGT1 mRNA相对量的Ser含量图表；C：对应于GGT相对酶活性的Ser含量的图表。
图13示出在1/2MS培养基上，在70μmol m-2 s-1的光照条件下，使其生长2周的幼芽的氨基酸含量测定的结果。A：主要氨基酸含量，B：总氨基酸含量
图14示出从在连续光照及200μmol m-2 s-1光照条件下，用改变的PNS肥料(将5mM KNO3替换为2.5mM NH4NO3)栽培的植物得到的种子中氨基酸含量(n＝4)。分别用每单位新鲜重量的浓度nmol/mgFW表示主要氨基酸含量(A)、精氨酸含量(B)、总氨基酸含量(C)。
图15为在与图14中同样的条件下进行的另一个试验的结果。其中n＝2。分别用每单位新鲜重量的浓度nmol/mg Fw表示主要氨基酸含量(A)、精氨酸含量(B)、总氨基酸含量(C)。
图16示出拟南芥的GGT与推测来源于水稻的GGT的蛋白质的氨基酸水平的同源性。GGT1：拟南芥GGT；Japonica_GGT：推测是Japonica种水稻的GGT的蛋白质；Indica_GGT：估计是Indica种水稻的GGT的蛋白质。同一的氨基酸位点以星号表示。
图17为对导入来源于拟南芥GGT基因的第一代转化水稻，白天叶子中的氨基酸含量进行测定的结果。所述数值为对应于总氨基酸含量的相对值。氨基酸，选择主要氨基酸中相对于总量的相对值为10％左右的氨基酸出示在图中。
实施发明的优选方案
本发明的目的可以通过以下手段实现，即筛选和制备相对于同源野生型植物，谷氨酸乙醛酸转移酶(GGT)活性提高的植物，或对于对应非转代植物，GGT活性提高的转化植物的方法。
例如，本发明的目的可通过以下手段实现，即，将可使编码谷氨酸乙醛酸氨基转移酶(GGT)的基因(GGT基因)表达提高的基因构建体导入到植物中，提高GGT基因的表达。此类基因构建体包含能表达GGT的基因构建体、能表达转录活化因子的基因构建体、具有提高转录活性功能的核酸片段等。
在本发明中的一个实施方案中，将能表达GGT的基因构建体导入植物中，与在相同条件下栽培的对应的非转化植物进行比较，选育编码GGT的基因表达提高的转化植物。
在本发明中其他的实施方案中，可通过提高GGT基因的拷贝数提高GGT基因整体表达。在本发明其他的实施方案中，可通过表达，优选过表达转录活化因子来提高GGT基因的转录量，从而提高GGT活性。在本发明的另一个实施方案中，可通过导入含有具备转录活化功能的顺式元件的增强子等，提高GGT基因的转录量，从而提高GGT的活性。
此处，“谷氨酸乙醛酸氨基转移酶”为具有谷氨酸乙醛酸氨基转移酶活性，也就是具有催化乙醛酸+谷氨酸-＞甘氨酸+酮戊二酸的反应活性的蛋白质总称(参照图1)。尤其是，在此类蛋白质中，包括例如与序列编号2或4中所述氨基酸序列具有至少约60％或60％以上，优选为70％或70％以上，尤其优选为90％或90％以上的氨基酸序列同源性的蛋白质。此类同源性可以使用例如FASTA等本领域技术人员所熟知的程序和标准参数进行计算得到。例如，FASTA Ver.2.0，3.0，3.2，3.3等与标准参数可由国立基因研究所生命情报·DDBJ研究中心(DDBJ/CIB)(http：//www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html)获得。
同样，“编码GGT的基因”或“GGT基因”，也包括编码具有谷氨酸乙醛酸氨基转移酶活性的蛋白质的任何基因。尤其是，在此类基因中，包括例如与序列编号1或3中所述的核苷酸序列优选具有70％或70％以上，更优选具有90％或90％以上同源性的核苷酸序列的基因。此类同源性可以使用例如前所述的FASTA等方法进行计算。具有此类同源性的核酸分子也可以是在严紧的条件下与具有序列编号1或3的核酸分子杂交的核酸分子。在此类基因编码的蛋白质包括在序列编号2或4所述的氨基酸序列中添加、取代、缺失氨基酸后所得氨基酸序列的蛋白质。
此处，“严紧条件”指形成所谓特异性杂交，而不形成非特异性杂交的条件。此条件难以被明确量化，但例如，同源性高的DNA分子间，例如具有70％或70％以上的同源性的DNA分子间可进行杂交时，同源性低于该数值的DNA分子间不能进行杂交的条件，或通常的DNA杂交的洗涤条件为50℃，盐浓度2xSSC，0.1％SDS，优选为1xSSC，0.1％SDS，更优选为优选为0.1xSSC，0.1％SDS下进行杂交的条件。在此条件下杂交的基因中，也包含序列中间产生终止子的基因或活性中心变异缺失的基因，对于这些基因，可将其连接到市售的活性表达载体上，通过上述的GGT酶活性的方法进行测定，从而容易地除去。
本发明中，只要是与序列编号1或3的基因序列具有同源性的基因或与序列编号2或4的氨基酸序列具有同源性的蛋白均可以作为本发明的基因或蛋白质的等价物使用，例如包括来源于水稻的基因或蛋白质。作为此类例子把推测为日本水稻(Oryza sativa japonica)的GGT基因的核苷酸序列，及其所编码的蛋白质的氨基酸序列分别记录为序列编号34和35，同样，把推测为印地佳稻(Oryza sativa indica)的GGT基因的核苷酸序列，及其所编码的蛋白质的氨基酸序列分别记录为序列编号36和37。把来源于拟南芥的GGT1和上述来源于水稻的蛋白质在氨基酸水平上的同源性如图16所示。图16表明GGT1与对应于来源Japonica、Indica种的GGT1蛋白质，在氨基酸水平上的同源性相当高。
另外本发明中使用的GGT基因可以是待转化的植物的同源基因，也可是来自其它供体的异源基因。
另外，所谓“与相同条件下栽培的对应的非转化植物相比GGT活性提高的转化植物”是指，与在相同条件下栽培的对应非转化植物，即与前述转化植物属于相同种类并且没有受GGT基因表达构建体转化的植物的GGT活性相比，由存在于人们关注的转化植物中的对应于非转化植物本身所具有的GGT基因和存在于转化用基因构建体上的GGT基因这两者所产生的总的GGT活性均有提高。本说明书中已说明过所谓“非转化植物”为与导入了能表达GGT基因构建体的转化植物相比，指“未导入能表达GGT基因构建体的植物”。
提高GGT活性还可在基因的转录水平、翻译水平、翻译后的修饰水平的任意水平上进行。例如可举出通过导入能表达GGT的基因构建体，以及控制GGT的表达调节因子及翻译调节因子，转录后调节因子等与调节GGT活性和/或转录量相关的上游因子，以提高GGT的活性。更具体而言，例如尤其可通过导入表达GGT的基因构建体，或提高内在GGT基因的拷贝数，导入转录活化因子，导入具有使内在GGT基因转录活性提高的增强子等方法而得以实现。这些方法为本领域技术人员所熟知的方法。例如，众所周知，如果在逆境诱导启动子rd29A基因的启动子的控制下，表达DREB1A基因，因应答逆境效应，DREB1A的靶基因的表达与野生型植物相比大幅度提高(Nature Biothechnology 17，287-，1999)。另外，还有为活化转录活性随机插入增强子，可通过从其中筛选具有特征性状的个体确定靶基因的报道(Plant J.，34，741-750，2003；Plant Physiol.，129，1544-1446，2002)。
本发明的转化植物的GGT活性，与在相同条件下栽培的对应非转化植物相比，对应组织中的GGT活性水平优选提高约1.2倍或1.2倍以上，更优选提高约3倍或3倍以上，尤其优选提高约5倍或5倍以上。
另外在mRNA水平方面，本发明的转化植物的GGT mRNA水平与在相同条件下栽培的对应的非转化植物相比，在对应组织中的GGTmRNA水平优选提高约2倍或2倍以上，更优选提高约5倍或5倍以上，最好提高至约30倍或30倍以上。本发明的植物以及通过本发明的方法得到的植物中，GGT活性与mRNA表现出很强的正相关关系。
本说明书中，本发明也包括仅在植物体的一部分中GGT活性提高的植物，例如，只在含块茎的茎、叶、花中GGT活性提高的植物及此类植物的制备方法。因此，只在植物体的一部分中发生总氨基酸量提高、或Ser、Arg、Gln、Asn中的至少1种或1种以上的氨基酸含量，尤其是Ser和/或Arg含量提高的情况也包括在本发明范围内。
本发明中GGT活性提高，优选在过氧化物酶体，尤其是光合作用组织的过氧化物酶体中进行。光合作用组织，只要是在通常培养或栽培条件下进行光合作用的组织即可，例如包括茎、叶、皮及其它。
作为本发明的目的GGT基因可从各种植物体中取得。例如，GGT基因，可通过在数据库中以谷氨酸乙醛酸氨基转移酶、或丙氨酸氨基转移酶为关键词进行检索，得到其DNA碱基序列信息。根据序列信息进行RT-PCR、5’-RACE、3’-RACE，可以获得全长的cDNA。另外可根据已知的DNA序列信息使用适当的探针通过杂交从cDNA文库中筛选出目的基因。此筛选中使用的探针可以根据GGT的氨基酸或碱基序列进行制备。
本发明中，如前所述应提高表达的GGT优选定位于过氧化物酶体、尤其是光合作用组织中的过氧化物酶体中。此类GGT在过氧化物酶体中的定位，可通过过氧化物酶体中定位蛋白质的特征N末端附近的序列或C末端附近序列的存在进行推测。作为此类序列，例如作为N末端侧序列有Arg-(Leu/Gln/Ile)-X5-His-Leu或与之类似的序列、作为C末端侧序列有(Ser/Ala)-(Arg/Lys)-(Ile/Leu/Met)或与之类似的序列。另外，也可通过人工方法在具有GGT活性的蛋白质上附加上述过氧化物酶体中定位蛋白质的特征N末端序列或C末端序列。另外，可在得到的GGT基因上融合GFP或GUS等报告基因，使其保持在过氧化物酶体中的定位性，并在细胞内表达，从而也可以通过观察进行确认。另外，也可表达具有末端标记的GGT，使用特异性抗体确认其局部定位性。
本发明中，为提高GGT基因表达的基因构建体，可采用本领域技术人员所熟知的方法进行制备。用于GGT基因表达的启动子，只要是可在植物体内起作用的启动子即可，如可以利用通过花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子(EMBO J.6：3901-3907，1987)、玉米遍在蛋白启动子(Plant Mol.Biol.，18：675-689，1992)、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子等驱动GGT的表达的基因构建体。尤其优选高表达的启动子。作为终止子只要是能在植物细胞内起作用的即可，例如可以使用来源于CaMV的终止子和来源于氮氧化物合成酶基因(NOS)的终止子。另外，也可利用存在于植物基因组中的GGT表达单元。另外，关于包括设计和分离核酸构建体，并确定其序列方法的分子生物学手段，可以参照例如：Sambrook等著，分子克隆实验室指南(Molecular cloning-Laboratory manual)，第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)之类的文献。或者，为制备本发明中能使用的核酸构建体需要用以PCR法为主的基因扩增，关于此类手段可参照如：F.M.Ausubel et alo.(eds)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)等。
在上述实施方案中对可以使用的核酸构建体导入方法并无特别限制，可根据宿主适当的选择本领域技术人员所熟知的植物细胞或植物体的基因导入法。例如可使用土壤杆菌的基因导入法、电转法、或利用基因枪导入。利用土壤杆菌时，优选转移的序列插入在左右的T-DNA边界(border)序列之间。适当设计和构建基于这种T-DNA的转化载体是本领域技术人员所熟知的。另外，使用含有此类核酸构建体的土壤杆菌感染特定植物时所需的条件也为本领域技术人员所熟知。关于此类技术以及条件，可参照例如：秀润社，细胞工程分册《模式植物的实施验报告 水稻·拟南芥编》(1996)等。
对进行基因改变操作的植物种类并无特别限制，优选易于栽培及转化并且在植物体中已确立了再生系统的植物种类。适用于本发明的植物除具有上述特性之外，更优选已确立大规模栽培技术的植物种类或具有较高食用价值的植物等。在这些植物中，除了作为模式的植物的拟南芥以外，还包含水稻、玉米、小麦、甜菜、木薯、菠菜、卷心菜、莴苣、生菜、芹菜、黄瓜、番茄、蚕豆、大豆、小豆、四季豆、豌豆等。这些植物可以为天然的品种，也可为基因已进行遗传修饰的植物，例如为对植物来说可以是天然的GGT基因表达提高的植物。经遗传修饰的植物，可从现有的文库，例如从现有的基因强表达文库中选择。
