通过使用牛痘ATI启动子表达改良的安卡拉痘苗病毒中的基因

摘要

本发明涉及重组的改良安卡拉痘苗病毒，其病毒基因组包含一种表达盒，所述表达盒包含牛痘AT I启动子或其衍生物以及编码序列，其中所述编码序列的表达由所述启动子的调节。所述病毒可用作疫苗或药物组合物的一部分。

说明书

本发明涉及重组的改良安卡拉痘苗病毒，其病毒基因组包含含有牛痘AT I启动子或其衍生物以及编码序列的表达盒，其中所述编码序列的表达由所述启动子调节。该病毒可用作疫苗或药物组合物的一部分。

背景技术

重组痘病毒广泛用来在感染的细胞中表达异源性抗原。此外，重组痘病毒目前作为非常有希望疫苗被研究，其诱导针对从痘病毒载体中表达的异源性抗原的免疫反应。最常用的一种是禽痘病毒，另一种是痘苗病毒。美国专利5,736,368和美国专利6,051,410公开了重组痘苗病毒毒株Wyeth，其表达HIV抗原和蛋白。美国专利5,747,324公开了重组痘苗病毒毒株NYCBH，其表达慢病毒基因。欧洲专利0 243 029公开了重组痘苗病毒毒株Western Reserve，其表达人逆转录病毒基因。

本领域熟练技术人员已知多种在痘病毒中表达异源基因的启动子，例如30K和40K启动子(见例如美国专利5,747,324)，合成的强早期/晚期启动子(见例如Sutter等，Vaccine(1994)12，1032-40)，P7.5启动子(见例如Endo等，J.Gen.Virol.(1991)72，699-703)和来自牛痘病毒A型包涵体(AT I)基因的启动子(Li等，J.Gen.Virol.(1998)79，613)。所有这些启动子已用于重组痘苗病毒中来表达异源基因，并显示非常有效地表达所述基因，产生相对较高量的该异源性基因所编码的蛋白。

多种接种方法都非常需要针对其诱导免疫反应的抗原以较高的量表达。然而，情况不都如此。已知不同类型的细胞毒性T细胞(CTL)是依据抗原的浓度由免疫系统诱导的。低亲合力的CTL由高浓度的抗原诱导，而高亲合力的CTL由低浓度的抗原诱导。已显示高亲合力的CTL在清除动物试验系统中的激发病毒中比低亲合力的CTL有效得多。此外，还显示高浓度的抗原可抑制甚或杀死高亲合力的CTL。总而言之，显示有时需要使用相当少量的抗原诱导较大量的高亲合力CTL，并且由此诱导有效的免疫反应(Berzofsky等，Immunological Reviews(1999)170，151-172)。

发明目的

本发明的目的是提供以痘苗病毒为基础的系统，使得在给予包括人的动物以后，包含在痘苗病毒基因组中的异源基因的表达量相对较低，这是诱导相对较高的量的高亲合力CTL的前提。

发明详述

本发明的目的通过提供了重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)而实现，所述病毒包含含有牛痘AT I启动子或其衍生物和编码序列的表达盒，其中所述编码序列的表达由所述启动子调节。由于已知AT I启动子在其它痘病毒系统中非常活跃，不能预期该启动子在MVA中具有相对低的活性(例如Li等，J.Gen.Virol.(1998)79，613)。相反，实施例部分显示与基于其它痘苗病毒毒株例如Western Reserve，Elstree或Copenhagen的系统中的AT I启动子的活性相比，在基于MVA的系统中的AT I启动子的活性低2-4倍。因此，MVA中的AT I启动子适宜表达编码针对其诱导高亲合力CTL的蛋白的基因。

改良的安卡拉痘苗(MVA)病毒与痘苗病毒相关，它是痘病毒家族的正痘病毒属成员。MVA是通过痘苗病毒安卡拉毒株(CVA)在鸡胚成纤维细胞上连续传516代获得的(参见Mayr，A.，等Infection 3，6-14[1975])。这些长期传代导致MVA病毒的基因组序列缺失约31千个碱基，因此，被描述成对鸟类细胞高度限制性的宿主细胞(Meyer，H.等，J.Gen.Virol.72，1031-1038[1991])。已显示，在各种动物模型中，产生的MVA都是明显地无致病力的(Mayr，A.& Danner，K.[1978]Dev.Biol.Stand.41：225-34)。此外，该MVA毒株已经在临床试验中作为对人天花疾病产生免疫的疫苗被检测(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.1，Abt.Org.B 167，375-390[1987]，Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392[1974])。

