催促平鲷亲鱼性腺发育成熟和诱导排卵方法

摘要

本发明提供一种催促平鲷亲鱼性腺发育成熟和诱导排卵方法，该方法包括：1.在自然海区浮筏式网箱遮荫常规培养亲鱼，对亲鱼营养强化培育；2.当雌鱼卵母细胞发育至直径大于400μm时，将亲鱼移入圆形循环过滤式繁殖水池过渡培养；3.两次混合激素催熟注射，进行人工催熟和诱导排卵，所用的激素为合成的促黄体生成激素释放激素类似物(LHRH－A

说明书

技术领域

本发明涉及一种促使平鲷性腺正常发育，在人工合成激素诱导和温光生态调节控制下使卵母细胞快速发育、成熟和自然排卵，为平鲷雌核发育育种提供优质卵子方法，

背景技术

平鲷是名贵海水经济鱼类，具有雌性生长优势的特点，为海水增养殖的优良物种，其全雌种苗养殖在生产上有重要意义和推广价值。在开展平鲷雌核发育和全雌单性育种技术研究中首先需要解决亲鱼培育及持续提供优质成熟卵子和精液的技术问题，为此，需要根据平鲷对水域环境的适应性和生殖生态特点，进行亲鱼培育和营养强化，性腺催熟、诱导排卵和抑制自然产卵，为平鲷雌核发育育种提供优质卵子。但目前尚无可以用于上述目的要求的实用技术方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种催促平鲷亲鱼性腺发育成熟和诱导排卵方法，以便为平鲷雌核发育和育种提供优质卵子。

本发明是一种能够在蓄养条件下促使平鲷性腺正常发育，在人工合成激素诱导和温光生态调节控制下使卵母细胞快速发育、成熟和自然排卵方法，可以防止脱离卵巢滤泡膜进入卵巢腔的成熟卵子产出体外，其技术方案包括以下培育步骤：

(1)在平鲷亲鱼繁殖季节前的两个月遴选2龄以上体质健康的亲鱼，在近岸港湾海区浮筏式网箱遮荫进行营养强化培养，喂以饵料，所投喂的饵料以新鲜或冷藏的小鱿鱼、乌贼及其他优质饵料杂鱼为佳，日投喂量为亲鱼总质量的5～7％；并补充维生素E、复合维生素和鱼肝油，日投喂量按每kg亲鱼体重计：维生素E为10～20mg，复合维生素为50～100mg，鱼肝油为0.2～0.5ml；以维持亲鱼机体代谢需要，保证亲鱼有足够的营养储备提供性腺发育所需的能量；

(2)在繁殖期间，选择卵母细胞发育至直径大于400μm的雌鱼和轻挤腹部有乳白色、流畅精液的成熟雄鱼，移入室内圆形循环过滤式繁殖水池进行适应性过渡培养，繁殖池日循环交换水量为容积的200％～1000％，通过多级过滤及时清理悬浮和沉底的固体污物，利用速生海藻降解水中的氨氮，净化水质；

(3)当亲鱼移进该繁殖水池经适应性过渡培养后，进行第一次激素促熟，所用的激素为合成的促黄体生成激素释放激素类似物(LHRH-A₂)和绒毛膜促性腺激素(HCG)，两种激素混合，胸鳍基部注射，激素剂量为：雌鱼每kg体重注射2.0～4.0μg的合成的促黄体生成激素释放激素类似物加300～600国际单位的绒毛膜促性腺激素，雄鱼每kg体重注射1.0～2.0μg的合成的促黄体生成激素释放激素类似物(LHRH-A₂)加150～300国际单位的绒毛膜促性腺激素(HCG)：