接下来，对已进行如上所述基因操作的植物细胞等进行转化体筛选。此筛选，可通过例如以存在于用于转化的核酸构建体上的标记基因表达为基础进行。例如，当标记基因为抗药性基因时，可通过在含有适当的浓度的抗生素或除草剂等的培养基上培养经修饰的植物细胞等或使经修饰的植物细胞等生长，以进行筛选。或者，当标记基因为β-葡糖醛酸糖苷酶、荧光素酶基因等时，可以通过对其活性进行筛选以筛选出转化体。以此确定的转化体，例如，可由原生质体、愈伤组织、外植体等再生植物。对于用于此再生的宿主植物可利用本领域技术人员所熟知的方法。以此得到的植物体以通常的方法，即与非转化体同样的条件、或适合于各转化体的条件下进行栽培即可，为确定含有本发明的核酸结构物的转化植物，在根据上述标记基因进行筛选的基础上，还可以利用各种分子生物学的手段。为研究GGT基因在基因组中的插入情况、确定插入位置、确认插入基因组中的拷贝数等，可以利用DNA杂交、PCR、RNA印迹及RT-PCR等方法。
然后，可对所得的转化植物的GGT蛋白质含量、GGT活性、及GGT的mRNA水平进行评定。例如蛋白质的量可通过蛋白质印迹等方法、mRNA水平可通过RNA印迹、定量RT-PCR等方法进行评定。而GGT活性可通过一般的方法(Plant Physiol.99：1520-1525)进行测定。例如在测定光合作用组织中的GGT活性时，首先使用液氮将植物的叶等光合作用组织冷冻后进行粉碎，以适当的提取液，例如含有100mM Tris-HCl(pH7.3)、10mM DDT的缓冲液悬浮，进行超滤，以前述的方法(Plant Physiol.99：1520-1525)进行测定即可。在测定局部定位于过氧化物酶体内的GGT活性时，可根据一般方法(PlantPhysiol.43：705-713，J.Biol.Chem.243：5179-5184，Plant Physiol.49：249-251)，分离过氧化物酶体，以前述的方法进行测定即可。这些方法也都为本领域技术人员所熟知。
本发明中，转化植物的GGT活性相对于相同条件下栽培的对应非转化植物，优选在对应组织中的GGT活性水平提高约1.2倍或1.2倍以上，更优选提高约3倍或3倍以上，特别优选提高约5倍或5倍以上。
得到的植物，可对植物体内的氨基酸含量进行评定。氨基酸含量，可通过例如破碎植物体或它的一部分，将提取液在普通的氨基酸分析装置中进行检测。例如，在由植物或其一部分构成的样品中加入80％乙醇500μl，以细胞粉碎机MM300(QIAGEN)进行破碎后，在80℃下处理10分钟以提取氨基酸。离心分离后，将减压旋转残留的样品溶解于0.02N的HCl中配制成分析样品。使样品通过0.22μm的滤膜以除去不纯物，可使用氨基酸分析仪LS-8800(HITACHI)测定氨基酸的含量，进行氨基酸分析。相对于相同条件下生长的对照植物，植物体中的氨基酸含量，可以总氨基酸含量、丝氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)中至少1种的含量，在特定组织，优选在光合作用组织、例如可以叶中的总氨基酸含量、Ser、Arg、Gln、Asn的1种以上的含量提高比例等作为指标进行量化，有时还根据情况进行统计学处理。其结果，对于任意一个1或1以上的指标，只要其提高在统计学上是有意义的，例如以5％作为有效标准，那么对应于该结果即可以判断与对照植物相比，总氨基酸量、或Ser、Arg、Gln、Asn含量的至少1或1以上具有有意义的提高。
另外，GGT基因表达提高的植物，也有可能是从随机插入增强子和T-DNA标记的植物文库中获得GGT活性提高的植物。
另外，GGT基因表达提高的植物，也可不通过上述的直接分子生物学手段获得。即，也可通过使已知的诱变剂作用，以上述特性作为指标，提高GGT基因的表达，筛选出GGT活性提高的植物。诱导植物变异的物质及诱导变异方法为本领域技术人员所熟知。作为诱变剂例如可利用EMS、甲基亚硝脲(methyl-nitrosourea)、γ-线、UV、离子束、X射线的照射等。
通过本发明，可得到氨基酸含量提高，尤其是Ser、Arg、Gln、Asn中1种或1种以上氨基酸含量提高的植物。尤其通过本发明，可得到总氨基酸含量相对于相同条件下栽培的对应非转化植物或野生型植物优选提高约1.5倍或1.5倍以上，更优选提高4倍或4倍以上的成熟植物。尤其对于Ser含量，通过本发明，与同种野生植物或对应的非转化植物相比，可获得约2倍或2倍以上，优选为3倍或3倍以上、尤其优选为20倍或20倍以上的提高。对于Arg、Gln、Asn含量也可获得1.5倍或1.5倍以上，优选为3倍或3倍以上，最优选为5倍或5倍以上的提高。尤其对于Asn、Arg可获得5倍或5倍以上的提高。
另外，可通过只以硝酸盐的形式施用氮肥栽培本发明的植物，可以特别提高Ser含量。另一方面也可通过掺入氨态氮肥，在提高Ser含量的基础上同时提高Asn、Gln、Arg的含量。因此，也通过改变栽培条件、尤其是氮肥的性质，也可以控制本发明植物的氨基酸含量。
要对这样得到的氨基酸含量提高的植物进行鉴定，也可检测其性质是否在遗传上得到稳定地保持。为此在通常光照条件下栽培植物体并取得种子，可对其后代的性质以及分离进行分析。转化体后代中是否存在导入核酸构建体、其位置、其表达等可使用与第一代转化体类似的方法进行分析。不通过直接导入基因获得本发明植物的情况下，可以同样分析有无遗传变异、其定位等。
对于氨基酸含量提高的植物，根据序列是来源于整合到导入基因组中的核酸构建体的序列，还是被变异或破坏的基因，可能有杂合型或纯合型的情况，根据需要可通过异体受精的方式获得杂合体或纯合体。来源于整合至基因组中的核酸构建体的序列根据孟德尔的遗传法则在后代中进行分离。因此，为实现本发明的目的，从保持性状稳定的观点出发，优选使用纯合型植物。本发明的植物可在通常栽培条件下进行栽培。
本发明的植物，可通过由GGT活性提高的植物或上述氨基酸含量提高的植物的细胞和植物体的一部分再生植物体的方法进行制备和/或繁殖。例如，通过在MS基本培养基中加入适当的激素的培养基上培养本发明的植物细胞或组织，根据情况经过愈伤组织等细胞形成或胚胎形成阶段，对具有本发明植物特性的植物进行再生。这种从植物细胞或植物的一部分再生植物体的技术为本领域技术人员所熟知。本发明的GGT活性提高的植物或上述氨基酸含量增大的植物可以通过种子进行繁殖时，从本发明植物上采取种子，优选采取杂合型种子，根据通常的方法，例如通过简单播种于适当的土壤中，可得到具有上述特性的本发明的植物。
制造本发明的种子时，尤其优选栽培纯合体植物，回收其种子。纯合体的筛选，可通过重复培育子代，直至所需表现型不分离为止，即，在所有后代中筛选显示所需表现型的株进行纯合体筛选。另外，还可通过PCR或DNA分析筛选纯合体。本发明的种子，可按照有关植物体的前述方法，通过测定其氨基酸含量，与从相同条件下栽培的对应野生型植物得到的种子作比较，确认氨基酸含量、尤其是Ser、Arg、Gln、Asn中的至少1种的含量提高情况。
另外，本发明的植物为可以进行营养繁殖时，可以从植物的一部分直接繁殖和/或使其繁殖为具有本发明特性的植物。此类繁殖方法为本领域技术人员所熟知(例如可参照：讲谈社 园艺大百科10栽培方法，1980)。营养繁殖方法中包括有如白薯或胡萝卜等使用块根或块茎的方法、插枝的方法、接枝的方法等，但并不局限于此。如此制备和/或繁殖的植物的特性，尤其是氨基酸含量可以按照上述的方法进行评价。
本发明的植物及种子，可作为食品或食品材料，进行与对应的野生型植物相同的利用。因此，本发明的植物及种子，可直接或通过通常的烹调方法及加工方法作为食品进行利用，也可以作为饲料使用。
为从本发明的、或通过本发明的方法使氨基酸含量、尤其是Ser、Arg、Gln、Asn的至少1种含量提高的植物中，得到含有这些氨基酸的植物提取物，可利用从植物中获得含有氨基酸组分提取物的一般已知方法，尤其是为了提取含有Ser、Arg、Gln、Asn中的至少1种组份的方法。为从含有Ser、Arg、Gln、Asn的至少1种的提取物中对上述任意一种氨基酸进行纯化，可以利用包括各种层析色谱的，本领域技术人员共知的多种方法。
以下的实施例，所示以作为模式植物的拟南芥、及水稻为材料获得本发明的植物的方法，以及得到的植物及种子的特性。如本领域技术人员所知，本发明的植物、其种子、及本发明的方法并不局限于拟南芥和水稻这些特定的植物种类。
另外，根据本说明书公开的内容，如本领域技术人员所知，GGT基因在转化植物的制备中可作为标记基因使用。例如，为赋予对特异抑制GGT的物质的耐受性、赋予逆境耐性等目的，可利用GGT基因，用于在此类抑制物质的存在下或压力下的转化植物的筛选。
实施例
所有植物的栽培均在以下条件下进行：
在平板上使用以下成分作为用于培养的基本培养基：含1％(w/v)蔗糖、0.05％(w/v)MES(2-(N-吗啉)乙磺酸)、的PNS(Mol.Gen.Genet.204：430-434)或MS(Physiol Plant 15：473-479)无机盐类和0.8(w/v)琼脂。如果在石棉(rock wool)上进行栽培，则只使用PNS无机盐作为营养源。
另外，以已经取得的拟南芥GGT缺失株作为模式植物用于转化试验。GGT缺失株的获得方法在参考例1及2中示出。
参考例1.拟南芥的GGT缺失株的获得
(1)制备用于筛选GGT缺失株的引物
GGT基因，由于它也是AlaAT基因因此根据拟南芥的丙氨酸氨基转移酶(AlaAT)基因信息获得GGT基因。
根据因特网上公开的AlaAT基因数据(GenBank)，预测AlaAT(GGT)拷贝数及序列以制备引物。以丙氨酸氨基转移酶及拟南芥为关键词进行数据检索，得知至少在基因组上存在4个拷贝、预想为GGT基因的基因。各基因的GenBank登录号为AC005292(F26F24.16)、AC011663(F5A18.24)、AC016529(T10D10.20)、AC026479(T13M22.3)。各基因分别被命名为GGT1、GGT2、GGT3及GGT4，把各cDNA核苷酸序列记为序列编号1、3、5及7，把预想的氨基酸序列分别记为序列编号2、4、6及8。相对于GGT1的GGT2、GGT3、GGT4的同源性如下面表1所示。预想的各氨基酸的比较如图2所示。
表1.GGT1和GGT2、GGT3、GGT4各自间的同源性(％)
根据对EST信息进行研究的结果，可以推测4拷贝中GGT1的表达量最高。于是以GGT1序列为基础，制备用于筛选基因破坏株的PCR引物(表2)。这些引物，根据Kazusa DNA研究所提供的系统进行设计。
表2.用于筛选基因破坏株的PCR引物
*序列采用通常的表示方法，即以5’-＞3’方向。
(3)GGT破坏株的分离
利用Kazusa DNA研究所提供的系统，对基因破坏拟南芥文库进行有关GGT的筛选。筛选按照植物细胞工程学系列14《植物基因组研究报告书》(秀润社)2-4-c中所述的顺序进行操作。
1次筛选使用(AAT1U/AAT1L)作为基因侧的引物，在标记引物中分别在各对应的池中分别使用(00L/02L/03L/04L/05L/06L/00R/02R/03R/04R/05R/06R)。使用的标记引物与各池之间的关系在表3中表示。
表3.标记引物与各池之间的关系
聚合酶使用EX-taq(TAKARA)。反应液的组成为20μl中约含38.4ng(约100pgx384)模板DNA、10pmol标记引物、10pmol基因引物、2μl 10x缓冲液、5nmol dNTP、0.5U Ex-taq。PCR循环以94℃45秒、52℃45秒、72℃3分钟为一个循环，进行35次循环。将10μl PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分离。观察经EtBr染色扩增的DNA片段。将此凝胶在变性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中浸泡20分钟进行变性后，在中和液(0.5M Tris-HCl(pH8.0)，1.5MNaCl)中浸泡20分钟，使用20xSSC(3M NaCl，0.3M柠檬酸钠)印迹至膜-HybondN+(Amersham Pharmacia Biotech)上。印迹后，以UV交联使DNA固定在膜上。使用AlkPhos-Direct DNA detectionkit(Amersham Pharmacia Biotech)按照附带的说明书进行杂交和检测。杂交在65℃下进行。使用AAT1U/AAT1L为探针，以基因组DNA作为模板进行PCR，使用GFX PCR DNA和Gel Band纯化试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)纯化其扩增片段。