根据本发明可用任何MVA毒株。本发明所使用并根据布达佩斯条约进行保藏的MVA病毒毒株的实例是保藏在欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，Salisbury(UK)，保藏号分别为ECACC V94012707和ECACCVOO120707的毒株MVA572和575，以及保藏号为ECACC V00083008的MVA-BN。

最优选的MVA毒株是MVA-BN或其衍生物。MVA-BN的特征，即使得能够评价MVA毒株是否是MVA-BN或其衍生物的生物试验的描述，以及获得MVA-BN或其衍生物的方法在WO 02/42480中描述。该申请的内容包含在本申请中作为参考。

为了繁殖MVA，真核细胞被该病毒感染。所述真核细胞是易感染各痘病毒的细胞，并允许感染病毒的复制和产生。对MVA而言，这种类型的细胞是鸡胚成纤维细胞(CEF)和BHK细胞(Drexler I.，Heller K.，Wahren B.，Erfle V.and Sutter G.″Highly attenuated modified vaccinia Ankara replicates inbaby hamster kidney cells，a potential host for virus propagAT I on，but not invarious human transformed and primary cells″J.Gen.Virol.(1998)，79，347-352)。CEF细胞可以在本领域熟练技术人员已知的条件下培养。优选，所述CEF细胞在固定烧瓶或滚瓶中在无血清培养基中培养。优选在37℃±2℃温育48-96小时。为进行感染，优选使用感染复数(MOI)为0.05-1TCID₅₀的MVA，且所述优选在37℃±2℃温育48-72小时。

牛痘病毒A型包涵体蛋白基因的启动子序列(AT I启动子)是本领域熟练技术人员已知的。在本文中，参考Genebank入藏号D00319。优选AT I启动子显示为SEQ ID NO：1，如下：

5′GTTTT GAATA AAATT TTTTT ATAAT AAAT3′

根据本发明，可使用SEQ ID NO：1中所述的AT I启动子，或者使用AT I启动子的衍生物，其可以是SEQ ID NO：1的序列的亚序列。术语“SEQID NO：1的序列的亚序列”指SEQ ID NO：1的序列的较短的片段，其仍然具有启动子活性，具体是痘苗病毒晚期启动子。SEQ ID NO：1的序列的典型的片段的长度为SEQ ID NO：1的序列的至少10个核苷酸，更优选至少15个核苷酸，更优选至少20个核苷酸，最优选至少25个核苷酸。该亚序列优选包含SEQ ID NO：1的核苷酸25到29，即位于SEQ ID NO：1的3’末端的序列5’-TAAAT-3’。所述亚序列可以包含SEQ ID NO：1的核苷酸22到29，即位于SEQ ID NO：1的3’末端的序列5’-TAATAAAT-3’。

启动子可以被插入编码序列的上游，使得SEQ ID NO：1的核苷酸28到29(上文加下划线的序列)成为翻译的5’ATG3’起始密码子的一部分。可选地，启动子可以被多个核苷酸从翻译的起始密码子分离。SEQ ID NO：1的启动子的3’末端和5’ATG3’起始密码子中的A之间的间隔优选少于100个核苷酸，更优选少于50个核苷酸，更优选少于25个核苷酸。然而，只要启动子能导向位于启动子下游的编码序列的表达，该间隔可以更长。

AT I启动子的衍生物也可以是与SEQ ID NO：1相比，具有一个或多个的核苷酸取代，缺失和/或插入的序列，其中所述衍生物仍有启动子活性，具体为痘苗病毒晚期启动子。具有一个或多个核苷酸取代的序列是其中SEQ ID NO：1的序列的一个或多个核苷酸被不同的核苷酸取代的序列。具有一个或多个核苷酸插入的序列是其中一个或多个核苷酸被插入SEQ IDNO：1的序列的一个或多个位点的序列。具有一个或多个核苷酸缺失的序列是其中SEQ ID NO：1的序列的一个或多个核苷酸在一个或多个位置上被缺失的序列。在SEQ ID NO：1的衍生物中，缺失、取代和插入可以在一条序列中组合。