(4)经过第一次混合激素催熟24～36hr后，将雌、雄亲鱼分别转移到方形小水池分离培育，采用电热装置加热升温，保持水温21～22℃，充气和微流水，池面光强控制在50Lux以下，保持水体安静；并进行第二次激素催熟，雌鱼激素注射剂量为每kg重注射4.0～8.0μg的合成的促黄体生成激素释放激素类似物(LHRH-A₂)加800～1200国际单位的绒毛膜促性腺激素(HCG)，雄鱼不注射，经24～36hr混合激素催熟效应，成熟的卵子脱离卵巢滤泡膜顺利排入卵巢腔，但不产出体外。

平鲷亲鱼通常在每年12月进入繁殖期，因而在本发明步骤(1)中，对平鲷亲鱼进行营养强化培养一般可在10月份开始进行，即在平鲷亲鱼繁殖季节前的10月份遴选2龄以上体质健康的亲鱼进行营养强化培养。

而12月至翌年的2月份通常即到平鲷亲鱼的繁殖期间，因而本发明的步骤(2)可在12月至翌年的2月份的进行。

本发明优点是通过亲鱼的培养和营养强化，繁殖生态调控和外源激素相结合促使平鲷性腺发育和成熟，诱导排卵，同时防止流产或卵子产出体外，催熟有效率达95％，排卵率达90％以上，卵子质量好。其特点是方法简便、易操作控制，技术成本低，具高效和稳定，而且可以根据性腺发育状态准确判断亲鱼排卵时间，可应用于鲷科鱼类和一些中小型海水经济鱼类的繁殖育苗、细胞工程育种以及受精和发育生物学等科学实验和研究。

本发明的具体应用效果如下：

1、亲鱼培育

培育亲鱼所需的种苗来自广东省大亚湾野生种群，在海水网箱中常规培养。繁殖季节前从网箱培育的群体中挑选出体魄健壮、无损伤的亲鱼进行营养强化，投喂小鱿鱼、乌贼或其他优质饵料鱼，每日投喂一次，日投喂量为亲鱼总质量的5～7％，补充适量维生素E、复合维生素和鱼肝油等营养剂。亲鱼强化培育和生殖期间，养殖海区的水温一般年份变幅为28.5～15.5℃。网箱培育平鲷亲鱼群体的生长和性腺发育的基本特征见表1。

                                  表1  平鲷生长及性腺发育

 取样时间  年龄 样品数  体重  (g)  体长  (cm)         性腺发育  ♀GSI  (％)性别状态  卵巢  精巢 2002.1 2002.10 2002.11 2002.12 2003.01 2003.03 2003.10 2003.11 2003.12 2004.01 2004.02 2003.12 2004.02    1~    2~    2    2    2    2    3~    3    3    3    3    4    4  10  10  20  14  10  8  4  6  10  8  6  20  8110～125450～550475～650480～720480～750475～730730～1020760～1040775～1050760～1030  935～1350     21.5～24.5     25.0～30.5   27.5～33.0 雌雄难分 II II～III期 III III～IV IV II～III III～IV IV IV IV～VI IV IV～VI  雌雄难分  微量精液  少量精液  大量精液  大量精液  少量精液  少量精液  大量精液  大量精液  大量精液  精量一般  大量精液  少量精液 2.0～2.6 3.8～4.2 5.4～6.5 3.0～3.5 5.2～8.5 6.0～7.5性别难分性别可辨性别明确性别易辨

结果显示，在生殖季节前1个多月采用上述方法进行营养强化能有效地促进平鲷的性腺发育，2龄雌鱼从卵母细胞尚未发育的II期卵巢发育到卵母细胞卵黄等营养物质大量沉积、即将成熟的IV期卵巢，成熟系数(GSI)从2.0％上升到6.5％；3龄雌鱼性腺从II～III期卵巢快速发育到IV期，成熟系数(GSI)从3.0％上升到8.5％，充满卵黄物质的卵母细胞密集、圆润饱满，彼此容易分离，性腺内部结构形态变化和卵母细胞的表形特征说明亲鱼性腺发育良好。