第1次筛选中，以从384个独立的标记插入种系(line)中提取的基因组DNA混合物为1池(pool)，对54个池(384×54＝20736种系)进行PCR。对扩增产物进行DNA杂交分析以确认目的产物被扩增。对第1次筛选中得到的显示阳性结果的池P0035进行第2次筛选。用于第2次筛选的PCR的引物组合为，第1次筛选中得到的显示阳性结果的AAT1U/00L和AAT1L/00L。第2次筛选的结果表明，GGT1已插入到单一的株系8046中。
(4)标记插入位置的确定
以从确定的标记插入种系提取的DNA为模板，以2组引物组合(AATU/00L，AAT1L/00L)进行PCR，扩增的片段被克隆至pGEMT-easy vector(Promega)。使用DNA测序仪ABI PRI SMTM377 DNAsequencer(PERKIN ELMER)确定序列。
标记伴随第6外显子上16bp的缺失而被插入，显然通过标记的插入由176-GGTLV-180被取代为176-AIQL(end)-180。
参考例2.GGT缺失纯合体株的获得
(1)纯合体的筛选
把确定插入标记的种系的T2种子播种到含有10mg/l的潮霉素的MS培养基上。3周后移植至石棉上从Rossetto叶的约5mm四方形的样品中提取DNA。提取方法采用Li的方法(Plant J.8：457-463)。为确定纯合体，使用夹着标记的引物(AAT1U/AAT1L2)进行PCR。PCR以变性94℃30秒，退火57℃30秒，延伸72℃60秒的条件进行30次循环。对照使用野生型的基因组DNA为模板。PCR产物的一部分用1％的琼脂糖凝胶电泳进行分离。在35个种系中存在11个纯合体种系。
(2)GGT表达的检测
对于得到的纯合体种系，使用其子代，通过RT-PCR确认是否引起基因损坏。将来源于纯合体的种子在含有10mg/l的潮霉素的MS培养基上播种，确认所有的个体均显示耐受性。使用ISOGEN(日本基因)从播种后2周的幼小植物提取全部RNA。DNase处理后使用superscript II(GIBCO)从寡聚dT引物上进行逆转录，以合成的单链cDNA为模板，使用夹着标记的引物(AAT1RTU/AAT1RTL)进行PCR。PCR以变性94℃30秒，退火57℃30秒，延伸72℃60秒的条件进行28次循环。使用EF1-α(EFU/EFL)为对照。PCR产物的一部分使用1％琼脂糖通过电泳进行分离。插入标记的种系中未检测到GGT1的完整mRNA。
根据此结果分析表明，将此插入标记株命名为ggt1-1。此ggt1-1在通常的光照强度下生长受到明显抑制，但在弱光照下(约30μmolm-2 s-1)与非转化植物相比其生长并无大的差异。另外，以下述方法测定GGT活性的结果表明，ggt1-1中GGT活性显著降低。因此，使用ggt1-1作为用于提高GGT活性的实验材料。
实施例1.GGT活性提高的转化植物的制备
(1)表达GGT基因的基因构建体的导入
5089bp的GGT1的基因组区域以PCR法进行扩增。上游引物使用(5’-CAATAACAATGCAAAGTTAAGATTCGGATC-3’：序列编号28)，下游引物使用(5’-GCTTCTTCTCAACCATCGTCACC-3’：序列编号29)。把编码GGT1的核酸序列和GGT的氨基酸序列如序列编号1及2所示，导入基因的结构如图3所示。将扩增片段克隆至除去GUS/NOS-ter的二元载体(binary-vector)pBI101的HindIII和BamHI位点，由土壤杆菌介导导入至拟南芥的GGT1基因破坏株(ggt1-1)。把得到的转化体在PNS培养基上播种后，在70μmol m-2 s-1的光照条件下使其生长2周，测定幼小植物地上部分的重量时，完全弥补了由基因破坏引起的生长抑制作用，而且与野生型相比促进了生长(图4)。
(2)GGT基因表达的确认
导入基因的表达通过定量PCR进行确认。在含50mg/l卡那霉素的1/2MS培养基上播种，选择所有个体均显示耐受性的种系作为RNA提供源。使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)从在PNS培养基上以30μmol m-2 s-1的光照条件下繁殖2周长出的幼芽的地上部分中提取总RNA。DNase处理后使用superscript II(GIBCO)从oligo dT引物上进行逆转录，以合成的单链cDNA为模板，使用定量PCR用引物(5’-TTCTTCTTCTGAACGACTATTGTG-3’：序列编号30，及5’-GAATAGGGCAAAGAGAAAGAGTG-3’：序列编号31)进行PCR。
使用(5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’：序列编号32及5’-GGTGCAACGACCTTAATCTTCAT-3’：序列编号33)作为ACTIN2的定量PCR用引物。定量PCR使用ABI PRISM 7700，反应条件以50℃2分钟，95℃10分钟为一个循环，接着以95℃15秒，60℃60秒为循环进行40次循环。
分别进行3次独立的RNA提取实验，根据ACTIN2的表达量对GGT1的表达量进行标准化处理。GGT1的表达量的定量结果在图5中显示。基因导入种系中表达量提高了2倍左右。
实施例2.GGT活性提高的转化植物的特性评价
(1)GGT酶活性的测定
为了测定酶活性，从在PNS培养基上播种2周、30μmol m-2 s-1的光照条件下长出的幼芽的地上部分提取蛋白质。将新鲜质量约200mg的植物体以液氮冷冻，使用研钵和药杵破碎组织。加入1ml提取用缓冲液[100mM Tris-HCl(pH7.3)，10mM DTT]，以15,000rpm进行10分钟离心分离，除去不溶物。进一步重复3次相同的操作。脱盐处理使用超滤膜UFV5BGC00(微孔，Millipore)进行。将进行10,000rpm进行约45分钟离心分离的提取液0.5ml浓缩至10倍。用提取缓冲液稀释至10倍，进行3次相同的操作。使用Protein assay kit(Bio-Rad)测定蛋白质浓度。加入含10％甘油的提取用缓冲液使粗提取液的最终浓度达到1mg/ml，作为粗提取液。
GGT(Glu+glyoxylate-＞Gly+αKG)的活性通过与由NAD+GDH(EC 1.4.1.3)引起的NADH的氧化反应结合，根据340nm下的OD变化进行测定。反应中，相对于0.6ml反应液[100mM Tris-HCl(pH7.3)，100mM Glu，0.11mM吡哆醛5-磷酸，0.18mM NADH，15mM乙醛酸，500U/l GDH(G2501)]使用50μg粗提取液。使用HPR的活性作为对照。HPR的活性通过NADH氧化引起的340nm下的OD变化进行测定。反应中，相对于0.6ml反应液[100mMTris-HCl(pH7.3)，5mM羟基丙酮酸及0.18mM NADH]使用50μg粗提取液。GGT和HPR活性在图6中示出。可以看出，与对应的非转化植物相比，GGT基因导入种系中的GGT活性约为2倍。
(2)氨基酸分析
为测定游离的氨基酸，在PNS培养基上播种后、于70μmol m-2 s-1的光照条件下生长2周的幼体植物地上部分，及以PNS为营养源的在石棉上栽培6周的植物的Rossetto叶中提取氨基酸。以液氮冷冻新鲜质量约为100mg的植物体，保存于-80℃。在冷冻的样品中加入80％乙醇500μl，用细胞破碎机MM300(QIAGEN)进行破碎后，在80℃下处理10分钟提取氨基酸。以15,000rpm进行10分钟离心分离后取上清，在沉淀中加入80℃的80％乙醇500μl，充分搅拌后再次于80℃处理10分钟。以15,000rpm进行10分钟离心分离后取上清作为氨基酸提取液。对1ml氨基酸提取液进行减压旋转，完全除去乙醇及水分。溶于500μl的水和等量的二乙醚中，对离心分离后的下层进行减压旋转。在残留的样品中加入0.02N HCl使最终浓度达到10μl/mgFW，旋转后进行离心分离回收上清。通过0.22μm的滤膜除去不纯物作为分析用样品。
使用氨基酸分析仪LS-8800(HITACHI)进行氨基酸分析。总氨基酸含量和主要氨基酸的含量(nmol/mg FW)在图7和8中示出。分析的结果为GGT1过量表达种系中丝氨酸含量明显提高，在石棉上生长的植物中总的氨基酸含量、精氨酸含量也有提高。
(3)氮含量分析
测定在PNS培养基上播种后、70μmol m-2 s-1的光照条件下生长2周长出的幼体植物地上部分的氮含量。测定使用住友化学分析中心制的SUMIGRAPH NC-1000进行测定。测定的结果为，如表4所示GGT过量表达种系中每单位干重的总氮含量有所提高。
表4.相对干燥质量的总氮的比例(％)
实施例3 GGT活性更进一步提高的转化植物的制备
为了制作GGT活性进一步提高的植物，在野生型植株中导入表达GGT基因的基因构建体，进行特性评价。另外，把GGT1基因破坏株(ggt1-1)中导入GGT表达构建体得到的GGT1基因导入株记录为(ggt1-1/GGT1)，把在野生型植株中导入GGT表达构建体得到的GGT1基因导入株记录为(WT/GGT1)表示。
(1)GGT基因表达用基因构建体的导入
使用和实施例1(1)中所示的方法同样的方法将GGT1基因导入至野生型植株(Col-0)。
(2)GGT基因表达的确认
导入基因的表达使用实施例1(2)所述的方法进行确认。使用在PNS培养基上栽培2周的野生株、2株系(ggt1-1/GGT1)、及7株系(WT/GGT1)作为RNA的提供源。GGT1表达量的定量结果在图9中示出。在基因导入种系中表达量提高了5～30倍。
实施例4 进一步提高GGT活性的转化植物的特性评价
(1)GGT酶活性测定
使用实施例2(1)所述的方法进行酶活性测定。GGT活性及作为对照的HPR活性在图10中示出。与野生型相比GGT基因导入种系中GGT活性约为2～6倍。
(2)氨基酸分析
使用实施例2(2)所述的方法进行游离氨基酸含量的测定。在图11中示出在PNS培养基上生长的，实施例3(2)及4(1)中GGT表达量与酶活性被测定的株系中的丝氨酸含量(nmol/mg FW)。另外，合计40系统的测定结果在表5中示出。表达量、酶活性、丝氨酸含量的关系在图12中示出。在1/2MS培养基上生长的植物的主要氨基酸含量和总氨基酸含量在图13中示出。种子中的氨基酸含量在图14及图15中示出。分析结果为在GGT1过表达种系中丝氨酸含量最多提高了20倍。对表达量、酶活性、丝氨酸含量进行比较时，分别显示出有意义的相关性。
表5.Ser含量
表5.续
另外在1/2MS培养基上生长时，与野生型对照相比，No4株中除丝氨酸以外天冬酰胺提高5倍左右，谷氨酰胺提高3倍左右，精氨酸提高5倍左右，总氨基酸提高4倍左右。另外，GGT1过量表达株在氮源只由硝酸态构成的PNS培养基上栽培时Ser含量明显提高，在含氨态氮的1/2MS培养基上栽培时除了Ser含量提高以外，天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸提高了3～5倍左右。
种子中的氨基酸在连续光照及200μmol m-2 s-1的光照条件下，使用在改变的PNS肥料(5mM KNO3被取代为NH4NO3)上栽培的植物体得到的种子进行测定。ggt1-1/GGT1 4-7株与野生型比较，可以看到天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、甘氨酸、精氨酸的积蓄提高。而且总氨基酸含量也提高。
实施例5 西红柿马铃薯的GGT转化体的制备
(1)西红柿转化体的制备
使用70％乙醇(30秒)、2％次氯酸钠(15分钟)对西红柿(栽培品种，Mini tomato(株)福花园种苗)的种子进行表面灭菌后，接种于不含植物激素的MS琼脂培养基上，在16小时日照，25℃下培养1周。从得到的无菌幼小植物上切取子叶，接种于添加了2mg/l玉米素和0.1mg/l吲哚醋酸的MS琼脂培养基(使用再分化培养基，9cm皿)中，以相同条件培养2天。将含有构建基因的土壤杆菌(EHA101)在YEP培养基(表-3)上培养一晚，以用于感染。把培养2天的子叶收集到灭菌的玻璃皿中，加入土壤杆菌液，使其感染。使用灭菌的滤纸将多余的土壤杆菌液从子叶上去除，另外，为防止土壤杆菌的急剧增殖，上述使用的玻璃皿培养基中铺上灭菌滤纸，其上面放置径感染的子叶，进行24小时共同培养。