优选所述衍生物与SEQ ID NO：1的序列相比，具有至少40％的同源性，更优选至少60％的同源性，更优选80％的同源性，最优选至少90％的同源性。根据最优选的实施方案，不超过6个核苷酸，更优选不超过3个核苷酸被取代、缺失和/或插入SEQ ID NO：1的序列。

具体地，优选保留SEQ ID NO：1的核苷酸25-29，即启动子中的序列5’-TAAAT-3’，以便保持最大的启动子活性。还可优选保留SEQ ID NO：1的核苷酸22-29，即启动子中的序列5’-TAATAAAT-3’。

许多现有技术的参考文献使得本领域熟练技术人员能预测SEQ IDNO：1的哪些衍生物仍具有活性痘苗病毒启动子的生物活性，所述启动子具体为痘苗病毒晚期启动子。本发明可参考Chakrarbarti等，Biotechniques(1997)23，1094-1097 andDayison and Moss，J.Mol.Biol.(1989)210，771-784。此外，本领域熟练技术人员可轻易检测某一片段是否具有痘苗病毒启动子活性，具体为晚期启动子。具体地，该序列衍生物可被克隆到质粒构建体的报道基因的上游。所述构建体可以被转染进入真核细胞或细胞系，例如被MVA感染的CEF或BHK细胞。所述报道基因的表达随后被测定并和SEQID NO：1的启动子控制的报道基因的表达进行比较。该实验背景与本发明显示的实施例对应。与SEQ ID NO：1的启动子序列的活性相比，本发明的衍生物在所述检验系统中具有至少10％，优选至少30％，更优选至少50％，更优选至少70％，最优选至少90％的启动子活性。比SEQ ID NO：1具有更高的启动子活性的SEQ ID NO：1的这些衍生物也在本发明的范围之内。

本发明更广泛的意义上涉及使用如上述的牛痘AT I启动子或其衍生物来表达MVA中编码序列的表达。

AT I启动子可用来表达已经是MVA基因组的一部分的基因。这种基因可以是病毒基因组的天然的一部分或已经被插入MVA基因组中的异源基因。在这些情形下，AT I启动子被插入MVA基因组基因的上游，所述基因的表达由AT I启动子控制。

AT I启动子可用来调节尚未成为MVA基因组的一部分的基因的表达。这种情形下，优选构建包含AT I启动子和编码序列的表达盒，其表达由ATI启动子调节，，并将所述表达盒插入MVA基因组中。优选的插入位点选自(i)与痘苗病毒毒株Copenhagen的基因组相比，天然存在的缺失位点，或者(ii)MVA基因组的基因间区。术语“基因间区”优选指位于两个相邻的基因之间的病毒基因组的那些部分，其既不包含编码序列，也不包含调节序列。然而，该插入位点不限于这些优选的插入位点，这是由于只要可能获得可在至少一种细胞培养系统，例如鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)中扩增并繁殖的重组体，表达盒就可以被插入任何位置是本发明范围之内的。因此，所述插入盒可以被插入例如非必要基因或者其功能可以被用于MVA繁殖的细胞系统补充的基因。

本领域熟练技术人员已知构建重组MVA必需的方法。例如，表达盒和/或AT I启动子或其衍生物可以通过同源重组被插入MVA的基因组中。为此，核酸被转染到容许细胞系例如CEF或BHK细胞中，其中所述核酸包含表达盒和/或侧接核苷酸序列的AT I启动子或其衍生物，其中所述核苷酸序列与MVA基因组中所述表达盒和/或AT I启动子或其衍生物待插入的区同源。这些细胞被MVA感染，并且在感染的细胞中同源重组出现在核酸和病毒基因组之间。可选地可以先用MVA感染细胞，然后将核酸转染到感染的细胞中。细胞中再次发生同源重组。重组MVA随后通过本领域技术人员已知的方法选择。重组MVA的构建不限于具体的方法。然而为实现此目的，可使用本领域熟练技术人员已知的任何方法。

MVA中的AT I启动子被用来控制任何编码序列的表达。该编码序列优选编码至少一种抗原表位或抗原。在这种情况下，重组MVA感染有机体例如包括人的哺乳动物的细胞后表达所述抗原。所述抗原/表位的存在可激发有机体内的免疫反应，导致该有机体对抗原/表位来源的因子产生免疫。更具体地，所述表位/抗原可以是较大的氨基酸序列例如多肽，肽或蛋白的一部分。这种多表位，肽或蛋白的实例可以来自以下物质：(i)病毒，例如HIV，HTLV，疱疹病毒，登革病毒，脊髓灰质炎病毒，麻疹病毒，腮腺炎病毒，风疹病毒，肝炎病毒等等，(ii)细菌，(iii)真菌。