2、人工催熟和诱导排卵

实验证明人工培养的平鲷亲鱼需要经过激素催熟、适宜的环境调控才能促使性腺成熟，自然排卵。从海区网箱培育的平鲷群体中选出卵母细胞直径大于400μm的亲鱼，移入室内圆形循环过滤式繁殖水池进行适应性过渡培养。由于生活环境突然变化，转运过程亲鱼遭受惊扰、挫伤等引起不良应激反应，经过室内2天过渡性培养能有效减缓应激反应，使亲鱼恢复正常生理状态。选用“三生”牌促黄体生成激素释放激素类似物(LHRH-A₂)和绒毛膜促性腺激素(HCG)进行混合激素催熟。雌鱼第一次催熟剂量为(2.5μg LHRH-A₂+500IU HCG)/kgBW，雄鱼减半。在水温为18～20℃的循环水培养下，经24～36hr催熟，性腺明显发育，卵母细胞形态圆润饱满，直径通常达到525～725μm。然后将雌、雄亲鱼分别转移到方形小水池，进行第二次激素催熟，雌鱼剂量为(5.0μg LHRH-A₂+1000IU HCG)/kgBW，雄鱼不注射，水温升高到21～22℃，充气和微流水，光强控制在50Lux以下，保持水体安静，促使卵母细胞继续发育和最终成熟和排卵。平鲷性腺催熟和人工诱导排卵结果见表2。

                                                    表2平鲷性腺催熟及诱导排卵

时间月份 水温 (℃)      亲鱼  数量第一次注射第二次注射效应     排卵率     备注时间     (％)性别年龄  卵母细胞  激素 卵母细胞  激素200234122003123  12  1212200422  17～2  19～22    19～21    16～21  17～21  18～22    19～22    ～  18～21  18～21    13～21  15～22 ♀  ♀    ♀    ♀  ♀  ♀    ♀  ♀  ♀  ♀    ♀  ♀  2  2    3    3  3  3    3  4  2  3    4  2    8    6      14      8    7    5      10    7    5    4      6    6  425～475  450～575    450～500    475～525  450～575      400～500  475～525  325～350  450～500    475～700  475～500  混合  混合    混合    混合  混合  混合    LHRH～A₂  混合  混合  NaCL    混合  混合 475～575 550～700   550～625   575～650 550～700 600～700   475～575 550～625 350～375 450～550   525～725    混合  混合    混合    混合  混合  混合    混合  混合  混合  NaCL    混合  混合30～36   87.524～26   50   生殖末期              部分性腺开始退化24～28   9324～27   10024～28   10027       40   生殖末期              多数卵巢退化26～30   10024～26   100         0    卵母细胞＜400μm         0    空白对照组  24～28   50   持续寒潮肌体冻伤30       100

注：混合表示LHRH-A₂和HCG混合激素，NaCL表示浓度为1.2％的NaCL生理盐水。

经过强化培养的平鲷雄鱼通常发育良好，注射适量的混合激素目的是维持精液持续释放，为开展平鲷雌核发育研究提供足量优质的精液。实验结果显示，注射NaCl生理盐水的对照组卵母细胞没有明显发育，不能排卵。根据对平鲷性腺发育规律和成熟过程的分析研究，刚参加生殖活动的2龄雌鱼的生殖期略迟，盛期为1～3月，末期为4月，而3龄以上的雌鱼生殖期较早，盛期为12～2月，末期为3月。在生殖末期，部分平鲷亲鱼的性腺已经开始退化，影响激素催熟效果，以致诱导排卵率较低。经过营养强化、繁殖环境调控和激素催熟，平鲷的卵母细胞持续发育，性腺催熟有效率达95％，在生殖期间，除了2龄鱼其中的一个实验组排卵率为87.5％外，其他各实验组的排卵率达到93～100％，说明该发明方法简便、效果显著。