然后，将子叶转移至含50mg/l卡那霉素、500mg/l头孢噻肟(クラフオラン)的MS再分化培养基(筛选培养基)，进行转化体的筛选。将再分化的新芽转移至新的筛选培养基中进行再筛选。切取绿色旺盛生长的新芽的茎的部分，转移至不含植物激素的MS培养基(生根培养基，试管中)。将生根的再分化植物连续移植至土壤中进行适应性栽培。
表6.YEP培养基组成
(2)马铃薯转化体的制备
通过茎尖培养获得马铃薯(土豆)的无菌植物，通过茎尖传代增加材料。在加入2％蔗糖的MS液体培养基(10ml)中放入茎尖，诱导生根。生根后，添加含有16％蔗糖的MS液体培养基10ml，于暗处进行培养，诱导微小块茎。将6～8周后的微小块茎切成片状，去皮后，使用于28℃培养一晚的导入了实施例1(1)所述的基因构建体的土壤杆菌(导入了实施例1(1)所述的基因构建体)进行感染。置于铺有灭菌滤纸的MS琼脂培养基(MS培养基，2.0mg/l玉米素，0.1mg/l吲哚醋酸，0.3％ゲルライト)上，在25℃，16小时日照的条件下共同培养2天。然后转移至筛选培养基{MS培养基，2.0mg/l玉米素，0.1mg/l吲哚醋酸，0.3％ゲルライト，50mg/l卡那霉素，500mg/l头孢噻肟}，在相同条件下培养。1周后转移至新的筛选培养基中，将再分化的新芽转移至不含植物激素的筛选培养基中，诱导生根。使用导入实施例1(1)所述的基因构建体的土壤杆菌进行感染，在含有50mg/l卡那霉素的培养基上进行筛选。
实施例6.水稻的GGT转化体的制备
(1)导入拟南芥GGT1水稻转化体的制作
拟南芥GGT1的cDNA区域以PCR法进行扩增。上游引物使用(5’-GCGGATCCATGGCTCTCAAGGCATTAGACT-3’：序列编号38)，下游引物使用(5’-GCCGAGCTCTCACATTTTCGAATAA-3’：序列编号39)。下划线表示的限制性酶切位点(BamHI，SacI)使扩增的片段连接至CAB启动子(Plant Cell Physiol 42 138-，2001)的下游，取代二元载体pIG121HM的35S启动子+GUS区域。由土壤杆菌介导导入水稻(品种キタアケ)。使用鸟山等的方法进行转化(模式植物的实验报告P93-1996秀润社)。
把在含土壤杆菌的筛选培养基上显示耐受性的个体移植至盆土中后，以叶为样品进行RNA提取，用于氨基酸分析。
(2)GTT1基因表达的确认
对于将耐药性作为指标筛选出的20株，以RT-PCR对导入的基因表达进行确认。使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)提取总RNA。经DNase处理后，使用superscript II(GIBCO)从oligo dT引物进行逆转录，以合成的单链cDNA为模板，使用PCR用引物(5’-TGAAAGCAAGGGGATTCTTG-3’：序列编号40，及5’-GACGTTTTTGCAGCTGTTGA-3’：序列编号41)进行PCR。进行反应的条件为95℃15秒，60℃60秒为一个循环，进行40次循环。检查的20株转化种系中，可以确认GGT1的DNA片段扩增，由此表明导入基因的表达。
(3)导入GGT1基因的水稻的氨基酸含量
游离氨基酸的测定使用实施例2(2)所述的方法进行。在转化体中，与非转化体比较显示Ser含量的有意义提高(图17)。
<序列表freetext>
序列编号9-33，38-41：PCR引物
通过本发明可通过一种谷氨酸乙醛酸氨基转移酶(GGT)的新型利用方法改进植物特性。
通过本发明可以提供GGT活性提高的植物。更具体而言，通过本发明可提供一种在GGT活性水平上，优选提高到约1.2或1.2倍以上、更优选提高到约3或3倍以上、尤其优选提高到约5或5倍以上的植物。
另外通过本发明还可提供一种提高植物和/或其种子的氨基酸含量，尤其是提高Ser、Arg、Gln、Asn中的至少一种氨基酸含量的方法、氨基酸含量，尤其是Ser、Arg、Gln、Asn中的至少一种的含量提高的植物和/或种子、这些植物和/或种子在饲料制造中的使用、及含有谷氨酸含量提高的植物和/或种子的饲料。
另外，通过本发明可容易的获得含有大量Ser、Arg、Gln、Asn中的一种或一种以上氨基酸的植物提取物。
而且，还揭示了植物中的谷氨酰胺、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸含量和赖氨酸含量变化存在很强的相关关系(Plant Cell 15，845-853，2003)，因此，通过谷氨酰胺和/或天冬酰胺含量提高的本发明的植物或此类植物的制备方法，可以提供赖氨酸含量提高的植物。
序列表
<110>Ajinomoto Co.，Inc.
<120>提高植物GGT活性的方法以及提高GGT活性的植物及其制备方法
<130>OP04356
<150>JP 2002-232562
<151>2002-08-09
<150>JP 2003-194431
<151>2003-07-09
<160>41
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1446
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1443)
<223>
<400>1
atg gct ctc aag gca tta gac tac gat act ctg aat gaa aac gtc aag 48
Met Ala Leu Lys Ala Leu Asp Tyr Asp Thr Leu Asn Glu Asn Val Lys
1 5 10 15
aag tgt cag tat gcc gta aga ggt gaa ctt tat ctc cga gct tct gag 96
Lys Cys Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu Leu Tyr Leu Arg Ala Ser Glu
20 25 30
ctg cag aaa gaa ggc aaa aag gtt att ttc aca aac gtt ggg aac cct 144
Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Val Ile Phe Thr Asn Val Gly Asn Pro
35 40 45
cat gct tta gga cag aag cca ttg aca ttt cct cgc cag gtg gtt gcg 192
His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr Phe Pro Arg Gln Val Val Ala
50 55 60
ctt tgc caa gct ccg ttt cta cta gat gac cca aat gtt gga atg cta 240
Leu Cys Gln Ala Pro Phe Leu Leu Asp Asp Pro Asn Val Gly Met Leu
65 70 75 80
ttt cca gct gat gct att gca aga gct aaa cat tat ctt tcc ttg act 288
Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala Lys His Tyr Leu Ser Leu Thr
85 90 95
tca ggc ggt tta ggt gct tac agt gat tca aga ggc ctt cca gga gtt 336
Ser Gly Gly Leu Gly Ala Tyr Ser Asp Ser Arg Gly Leu Pro Gly Val
100 105 110
agg aaa gag gtt gct gag ttc att caa cgg cgt gat ggg tat cca agt 384
Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Gln Arg Arg Asp Gly Tyr Pro Ser
115 120 125
gac cca gaa ctc atc ttt ctc act gat gga gct agc aaa ggt gtg atg 432
Asp Pro Glu Leu Ile Phe Leu Thr Asp Gly Ala Ser Lys Gly Val Met
130 135 140
caa atc ttg aat tgt gtt ata cgc ggt aat gga gat ggg att cta gtt 480
Gln Ile Leu Asn Cys Val Ile Arg Gly Asn Gly Asp Gly Ile Leu Val
145 150 155 160
ccg gtt cca cag tat cca ctt tac tca gct acc ata tca ctg tta ggt 528
Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala Thr Ile Ser Leu Leu Gly
165 170 175
ggt act ctt gtt cct tac tat ctt gat gag tct gaa aac tgg gga ctt 576
Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Asp Glu Ser Glu Asn Trp Gly Leu
180 185 190
gat gtt gct aac ctt cga caa tcc gtt gct cag gct cgt tct caa ggg 624
Asp Val Ala Asn Leu Arg Gln Ser Val Ala Gln Ala Arg Ser Gln Gly
195 200 205
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Glu Asn Val Tyr Val Pro Asp Lys Lys Phe His Ser Phe Lys Lys Val
325 330 335
Ala Arg Ser Leu Gly Tyr Gly Glu Lys Asp Ile Ser Leu Val Ser Phe
340 345 350
Gln Ser Val Ser Lys Gly Tyr Tyr Gly Glu Cys Gly Lys Arg Gly Gly
355 360 365
Tyr Met Glu Val Thr Gly Phe Thr Ser Asp Val Arg Glu Gln Ile Tyr
370 375 380
Lys Met Ala Ser Val Asn Leu Cys Ser Asn Ile Ser Gly Gln Ile Leu
385 390 395 400
Ala Ser Leu Val Met Ser Pro Pro Lys Pro Gly Asp Asp Ser Tyr Asp
405 410 415
Ser Tyr Met Ala Glu Arg Asp Gly Ile Leu Ser Ser Met Ala Lys Arg
420 425 430
Ala Lys Thr Leu Glu Asp Ala Leu Asn Ser Leu Glu Gly Val Thr Cys
435 440 445
Asn Arg Ala Glu Gly Ala Met Tyr Leu Phe Pro Arg Ile Asn Leu Pro
450 455 460
Gln Lys Ala Ile Glu Ala Ala Glu Ala Glu Lys Thr Ala Pro Asp Ala
465 470 475 480
Phe Tyr Cys Lys Arg Leu Leu Asn Ala Thr Gly Val Val Val Val Pro
485 490 495
Gly Ser Gly Phe Gly Gln Val Pro Gly Thr Trp His Phe Arg Cys Thr
500 505 510
Ile Leu Pro Gln Glu Asp Lys Ile Pro Ala Ile Val Asn Arg Leu Thr
515 520 525