可选地，编码序列可编码治疗性化合物例如白介素，干扰素，核酶或酶。

重组MVA可根据本领域熟练技术人员的知识给药动物或人体。因此，本发明的重组MVA可用作药物(即药物组合物)或疫苗。

药物组合物或疫苗除了包含重组MVA以外，通常还包括一种或多种可药用和/或允许药用的载体，添加剂，抗生素，防腐剂，佐剂，稀释剂和/或稳定剂。这种辅助物质可以是水，盐水，甘油，乙醇，湿化或乳化剂，pH缓冲物质等等诸如此类。适宜的载体是典型的大的，代谢较慢的分子，例如蛋白质，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚合氨基酸，氨基酸共聚物，脂类聚集体等等诸如此类。

为制备药物组合物或疫苗，将本发明的病毒转化成生理可接受的形式。这一过程可根据制备用作天花疫苗的痘病毒疫苗的经验进行(如Stickl，H.等[1974]Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392所述)。例如，纯化的病毒以配置在约10mM Tris，140mM NaCl Ph7.4中，滴度为5×10⁸TCID50/ml保藏在-80℃。为制备疫苗丸，例如10¹-10⁹的重组病毒颗粒在含有2％的蛋白胨和1％的人白蛋白的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，在安瓿瓶(优选玻璃安瓿瓶)中冻干。可选地，所述疫苗丸可通过逐级冷冻-干燥配制剂中的病毒制备。该配制剂可以含有适宜活体内给药的其它添加物，例如甘露醇，葡聚糖，甘油，乳糖或聚乙烯吡咯烷酮，或者含有其它添加物例如抗氧化剂或者惰性气体，稳定剂或者重组蛋白(例如人血清白蛋白)。适宜冷冻-干燥的典型的含病毒配制剂包含10mM Tris-缓冲液，140mM NaCI，18.9g/l葡萄糖MW36000-40000)，45g/l蔗糖，0.108g/l L-谷氨酸单钾盐一水化物，pH7.4。玻璃安瓿瓶随后被密封，并可以在4℃和室温之间保存几个月。然而，一般来说，安瓿瓶优选储存在-20℃以下。

为接种或治疗，该冻干物或冻干的产物可溶解于0.1-0.5ml的水溶液中，优选水，生理盐水，或Tris缓冲液，并通过系统或局部给药，即肠道外，肌肉内或任何其它本领域熟练技术人员已知的给药途径。本领域熟练技术人员可以已知的方式优化给药的方式，剂量和给药次数。

因此，根据相关实施方案，本发明涉及感染，优选在包括人的活动物体内诱导免疫反应的方法，包括将本发明的病毒，组合物或疫苗给药待治疗的动物或人。通常，病毒丸包含至少10²，优选至少10⁴，更优选至少10⁶，更优选10⁸TCID₅₀(组织培养物感染剂量)的病毒。

本发明的重组MVA病毒，具体为重组MVA-BN病毒及其衍生物的具体优势在于该病毒可用于激发-强化给药。因此，本发明还涉及将该病毒，组合物或疫苗以治疗有效量，在第一次接种(“激发”)和第二次接种(“强化“)中给药需要这种治疗的包括人的动物。

本发明还涉及将编码序列导入靶细胞的方法，包括使用本发明的病毒感染靶细胞。所述靶细胞是病毒能在其中复制的细胞，例如CEF或BHK细胞，或者可以被MVA感染，但病毒不能在其中复制的细胞，例如所有类型的人细胞。

本发明还涉及制备肽，蛋白和/或病毒的方法，包括使用本发明的重组病毒感染宿主细胞，随后在适宜的条件下培养感染的宿主细胞，然后分离和/或富集所述宿主细胞产生的肽和/或蛋白和/或病毒。如果意图制备，即扩增本发明的病毒，所述细胞必须是病毒可在其中复制的细胞，例如CEF或BHK细胞。如果意图制备该病毒编码的肽和/或蛋白，优选编码序列所编码的蛋白/肽，其表达由AT I启动子或其衍生物控制，该细胞可以是任何可被该重组病毒感染并允许MVA编码的蛋白/肽表达的细胞。