具体实施方式

1、进行平鲷亲鱼培养，亲鱼在自然海区浮筏式方形网箱中遮荫培养，在生殖季节前的10月份遴选体魄健壮、体色鲜艳、游动活泼无损伤的2龄以上的健康亲鱼进行营养强化、自然光照下培养，投喂新鲜或冷藏的小鱿鱼、乌贼及其他优质饵料鱼，日投喂量为亲鱼总质量的5～7％，补充适量维生素E、复合维生素和鱼肝油，日投喂量按每kg亲鱼体重计：维生素E为10～20mg，复合维生素为50～100mg，鱼肝油为0.2～0.5ml；维持机体代谢需要，保证亲鱼有足够的营养储备提供性腺发育和生殖过程所需的能量。保持网箱水流畅通、环境安静，避免清网或对亲鱼的侵扰。

2、在冬季繁殖季节，即12月至翌年的2月份，当卵母细胞发育至直径大于400μm时，将亲鱼移入室内圆形循环过滤式繁殖水池进行适应性过渡培养。该繁殖池圆形、直径4m，深度2m，有效水体容积22m³，池底中央铺设排水管，该排水管既有排除底部污水，又有限制水位和溢流作用，使水体始终保持垂直混合的均匀状态。池内设置可以升降移动的无结节圆形网箱，即可以防止亲鱼追逐时撞壁挫伤，又可以方便起捕和进行活体检查，降低工作量，同时也可以减少因起捕亲鱼需要大量排、进水导致培育环境的突然变化和能源浪费，缓解因起捕亲鱼产生的肌体应激反应，环境的稳定有利于亲鱼性腺发育和成熟。繁殖池附设集卵池、砂滤池、生物净化池和可调节流量的抽水机和供气配套设备(见图1～室内循环式催熟与繁殖池示意图)。繁殖池能够根据生殖亲鱼密度和生理状态变化的需要调节循环水量，日循环交换水量为200％～1000％，通过多级过滤及时清理悬浮和沉底的固体污物，利用石莼等大型速生海藻降解水中的氨氮，达到生物净化水质，每日仅补充少量新鲜海水，节约大量能源，降低成本。

3、当亲鱼移进该繁殖水池进行2天适应性过渡培养后，进行第一次激素促熟，采用合成的促黄体生成激素释放激素类似物(LHRH-A₂)和绒毛膜促性腺激素(HCG)混合激素，激素用1.2％NaCl海水硬骨鱼类生理盐水溶解，注射剂量为总剂量的1/3，既雌鱼注射(2.5μgLHRH-A₂+500IU HCG)/kgBW，雄鱼(1.25μg LHRH-A₂+250IU HCG)/kgBW。在水温为18～20℃的循环水培养下，经24～36hr催熟，雌鱼腹部膨胀，卵母细胞明显发育，形态饱满，直径通常达到525～725μm。

4、将经过第一次混合激素催熟24～36hr后的雌、雄亲鱼分别转移到方形小水池(容积1.8m³)，雌、雄亲鱼分离和小水体培育有利于抑制亲鱼发情追逐，防止自然产卵受精或流产。进行第二次激素催熟，注射剂量为总剂量的2/3，既雌鱼注射(5.0μg LHRH-A₂+1000IU HCG)/kgBW，雄鱼不注射。采用电热装置迅速加热升温，水温调节在21～22℃之间，充气和微流水，池面光强控制在50Lux以下，保持水体安静，防止外因刺激引起亲鱼激烈游动导致流产。经过第二次激素催熟和温光环境调控下，雌鱼腹部显著膨大，卵母细胞持续发育和成熟，最终脱离卵巢滤泡膜进入卵巢腔，顺利排卵，效应期为24～36hr。成熟卵子停留在卵巢腔内，不会产出体外，为进行平鲷雌核发育诱导、全雌单性遗传育种以及卵子受精与发育生物学等研究提供大量成熟优质的卵子。