Glu Phe His Lys Ser Phe Met Asp Glu Phe Arg Asn
530 535 540
<210>7
<211>1638
<212>DNA
<213>拟南芥
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1635)
<223>
<400>7
atg cgg aga ttc gtg att ggc caa gct aaa aat ctc ata gat cag agt 48
Met Arg Arg Phe Val Ile Gly Gln Ala Lys Asn Leu Ile Asp Gln Ser
1 5 10 15
cgt cgt cgt caa ctt cat cat cac aaa aat ctc agc ttt gtc tct ctt 96
Arg Arg Arg Gln Leu His His His Lys Asn Leu Ser Phe Val Ser Leu
20 25 30
att cct cct ttt tct gct cct tcc gat tct tca tcg cgc cac ttg tct 144
Ile Pro Pro Phe Ser Ala Pro Ser Asp Ser Ser Ser Arg His Leu Ser
35 40 45
tct tct tct tct tcc gat atg tct gct tct gat tcc tct tcc tct ctt 192
Ser Ser Ser Ser Ser Asp Met Ser Ala Ser Asp Ser Ser Ser Ser Leu
50 55 60
ccc gtt act ctt gac acc atc aac ccc aag gtt atc aaa tgt gag tat 240
Pro Val Thr Leu Asp Thr Ile Asn Pro Lys Val Ile Lys Cys Glu Tyr
65 70 75 80
gct gtc cgt gga gaa att gtc aac att gct cag aaa ttg caa gaa gat 288
Ala Val Arg Gly Glu Ile Val Asn Ile Ala Gln Lys Leu Gln Glu Asp
85 90 95
ttg aag act aac aag gac gct tat ccc ttt gat gag att atc tac tgt 336
Leu Lys Thr Asn Lys Asp Ala Tyr Pro Phe Asp Glu Ile Ile Tyr Cys
100 105 110
aat atc ggg aat cct caa tct ctt ggt caa cag cct ata aca ttc ttc 384
Asn Ile Gly Asn Pro Gln Ser Leu Gly Gln Gln Pro Ile Thr Phe Phe
115 120 125
aga gag gtt ctt gct tta tgt tcc tac aca gcc ctg ttg gat gag agt 432
Arg Glu Val Leu Ala Leu Cys Ser Tyr Thr Ala Leu Leu Asp Glu Ser
130 135 140
gca aca cac ggt ttg ttc agg ttc agt tct gat tcg att gag cgt gct 480
Ala Thr His Gly Leu Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ser Ile Glu Arg Ala
145 150 155 160
tgg aag att ctg gac caa att ccc ggg aga gcg act ggt gct tac agc 528
Trp Lys Ile Leu Asp Gln Ile Pro Gly Arg Ala Thr Gly Ala Tyr Ser
165 170 175
cac agc cag ggt atc aag ggg tta cgt gat gca att gct gat gga atc 576
His Ser Gln Gly Ile Lys Gly Leu Arg Asp Ala Ile Ala Asp Gly Ile
180 185 190
gaa gcc cgt gat ggt ttc cct gct gat cct aat gat ata ttc atg aca 624
Glu Ala Arg Asp Gly Phe Pro Ala Asp Pro Asn Asp Ile Phe Met Thr
195 200 205
gat ggt gca agt cca ggg gta cat atg atg atg caa ctt ctc ata act 672
Asp Gly Ala Ser Pro Gly Val His Met Met Met Gln Leu Leu Ile Thr
210 215 220
tca gag aaa gat gga atc ctt tgt cct att cct cag tat cca ttg tac 720
Ser Glu Lys Asp Gly Ile Leu Cys Pro Ile Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr
225 230 235 240
tca gct tca att gcc ctt cac ggt gga act ttg gtt cca tac tac ctt 768
Ser Ala Ser Ile Ala Leu His Gly Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu
245 250 255
gat gaa gca tca gga tgg ggt ctt gaa ata tct gag ctg aag aaa caa 816
Asp Glu Ala Ser Gly Trp Gly Leu Glu Ile Ser Glu Leu Lys Lys Gln
260 265 270
ctt gaa gat gct agg tca aag ggc atc act gtg aga gct ttg gct gtc 864
Leu Glu Asp Ala Arg Ser Lys Gly Ile Thr Val Arg Ala Leu Ala Val
275 280 285
att aac cct gga aac ccg aca ggg cag gtt ctt tcg gaa gaa aac cag 912
Ile Asn Pro Gly Asn Pro Thr Gly Gln Val Leu Ser Glu Glu Asn Gln
290 295 300
cgt gac gtt gtt aag ttc tgc aag caa gag ggt tta gtt ctt tta gca 960
Arg Asp Val Val Lys Phe Cys Lys Gln Glu Gly Leu Val Leu Leu Ala
305 310 315 320
gac gag gtt tat caa gag aat gtc tat gtc cct gac aaa aag ttc cat 1008
Asp Glu Val Tyr Gln Glu Asn Val Tyr Val Pro Asp Lys Lys Phe His
325 330 335
tcc ttc aag aaa gta gcc cgc tct atg ggc tac ggt gag aag gat ctt 1056
Ser Phe Lys Lys Val Ala Arg Ser Met Gly Tyr Gly Glu Lys Asp Leu
340 345 350
gcc tta gtc tct ttc caa tct gtc tcc aaa ggg tac tat gga gag tgt 1104
Ala Leu Val Ser Phe Gln Ser Val Ser Lys Gly Tyr Tyr Gly Glu Cys
355 360 365
ggg aaa aga ggt ggt tac atg gag gtt act gga ttc act tct gat gta 1152
Gly Lys Arg Gly Gly Tyr Met Glu Val Thr Gly Phe Thr Ser Asp Val
370 375 380
aga gag cag ata tac aaa atg gct tct gtg aat ctt tgt tcc aac atc 1200
Arg Glu Gln Ile Tyr Lys Met Ala Ser Val Asn Leu Cys Ser Asn Ile
385 390 395 400
tct ggt caa att ctt gct agc ctc atc atg agc cca ccc aag cct ggt 1248
Ser Gly Gln Ile Leu Ala Ser Leu Ile Met Ser Pro Pro Lys Pro Gly
405 410 415
gac gac tcc tat gaa tca tac ata gca gag aag gat gga att ctc tca 1296
Asp Asp Ser Tyr Glu Ser Tyr Ile Ala Glu Lys Asp Gly Ile Leu Ser
420 425 430
tct ttg gca aga cgt gca aag act ctt gaa gag gct ctg aac aag cta 1344
Ser Leu Ala Arg Arg Ala Lys Thr Leu Glu Glu Ala Leu Asn Lys Leu
435 440 445
gag gga gtt aca tgc aat aga gca gaa gga gct atg tat cta ttc cct 1392
Glu Gly Val Thr Cys Asn Arg Ala Glu Gly Ala Met Tyr Leu Phe Pro
450 455 460
tgc ctt cac ctt cca caa aag gca att gca gct gct gag gcg gaa aag 1440
Cys Leu His Leu Pro Gln Lys Ala Ile Ala Ala Ala Glu Ala Glu Lys
465 470 475 480
aca gca cca gac aat ttc tac tgc aaa cgc ctt cta aaa gct act gga 1488
Thr Ala Pro Asp Asn Phe Tyr Cys Lys Arg Leu Leu Lys Ala Thr Gly
485 490 495
ata gtc gtt gtc cct ggt tct ggc ttt aga cag gta cct gga aca tgg 1536
Ile Val Val Val Pro Gly Ser Gly Phe Arg Gln Val Pro Gly Thr Trp
500 505 510
cat ttc agg tgc act ata ctt ccc caa gag gat aag att cca gcg att 1584
His Phe Arg Cys Thr Ile Leu Pro Gln Glu Asp Lys Ile Pro Ala Ile
515 520 525
gtt gat cgt cta act gcg ttc cac cag agc ttc atg gac gag ttc cgc 1632
Val Asp Arg Leu Thr Ala Phe His Gln Ser Phe Met Asp Glu Phe Arg
530 535 540
gac taa 1638
Asp
545
<210>8
<211>545
<212>PRT
<213>拟南芥
<400>8
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1 5 10 15
Arg Arg Arg Gln Leu His His His Lys Asn Leu Ser Phe Val Ser Leu