本发明还涉及使用本发明的病毒感染细胞。

附图简述

图1：PCR的结果，来检测重组MVA感染CEF细胞后，从其中的ATI启动子表达的RNA的存在(见实施例2)

图2：从多种重组MVA感染的细胞中分离的蛋白的Western印迹结果。图2A：非还原条件，未加热的蛋白；图2B：还原性条件，未加热的蛋白；C：非还原性条件，加热的蛋白。泳道1，3，4分别是MVA-AT I-NS1，MVA-GFP感染的细胞以及未被感染的细胞的细胞裂解物。泳道5，7，8分别是MVA-AT I-NS1，MVA-GFP感染的细胞的上清液和对照细胞的上清液。泳道2和6是空的。

实施例

以下实施例将进一步说明本发明。本领域熟练技术人员可理解提供的实施例不应被解释成将本发明的技术限制为用在该实施例。

实施例1：不同的痘苗病毒株中的牛痘AT I启动子的活性

本实施例的目的是分析牛痘AT I启动子在不同的痘苗病毒毒株中的强度。

简介：

牛痘病毒AT I启动子融合于GUS(大肠杆菌β-葡糖醛酸酶)报道基因来进行表达分析。使用不同的痘苗病毒毒株感染BHK(幼仓鼠肾)细胞，并用含有和GUS基因融合的AT I启动子的质粒转染该细胞。被分析的痘苗病毒毒株包含CVA，Copenhagen，Elstree，IHD，Western reserve和MVA-BN。如果启动子有功能，GUS可以被表达而且可通过酶反应定量。

原料和仪器

-BHK细胞(ECACC No.84100501)

-所有痘苗病毒均使用7.5×10⁷TCID50每ml的滴度

-质粒pBNX73(pBluescript+AT I启动子+GUS)

-Effectene转染试剂盒(Qiagen)

-DMEM细胞培养基(Gibco BRL)

-FCS(Gibco BRL)

-裂解缓冲液(PBS+0.1％Triton+1mM蛋白酶抑制剂)

-GUS底物1mM(对硝基苯-β-(D)-葡糖醛酸；Sigma，Cat.No.N1627)

-终止液2.5M(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇；Sigm a，Cat.No.A 9754)

方法：

细胞接种

每次转染反应有5×10⁵细胞被接种在6孔板的孔中，并在37℃，5％CO2的条件下，保存在DMEM/10％FCS中过夜。

感染/转染

使用0.5ml DMED/10％FCS每孔中，使用不同的痘苗病毒毒株(MOI0.1)感染细胞，并在摇床上室温温育一小时。按产品说明进行转染。在缓冲EB(总体积100μl)中稀释2μg质粒。加入3.2μl增强溶液后，混合溶液并在室温温育5分钟。随后加入10μl Effectene试剂，混合悬液并在室温温育10分钟。从细胞中取出病毒悬液，并加入1.6ml DMEM/10％FCS。将0.6mlDMEM/10％FCS加入DNA Effectene混合物，并在旋转培养板的同时滴加在细胞上。随后温育细胞48小时。

收获细胞

从细胞中去除培养基，并加入0.5ml裂解缓冲液。在室温振摇15分钟后，将细胞刮入裂解缓冲液，转移到1.5ml的试管中，并强力涡旋。将裂解的细胞在4℃以500rcf离心一分钟，将上清转移到新鲜的小瓶中，并储存在-20℃备用。

GUS活性测定

将10μl细胞提取物(＝2×10⁴细胞中的蛋白)加入1ml预热的底物溶液(37℃)中，并在37℃保温直到出现黄色。立即将样品置于冰上，并加入0.4ml终止溶液。测定415nm处的消光值，由于0.05-2.0之间的消光值在线性范围内，认为415nm处的消光值即GUS活性。将底物溶液作为参考并以未感染的细胞的细胞提取物作为阴性对照。

结果

对不同的痘病毒毒株感染的BHK细胞中的AT I启动子-GUS基因构建体表达的GUS活性进行定量，得到如下结果：

用来感染pBNX73转染的BHK细胞的痘苗病毒毒株 GUS活性(未被感染的细胞) 0CVA 1.30Copenhagen 1.86Elstree 2.07IHD 1.30Western Reserve 0.96MVA-BN 0.48