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Ile Pro Pro Phe Ser Ala Pro Ser Asp Ser Ser Ser Arg His Leu Ser
35 40 45
Ser Ser Ser Ser Ser Asp Met Ser Ala Ser Asp Ser Ser Ser Ser Leu
50 55 60
Pro Val Thr Leu Asp Thr Ile Asn Pro Lys Val Ile Lys Cys Glu Tyr
65 70 75 80
Ala Val Arg Gly Glu Ile Val Asn Ile Ala Gln Lys Leu Gln Glu Asp
85 90 95
Leu Lys Thr Asn Lys Asp Ala Tyr Pro Phe Asp Glu Ile Ile Tyr Cys
100 105 110
Asn Ile Gly Asn Pro Gln Ser Leu Gly Gln Gln Pro Ile Thr Phe Phe
115 120 125
Arg Glu Val Leu Ala Leu Cys Ser Tyr Thr Ala Leu Leu Asp Glu Ser
130 135 140
Ala Thr His Gly Leu Phe Arg Phe Ser Ser Asp Ser Ile Glu Arg Ala
145 150 155 160
Trp Lys Ile Leu Asp Gln Ile Pro Gly Arg Ala Thr Gly Ala Tyr Ser
165 170 175
His Ser Gln Gly Ile Lys Gly Leu Arg Asp Ala Ile Ala Asp Gly Ile
180 185 190
Glu Ala Arg Asp Gly Phe Pro Ala Asp Pro Asn Asp Ile Phe Met Thr
195 200 205
Asp Gly Ala Ser Pro Gly Val His Met Met Met Gln Leu Leu Ile Thr
210 215 220
Ser Glu Lys Asp Gly Ile Leu Cys Pro Ile Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr
225 230 235 240
Ser Ala Ser Ile Ala Leu His Gly Gly Thr Leu Val Pro Tyr Tyr Leu
245 250 255
Asp Glu Ala Ser Gly Trp Gly Leu Glu Ile Ser Glu Leu Lys Lys Gln
260 265 270
Leu Glu Asp Ala Arg Ser Lys Gly Ile Thr Val Arg Ala Leu Ala Val
275 280 285
Ile Asn Pro Gly Asn Pro Thr Gly Gln Val Leu Ser Glu Glu Asn Gln
290 295 300
Arg Asp Val Val Lys Phe Cys Lys Gln Glu Gly Leu Val Leu Leu Ala
305 310 315 320
Asp Glu Val Tyr Gln Glu Asn Val Tyr Val Pro Asp Lys Lys Phe His
325 330 335
Ser Phe Lys Lys Val Ala Arg Ser Met Gly Tyr Gly Glu Lys Asp Leu
340 345 350
Ala Leu Val Ser Phe Gln Ser Val Ser Lys Gly Tyr Tyr Gly Glu Cys
355 360 365
Gly Lys Arg Gly Gly Tyr Met Glu Val Thr Gly Phe Thr Ser Asp Val
370 375 380
Arg Glu Gln Ile Tyr Lys Met Ala Ser Val Asn Leu Cys Ser Asn Ile
385 390 395 400
Ser Gly Gln Ile Leu Ala Ser Leu Ile Met Ser Pro Pro Lys Pro Gly
405 410 415
Asp Asp Ser Tyr Glu Ser Tyr Ile Ala Glu Lys Asp Gly Ile Leu Ser
420 425 430
Ser Leu Ala Arg Arg Ala Lys Thr Leu Glu Glu Ala Leu Asn Lys Leu
435 440 445
Glu Gly Val Thr Cys Asn Arg Ala Glu Gly Ala Met Tyr Leu Phe Pro
450 455 460
Cys Leu His Leu Pro Gln Lys Ala Ile Ala Ala Ala Glu Ala Glu Lys
465 470 475 480
Thr Ala Pro Asp Asn Phe Tyr Cys Lys Arg Leu Leu Lys Ala Thr Gly
485 490 495
Ile Val Val Val Pro Gly Ser Gly Phe Arg Gln Val Pro Gly Thr Trp
500 505 510
His Phe Arg Cys Thr Ile Leu Pro Gln Glu Asp Lys Ile Pro Ala Ile
515 520 525
Val Asp Arg Leu Thr Ala Phe His Gln Ser Phe Met Asp Glu Phe Arg
530 535 540
Asp
545
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<220>
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<213>人工的
<220>
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<211>26
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<211>26
<212>DNA
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<212>DNA
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<220>
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<211>25
<212>DNA
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<212>DNA
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<220>
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<210>27
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<220>
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<220>
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<400>29
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<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
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<400>30
ttcttcttct gaacgactat tgtg 24
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<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
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<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>32
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<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>33
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<210>34
<211>1443
<212>DNA
<213>Oryza sativa Japonica
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1440)
<223>
<400>34
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Met Phe Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Lys Pro Leu Asp Tyr Glu
1 5 10 15
gag ctg aac gag aac gtg aag aag gtg cag tac gcg gtg cgg ggg gag 96
Glu Leu Asn Glu Asn Val Lys Lys Val Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu
20 25 30
ctg tac ctg cgc gcc tcc gag ctc cag aag gag ggc aag aag atc atc 144
Leu Tyr Leu Arg Ala Ser Glu Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Ile Ile
35 40 45
ttc acc aac gtc ggc aac cca cac gcg ctc ggc cag aag ccg ctc acc 192
Phe Thr Asn Val Gly Asn Pro His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr
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ttc ccc cgc cag gtt gtg gcg ctg tgc cag gcc ccc ttc ctg ctc gat 240
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gat ccc aac gtc ggc ctt atc ttc ccc gcc gac gcc atc gcg cgg gcc 288
Asp Pro Asn Val Gly Leu Ile Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala
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aag cac tac ctc gcc atg gca ccc ggt gga cta gct tac agt gat tcc 336
Lys His Tyr Leu Ala Met Ala Pro Gly Gly Leu Ala Tyr Ser Asp Ser
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cga ggt atc cct ggt att agg aag gaa gtc gcc gag ttc atc gag agg 384
Arg Gly Ile Pro Gly Ile Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Glu Arg
115 120 125
cgt gat ggt tat cca gat cca gaa ctt att tac ctc aca gat ggt gcc 432
Arg Asp Gly Tyr Pro Asp Pro Glu Leu Ile Tyr Leu Thr Asp Gly Ala
130 135 140
agc aaa ggt gtg atg caa atg ctg aat acc att atc aga aat gag aga 480
Ser Lys Gly Val Met Gln Met Leu Asn Thr Ile Ile Arg Asn Glu Arg
145 150 155 160
gat ggg att ctg gtt cct gtt cca caa tac ccg ctt tat tct gct gcc 528
Asp Gly Ile Leu Val Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala Ala
165 170 175
att tcc ctc ttt ggt ggt tct ctc gtg cca tac tac tta gaa gaa gag 576
Ile Ser Leu Phe Gly Gly Ser Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Glu Glu Glu
180 185 190
gct aac tgg gga ctt gac ttc gtc aat ctc cga cag act gtg gcg tca 624
Ala Asn Trp Gly Leu Asp Phe Val Asn Leu Arg Gln Thr Val Ala Ser
195 200 205
gcg cgg tca aag gga atc act gtt cga gca atg gtg att atc aac cca 672
Ala Arg Ser Lys Gly Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile Asn Pro
210 215 220
gga aac cct act ggc caa tgc ctt agt gaa gga aac ata aag gaa ctt 720
Gly Asn Pro Thr Gly Gln Cys Leu Ser Glu Gly Asn Ile Lys Glu Leu
225 230 235 240
ctc aaa ttc tgc ttc cat gag aac tta gtt ctg ctt gca gat gaa gtc 768
Leu Lys Phe Cys Phe His Glu Asn Leu Val Leu Leu Ala Asp Glu Val
245 250 255
tat caa cag aac att tat caa gat gag cgc cca ttt ata agt gct aga 816
Tyr Gln Gln Asn Ile Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser Ala Arg
260 265 270
aag gtt ctg ttt gac atg ggt cct cct atg agc agg gaa gtt cag ctg 864
Lys Val Leu Phe Asp Met Gly Pro Pro Met Ser Arg Glu Val Gln Leu
275 280 285
gtt tct ttc cat act gtg tca aaa gga tat tgg ggg gag tgt gga caa 912
Val Ser Phe His Thr Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys Gly Gln
290 295 300
cgt gga ggg tat ttt gaa atg aca aat ctt cct ccc aag aca gta gac 960
Arg Gly Gly Tyr Phe Glu Met Thr Asn Leu Pro Pro Lys Thr Val Asp
305 310 315 320
gag atc tac aag gtt gca tca atc gca ctc agt cca aat gtt cct ggg 1008
Glu Ile Tyr Lys Val Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val Pro Gly
325 330 335
cag atc ttt atg ggt tta atg gtt aac cct cct aag cct gga gat atc 1056
Gln Ile Phe Met Gly Leu Met Val Asn Pro Pro Lys Pro Gly Asp Ile
340 345 350
tct tat ctg aag ttt tct gct gaa aag tct atc ctc gag tct ttg agg 1104
Ser Tyr Leu Lys Phe Ser Ala Glu Lys Ser Ile Leu Glu Ser Leu Arg
355 360 365
agg aga gca cgc ctg atg aca gat ggt ttc aat agt tgc cga aat gtt 1152
Arg Arg Ala Arg Leu Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys Arg Asn Val
370 375 380
gtc tgc aat ttc aca gaa gct atg tac tct ttc ccc caa ata cgc tta 1200
Val Cys Asn Phe Thr Glu Ala Met Tyr Ser Phe Pro Gln Ile Arg Leu
385 390 395 400
cca cca aaa gct ata gat gca gcc aaa agg gct ggc aaa gcg gcc gat 1248
Pro Pro Lys Ala Ile Asp Ala Ala Lys Arg Ala Gly Lys Ala Ala Asp
405 410 415
gtt ttc tac tgc ctc aag ctt ctt gaa gca act gga ata tcc act gtt 1296
Val Phe Tyr Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly Ile Ser Thr Val
420 425 430
cca ggg tca ggt ttc gga caa aaa gaa gtg ttc cac ctg agg acg acc 1344
Pro Gly Ser Gly Phe Gly Gln Lys Glu Val Phe His Leu Arg Thr Thr
435 440 445
atc ctg cca gct gag gag gac atg cct gcc atc atg acc agc ttc aag 1392
Ile Leu Pro Ala Glu Glu Asp Met Pro Ala Ile Met Thr Ser Phe Lys
450 455 460
aag ttc aac gac act ttc atg gat cag tac gat ggc tac tcc agg atg 1440
Lys Phe Asn Asp Thr Phe Met Asp Gln Tyr Asp Gly Tyr Ser Arg Met
465 470 475 480
tga 1443
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<212>PRT
<213>Oryza sativa Japonica
<400>35
Met Phe Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Lys Pro Leu Asp Tyr Glu
1 5 10 15
Glu Leu Asn Glu Asn Val Lys Lys Val Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu
20 25 30
Leu Tyr Leu Arg Ala Ser Glu Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Ile Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Lys His Tyr Leu Ala Met Ala Pro Gly Gly Leu Ala Tyr Ser Asp Ser
100 105 110
Arg Gly Ile Pro Gly Ile Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Glu Arg
115 120 125
Arg Asp Gly Tyr Pro Asp Pro Glu Leu Ile Tyr Leu Thr Asp Gly Ala
130 135 140
Ser Lys Gly Val Met Gln Met Leu Asn Thr Ile Ile Arg Asn Glu Arg
145 150 155 160
Asp Gly Ile Leu Val Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala Ala
165 170 175
Ile Ser Leu Phe Gly Gly Ser Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Glu Glu Glu
180 185 190
Ala Asn Trp Gly Leu Asp Phe Val Asn Leu Arg Gln Thr Val Ala Ser
195 200 205
Ala Arg Ser Lys Gly Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile Asn Pro
210 215 220
Gly Asn Pro Thr Gly Gln Cys Leu Ser Glu Gly Asn Ile Lys Glu Leu
225 230 235 240
Leu Lys Phe Cys Phe His Glu Asn Leu Val Leu Leu Ala Asp Glu Val
245 250 255
Tyr Gln Gln Asn Ile Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser Ala Arg
260 265 270
Lys Val Leu Phe Asp Met Gly Pro Pro Met Ser Arg Glu Val Gln Leu
275 280 285
Val Ser Phe His Thr Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys Gly Gln
290 295 300
Arg Gly Gly Tyr Phe Glu Met Thr Asn Leu Pro Pro Lys Thr Val Asp
305 310 315 320
Glu Ile Tyr Lys Val Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val Pro Gly
325 330 335
Gln Ile Phe Met Gly Leu Met Val Asn Pro Pro Lys Pro Gly Asp Ile
340 345 350
Ser Tyr Leu Lys Phe Ser Ala Glu Lys Ser Ile Leu Glu Ser Leu Arg