实施例2：插入MVA基因组并由牛痘AT I启动子调节的异源基因的表达

本实施例的目的是证明AT I启动子能够调节并表达插入MVA的基因组的基因

简介；

牛痘病毒AT I启动子与登革病毒的非结构(NS)1基因融合。该表达盒被插入包含与MVA基因组同源的序列的重组载体中。产生的重组质粒中，表达盒侧接与该表达盒待插入的MVA基因组中的序列同源的序列。CEF细胞被MVA-BN感染，并被包含AT I启动子NS1表达盒的重组载体转染。细胞中MVA基因组和产生的重组质粒之间发生同源重组，产生重组MVA基因组。多轮纯化后，分析重组MVA中的NS1蛋白是否从AT I启动子表达。在平行试验中，在AT I控制之下的、包含编码HIV多面体(polytope)的编码序列的表达盒被插入MVA基因组，并再次测定AT I启动子在MVA中是否有活性以及是否表达HIV多面体。

原料和仪器

-原代CEF细胞

-幼仓鼠肾细胞(BHK；保藏在欧州动物细胞培养物保藏中心，保藏号85011433)

-MVA-BN，滴度10⁸TCID₅₀/ml

-质粒pBN74和pBN84：pBN74包含编码AT I启动子控制的HIV多面体的序列，且pBN84包含AT I启动子控制的登革病毒NS1蛋白的编码序列。除了分别包含登革病毒编码序列的表达盒和HIV多面体表达序列，两种质粒还包含作为标志基因的G418抗性基因和编码绿色荧光蛋白的基因。所述标志基因以及登革病毒NS1表达盒和HIV多面体的表达盒分别侧接MVA序列，所述MVA序列与MVA基因组中异源基因待插入的区同源。

-Effectene转染试剂盒(Qiagen)

-VP-SFM细胞培养基(Gibco BRL、)

-RNeasy RNA分离试剂盒(Qiagen)

-DNAse，无RNA酶(Roche)

-MMLV逆转录酶(Promega)

-Taq DNA聚合酶(Roche)

-RNAse抑制物RNAsin(Promega)

-以下寡核苷酸购自MWG，德国：引物oBN465 ggtctgatttccatcccgtac(21个核苷酸)，用于逆转录酶反应；引物oBN463 gaactgaagtgtggcagt(18个核苷酸)，用于PCR；引物oBN464 cggtggtaatgtgcaagatc(20个核苷酸)，用于PCR

方法：

通过同源重组整合到MVA基因组中

上述质粒pBN74或pBN84分别用来将HIV多面体编码序列和登革病毒NS1表达盒通过同源重组整合到MVA基因组中的MVA序列之间，所述序列一侧与pBN74或pBN84中的表达盒侧接，另一侧与MVA基因组内的同源靶序列侧接。该过程可通过将线性化的质粒pBN74或pBN84转染到被MVA以低感染复数预先感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中实现。更具体地，CEF细胞被接种在6孔板中，并在37℃，5％CO₂的条件下，在VP-SFM中保存过夜。用每孔0.5ml VP-SFM中的MVA-BN(MOI 1.0)感染细胞，并在摇床上在室温保温一小时。使用pBN74或pBN84转染细胞按照产品说明进行。感染后48小时或当感染细胞铺满后，制备病毒提取物并储存在-20℃，用来选择和克隆纯化需要的重组MVA(rMVA)。

重组MVA(rMVA)的选择和克隆纯化

非重组MVA(空载体病毒)的消除和rMVA的扩增是在存在G418的条件下(G418的量需要被最优化来确定不会杀死CEF细胞的最大剂量)，通过铺满的鸡胚成纤维细胞(CEF)以低MOI感染实现的。不含有整合的NPT II基因的任何病毒将不能在存在加入细胞培养基的G418的条件下复制。G418抑制DNA复制，但由于CEF细胞将处于静止的非复制状态，它们将不受G418的作用影响。由于增强的荧光绿色蛋白的表达，rMVA感染的CEF细胞可以在荧光显微镜下显示。

同源重组步骤中的病毒提取物可被连续稀释，并用来在存在G418时感染新鲜的CEF细胞。感染的细胞覆盖在低熔点的琼脂糖上。感染后两天，在荧光显微镜下观察所述板，可见绿色的感染细胞的单个感染灶。这些细胞被标记，并取出含有细胞感染灶的琼脂糖小块，将其置于含有无菌细胞培养基的1.5ml的微离心管中。从该琼脂糖中释放病毒是通过-20℃冷冻-解冻该试管三次进行的。

本发明具有插入的登革病毒NS1表达盒的重组MVA称为MVA-AT I-NS1。

检测重组MVA中从AT I启动子表达的RNA

为检测重组MVA感染的细胞中从AT I启动子表达的RNA，如出厂说明所述进行RNA提取(Rneasy Mini Protocol for the IsolAT I on of Total RNAfrom Animal Cells)。DNAse消化反应是通过将3μl无RNA酶的DNAse(＝30U；Roche)，3μl 10×缓冲液A(通常用来限制，Roche)加入含5μgRNA的30μl水溶液中。该混合物在37℃温育90分钟。根据出厂说明使用Rneasy柱纯化RNA。为进行逆转录，将2μg RNA和1μg引物oBN465混合进行逆转录，并通过加入水将总体积调节到10μl。在70℃温育5分钟，并将试管转移到冰上。随后加入5μl 5×缓冲液，5μl dNTP Mix(10μM)，0.5μlRnasin，2μl M-MLV RT(200U)和2.5 H₂O，并在42℃温育该混合物60分钟。

为进行PCR扩增，5μl的RT反应和36μl H₂O，5μl 10×缓冲液，1μl dNTPs，2μl各种引物oBN463和oBN464(10μM)和1μl Taq聚合酶混合。DNA在25个循环中扩增(1分钟延长，退火温度55℃)，并通过凝胶电泳进行分析。

MVA-AT I-NS1感染的细胞中登革病毒NS1蛋白的检测

100μl MVA-AT I-NS1病毒株在含3％FCS的MEMα中稀释到1×10⁷，使用上述毒株接种含有80％铺满的单层BHK细胞的25cm²的烧瓶，并在室温摇动30分针。将含有3％FCS的5ml MEMα加入各瓶，并在CO₂孵箱中在30℃温育。48小时后，收获该烧瓶。从烧瓶中除去上清，并在260g，4℃旋转10分钟。在-80℃以等分试样的形式储存上清液。使用5ml 1×PBS洗涤细胞碎片两次，并重悬于1ml含有1％T×100的低张douncing缓冲液中。收获细胞裂解物，并在16,000g旋转5分钟，上清储存在-80℃储存在微离心管中。

使用对照病毒接种的烧瓶和未被感染的烧瓶也如上述处理。

细胞/病毒裂解物和上清在非还原或还原样品缓冲液中，在非加热或加热条件下处理。在10％的SDS PAGE上分离蛋白，并将所述蛋白转移到硝化纤维膜上。使用从康复期患者即感染了登革热的患者收集的血清(PPCS)以1∶500的稀释度探测所得印迹过夜。使用1×PBS洗涤三次后，所述印迹和抗人IgG辣根过氧化物酶(HRP)(DAKO)在室温共同温育2小时。如上述洗涤该印迹后，使用4-氯-1-萘酚显色。结果示于图2中。

结果

当被牛痘病毒AT I启动子调节时，NS1基因以及HIV多面体显示被表达(图1)。相应的mRNA明显可检测。更具体地，对RNA样品进行RT-PCR后，926个碱基对的预期信号明显可检测(图1，泳道2)。使用只用于PCR的样品，不能检测到信号(图1，泳道3)。因此，DNA污染造成的假阳性信号可以被排除。图1，泳道4显示具有质粒PCR的阳性对照的结果。如预期的那样，PCR的产物的大小和对RNA样品进行RT-PCR以后所得的PCR产物的大小一样。图1，泳道5显示具有阴性对照(水)的RT-PCR反应的结果。图1，泳道1和6是分子量标记物(100bp梯形图)。

Western印迹结果显示NS1在MVA-AT I-NS1感染的细胞中表达。NS1在非加热的条件下，以正确的构象并作为二聚体表达，如图2A和2B的泳道1所示。当样品被加热时，可见NS1单体，如图2C。

结果还显示MVA-AT I-NS1感染的细胞中表达的NS1有抗原性，并且被采集的康复期患者的血清识别。

总之，该实验显示，NS1以正确的构象在MVA-AT I-NS1感染的BHK细胞中表达。二聚体和单体都有抗原性，并且被采集的康复期患者的血清识别。

    申请人或代理人档案号    BN 51 PCT    国际申请号

                              关于微生物保藏的说明

                                  (细则13之二)