355 360 365
Arg Arg Ala Arg Leu Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys Arg Asn Val
370 375 380
Val Cys Asn Phe Thr Glu Ala Met Tyr Ser Phe Pro Gln Ile Arg Leu
385 390 395 400
Pro Pro Lys Ala Ile Asp Ala Ala Lys Arg Ala Gly Lys Ala Ala Asp
405 410 415
Val Phe Tyr Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly Ile Ser Thr Val
420 425 430
Pro Gly Ser Gly Phe Gly Gln Lys Glu Val Phe His Leu Arg Thr Thr
435 440 445
Ile Leu Pro Ala Glu Glu Asp Met Pro Ala Ile Met Thr Ser Phe Lys
450 455 460
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Met Phe Gly Gly Gly Gly Gly Gly Arg Lys Pro Leu Asp Tyr Glu Glu
1 5 10 15
ctg aac gag aac gtg aag aag gtg cag tac gcg gtg cgg ggg gag ctg 96
Leu Asn Glu Asn Val Lys Lys Val Gln Tyr Ala Val Arg Gly Glu Leu
20 25 30
tac ctg cgc gcc tcc gag ctc cag aag gag ggc aag aag atc atc ttc 144
Tyr Leu Arg Ala Ser Glu Leu Gln Lys Glu Gly Lys Lys Ile Ile Phe
35 40 45
acc aac gtc ggc aac cca cac gcg ctc ggc cag aag ccg ctc acc ttc 192
Thr Asn Val Gly Asn Pro His Ala Leu Gly Gln Lys Pro Leu Thr Phe
50 55 60
ccc cgc cag gtt gtg gcg ctg tgc cag gcc ccc ttc ctg ctc gat gat 240
Pro Arg Gln Val Val Ala Leu Cys Gln Ala Pro Phe Leu Leu Asp Asp
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ccc aac gtc ggc ctt atc ttc ccc gcc gac gcc atc gcg cgg gcc aag 288
Pro Asn Val Gly Leu Ile Phe Pro Ala Asp Ala Ile Ala Arg Ala Lys
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cac tac ctc gcc atg gca ccc ggt gga cta ggt gct tac agt gat tcc 336
His Tyr Leu Ala Met Ala Pro Gly Gly Leu Gly Ala Tyr Ser Asp Ser
100 105 110
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Arg Gly Ile Pro Gly Ile Arg Lys Glu Val Ala Glu Phe Ile Glu Arg
115 120 125
cgt gat ggt tat cca agt gat cca gaa ctt att tac ctc aca gat ggt 432
Arg Asp Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Glu Leu Ile Tyr Leu Thr Asp Gly
130 135 140
gcc agc aaa ggt gtg atg caa atg ctg aat acc att atc aga aat gag 480
Ala Ser Lys Gly Val Met Gln Met Leu Asn Thr Ile Ile Arg Asn Glu
145 150 155 160
aga gat ggg att ctg gtt cct gtt cca caa tac ccg ctt tat tct gct 528
Arg Asp Gly Ile Leu Val Pro Val Pro Gln Tyr Pro Leu Tyr Ser Ala
165 170 175
gcc att tcc ccc ttt ggt ggt tct ctc gtg cca tac tac tta gaa gaa 576
Ala Ile Ser Pro Phe Gly Gly Ser Leu Val Pro Tyr Tyr Leu Glu Glu
180 185 190
gag gct aac tgg gga ctt gac ttc gtc aat ctc cga cag act gtg gcg 624
Glu Ala Asn Trp Gly Leu Asp Phe Val Asn Leu Arg Gln Thr Val Ala
195 200 205
tca gcg cgg tca aag gga atc act gtt cga gca atg gtg att atc aac 672
Ser Ala Arg Ser Lys Gly Ile Thr Val Arg Ala Met Val Ile Ile Asn
210 215 220
cca gga aac cct act ggc caa tgc ctt agt gaa gga aac ata aag gaa 720
Pro Gly Asn Pro Thr Gly Gln Cys Leu Ser Glu Gly Asn Ile Lys Glu
225 230 235 240
ctt ctc aaa ttc tgc ttc cat gag aac tta gtt ctg ctt gca gat gaa 768
Leu Leu Lys Phe Cys Phe His Glu Asn Leu Val Leu Leu Ala Asp Glu
245 250 255
gtc tat caa cag aac att tat caa gat gag cgc cca ttt ata agt gct 816
Val Tyr Gln Gln Asn Ile Tyr Gln Asp Glu Arg Pro Phe Ile Ser Ala
260 265 270
aga aag gtt ctg ttt gac atg ggt cct cct atg agc agg gaa gtt cag 864
Arg Lys Val Leu Phe Asp Met Gly Pro Pro Met Ser Arg Glu Val Gln
275 280 285
ctg gtt tct ttc cat act gtg tca aaa gga tat tgg ggg gag tgt gga 912
Leu Val Ser Phe His Thr Val Ser Lys Gly Tyr Trp Gly Glu Cys Gly
290 295 300
caa cgt gga ggg tat ttt gaa atg aca aat ctt cct ccc aag aca gta 960
Gln Arg Gly Gly Tyr Phe Glu Met Thr Asn Leu Pro Pro Lys Thr Val
305 310 315 320
gac gag atc tac aag gtt gca tca atc gca ctc agt cca aat gtt cct 1008
Asp Glu Ile Tyr Lys Val Ala Ser Ile Ala Leu Ser Pro Asn Val Pro
325 330 335
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Gly Gln Ile Phe Met Gly Leu Met Val Asn Pro Pro Lys Pro Gly Asp
340 345 350
atc tct tat ctg aag ttt tct gct gaa agc aag tct atc ctc gag tct 1104
Ile Ser Tyr Leu Lys Phe Ser Ala Glu Ser Lys Ser Ile Leu Glu Ser
355 360 365
ttg agg agg aga gca cgc ctg atg aca gat ggt ttc aat agt tgc cga 1152
Leu Arg Arg Arg Ala Arg Leu Met Thr Asp Gly Phe Asn Ser Cys Arg
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Asn Val Val Cys Asn Phe Thr Glu Gly Ala Met Tyr Ser Phe Pro Gln
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ata cgc tta cca cca aaa gct ata gat gca gcc aaa agg gct ggc aaa 1248
Ile Arg Leu Pro Pro Lys Ala Ile Asp Ala Ala Lys Arg Ala Gly Lys
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gcg gcc gat gtt ttc tac tgc ctc aag ctt ctt gaa gca act gga ata 1296
Ala Ala Asp Val Phe Tyr Cys Leu Lys Leu Leu Glu Ala Thr Gly Ile
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tcc act gtt cca ggg tca ggt ttc gga caa aaa gaa ggg gtg ttc cac 1344
Ser Thr Val Pro Gly Ser Gly Phe Gly Gln Lys Glu Gly Val Phe His
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ctg agg acg acc atc ctg cca gct gag gag gac atg cct gcc atc atg 1392
Leu Arg Thr Thr Ile Leu Pro Ala Glu Glu Asp Met Pro Ala Ile Met
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acc agc ttc aag aag ttc aac gac act ttc atg gat cag tac gat ggc 1440
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tac tcc agg atg tga 1455
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<220>
<223>PCR引物
<400>41
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机译： 提高植物GGT活性的方法，具有升高的GGT活性的植物及其构建方法
机译： 提高植物GGT活性的方法，具有升高的GGT活性的植物及其构建方法
机译： 如何提高植物GGT活性，其生产方法和GGT活性升高的植物