  A.以下说明涉及说明书第＿＿4＿＿页，第＿＿13＿＿行所述的微生物。  B.保藏事项                                                                          它保藏在补充页中□                          公共卫生实验中心                          应用微生物研究中心  保藏单位名称            (Public Health Laboratory Services                          Centre for Applied Microbiology & Research)  保藏单位地址  (包括邮政编码和国名)  Poron Down  Salisbury，SP4 OJG  United Kingdom  保藏日期    1994年1月27日    保藏号    94012707  C.补充说明(必要时)                                                                  本栏内容有补充页□      我们要求，所述被保藏的微生物的样品，只能根据相关专利法规，例如，EPC法规28(4)；英国专利法规1995，  附录2，第3段；澳大利亚细则3.25(3)；丹麦专利实施条例22和33(3)；以及任何另一指定国的相应的法律法规，发放  给独立的专业人员，而前提是此种行为在指定国是可行的并且也是被指定国的法律所允许的。  D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)  E.补充说明(必要时)  下列说明将随后向国际局提供(指出说明的类别，例如：“保藏物的编号”)

PCT/RO/134表(1992年7月)

    申请人或代理人档案号    BN 51 PCT    国际申请号

                                 关于微生物保藏的说明

                                     (细则13之二)

  A.以下说明涉及说明书第＿＿4＿＿页，第＿＿14＿＿行所述的微生物。  B.保藏事项                                                                        其它保藏在补充页中□                    欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)  保藏单位名称                    European Collection of Cell Cultures  保藏单位地址  (包括邮政编码和国名)  英国，Wiltshire SP4 OJG，Salisbury，应用微生物学和研究中心  Center for Applied Microbiology & Research  Salisbury  Wiltshire SP4 OJG  United Kingdom  保藏日期    2000年12月07日    保藏号    00120707  C.补充说明(必要时)                                                                  本栏内容有补充页□      我们要求，所述被保藏的微生物的样品，只能根据相关专利法规，例如，EPC法规28(4)；英国专利法规1995，  附录2，第3段；澳大利亚细则3.25(3)；丹麦专利实施条例22和33(3)；以及任何另一指定国的相应的法律法规，发放  给独立的专业人员，而前提是此种行为在指定国是可行的并且也是被指定国的法律所允许的。  D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)  E.补充说明(必要时)  下列说明将随后向国际局提供(指出说明的类别，例如：“保藏物的编号”)

PCT/RO/134表(1992年7月)

    申请人或代理人档案号    BN 51 PCT    国际申请号

                                 关于微生物保藏的说明

                                     (细则13之二)

  A.以下说明涉及说明书第＿＿4＿＿页，第＿＿15＿＿行所述的微生物。  B.保藏事项                                                                        其它保藏在补充页中□                    欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)  保藏单位名称                    European Collection of Cell Cultures  保藏单位地址  (包括邮政编码和国名)  英国，Wiltshire SP4 OJG，Salisbury，应用微生物学和研究中心  Center for Applied Microbiology & Research  Salisbury  Wiltshire SP4 OJG  United Kingdom  保藏日期    2000年8月30日    保藏号    00083008  C.补充说明(必要时)                                                                  本栏内容有补充页□      我们要求，所述被保藏的微生物的样品，只能根据相关专利法规，例如，EPC法规28(4)；英国专利法规1995，  附录2，第3段；澳大利亚细则3.25(3)；丹麦专利实施条例22和33(3)；以及任何另一指定国的相应的法律法规，发放  给独立的专业人员，而前提是此种行为在指定国是可行的并且也是被指定国的法律所允许的。  D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)  E.补充说明(必要时)  下列说明将随后向国际局提供(指出说明的类别，例如：“保藏物的编号”)

PCT/RO/134表(1992年7月)

序列表

<110>巴法里安诺迪克有限公司(Bavarian Nordic A/S)

<120>通过使用牛痘ATI启动子表达改良的安卡拉痘苗病毒中的基因

<130>BN51PCT

<150>DK PA 2002 01813

<151>2002-11-25

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>牛痘病毒(Cowpox virus)

<220>

<221>启动子

<222>(1)..(29)

<223>

<400>1

gttttgaata aaattttttt ataataaat                              29