一种提高红豆杉内生真菌发酵物中紫杉醇产率的方法

摘要

一种提高红豆杉内生真菌发酵物中紫杉醇产率的方法，本方法利用产紫杉醇内生真菌与产紫杉醇合成前体10－去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III分别单独培养，然后将培养物进行混合培养，并适当补加培养基，大幅度提高发酵物中紫杉醇的产率。本方法的优点在于利用两种同类真菌代谢途径互补大幅提高发酵物中紫杉醇的含量，大大高于产紫杉醇内生真菌单独培养的产率水平。使利用内生真菌进行工业化发酵培养生产紫杉醇成为可能。本方法不但适用于产紫杉醇内生真菌与产紫杉醇合成前体的内生真菌混合培养，提高培养物中紫杉醇含量。也适宜于产生天然有用成分的内生真菌与产生天然有用成分合成前体的内生真菌混合培养，提高培养物中天然有用成分的含量。

说明书

                          技术领域

本方法是利用产紫杉醇内生真菌培养物与产紫杉醇合成前体的内生真菌培养物进行混合培养，大幅度提高其发酵物中紫杉醇含量的一种方法，属于生物技术领域。

                          背景技术

自wani et al.从短叶红豆杉(Taxus brevifolia Nutt.)的树皮中抽取分离出紫杉醇，并发现其具有抗癌作用以来，科研人员又陆续发现它的独特抗癌机理并可治疗多种癌症。因此，人们开始大量地从红豆杉的树皮提取紫杉醇以满足医药市场的需求。由于红豆杉树在世界范围内属珍稀植物，所以靠从树皮中提取紫杉醇必然严重地破坏自然资源，危及生态平衡。为了解决药源紧缺状况，国内外学者为多渠道得到紫杉醇做了大量研究包括培育新品种、化学人工合成、组织培养，细胞培养和微生物发酵。

Stroble与Stierle于1993年首次报道了从太平洋紫杉树中分离出一种可产紫杉醇的内生真菌，其紫杉醇含量为24～50ng/L，为人们展示了一个可能生产紫杉醇的诱人的新途径。之后，人们已经从各种红豆杉科植物中分离出许多能够发酵生产紫杉醇的内生真菌，报道的紫杉醇含量在14.2-406.95μg/L左右，其中，马天有，董兆麟报道的紫杉醇产率为14.2ug/L，(《西北大学学报(自然科学版)》，1999，29(1)：47～49)；Strobel G A，Hess W M，Ford E等利用小孢盘多毛孢发酵的产率为60-79ug/L(J Ind Microb，1996，17：417~423)；JY Li，RS Sidhu等利用内生真菌发酵产量为85.1μg/L左右(Joumal of induction Microbiology & Biotechnology.1998，20，259-264)；王建锋，吕华鹰，黄耀坚等。利用瘤座孢发酵得到的紫杉醇产率为185.4ug/L，(《厦门大学学报(自然科学版)》，1999，38(4)：485～487)；刘晓兰，周东坡，孙剑秋等利用树状多节孢发酵产量为406.950μg/L(《菌物系统》，2002，21(2)：246-251)。这些发酵产量水平是很低的，距工业化生产还有一定差距。一般来说，发酵物中紫杉醇的产量水平要达到1mg/L左右才有工业生产价值。

                         发明内容

本方法的目的在于提供一种通过产紫杉醇内生真菌培养物与产紫杉醇合成前体的内生真菌培养物进行混合培养生产紫杉醇的新方法，使其发酵物中紫杉醇含量大幅度提高。

本方法主要采用如下步骤：

1、培养基制备

(1)PDA培养基。

(2)发酵培养基：

葡萄糖 2-10g/L        蔗糖 10-20g/L       蛋白胨 0.5-2.5

醋酸钠 0.5-3g/L       MgSO₄ 2-5mg/L      Ca(NO₃)₂ 5-100mg/L

CuSO₄ 0.5-300mg/L    ZnSO₄ 0.5-200mg/L  MnCl₂ 1-25mg/L

FeCl₃ 0.5-10mg/L     KH₂PO₄ 10-350mg/L 维生素B₁ 0.5-10mg/L

维生素B₆ 0.5-30mg/L  苯丙氨酸 0.5-5mg/L   苯甲酸钠 50-1000mg/L  乙酰水杨

酸钠0.01-5mg/L        甲醇5-20ml/L         油酸1-10ml/L。pH6.8。

2、菌体预培养。分别挑取产紫杉醇内生真菌与产紫杉醇合成前体10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III内生真菌的菌丝接种于含50ml PDA培养基的发酵瓶中，在28℃，200转每分钟摇床黑暗培养2d形成种子发酵液。

3、菌体生长培养。分别将上述两种真菌的种子发酵液接种于含500ml发酵培养基的摇瓶中，在恒温摇床上于28℃，200rpm黑暗培养3d。扩大培养规模，可以进行二级生长培养。

4、混合培养生产紫杉醇。将生长好的产紫杉醇内生真菌培养物与产紫杉醇合成前体的内生真菌培养物按1∶0.5～4.0的体积份数比混合，补加总体积的0.5-1.0倍的发酵培养基，在恒温摇床上于28℃，200rpm黑暗培养6d。

5、紫杉醇的提取：将发酵物4000rpm离心15min。上清液和低温冻溶的菌体加等体积的乙酸乙酯超声波萃取1h，重复提取2次。合并所有乙酸乙酯层，于50℃旋转蒸干，甲醇洗涤，加入二氯甲烷和水1∶1(v/v)萃取后，将二氯甲烷蒸干，准确量取1ml乙醇溶解得到紫杉醇样品。

6、含量检测：紫杉醇样品过滤后上高效液相色谱柱，于228nm做定性及定量检测。以保留时间定性，以外标法进行定量分析。标准品均为Sigma公司产品，高效液相色谱条件为：流动相甲醇—水(65∶35)，反向C18柱，柱长15cm，柱温25℃，流速0.8ml/min。

本方法中所述的产紫杉醇内生真菌包括：

XT5(茎叶核菌属Ectostroma Fr.)，菌株种类鉴定(真菌鉴定手册 魏景超遗著上海 上海科学技术出版社 1979年645-649)

TAX-47(茎点菌属Phoma Sacc)(参考文献：陈毅坚，张硕，王艳等.云南红豆杉(Taxus yunnanensis)内生真菌中产紫杉醇真菌的筛选.生物技术.2003，13(2).-10-11)；

TAX-49(组丝核菌属Phacodium Pers.Ex Wallr.)(参考文献：陈毅坚，张硕，王艳等.云南红豆杉(Taxus yunnanensis)内生真菌中产紫杉醇真菌的筛选.生物技术.2003，13(2).-10-11)；

树状多节孢Nodulisporium sylviforme(参考文献：周东坡，平文祥，孙剑秋等.紫杉醇产生菌分离的研究.微生物学杂志，2001，21(1)：18~20)；

瘤座孢Tubercularia sp.(参考文献：王建锋，吕华鹰，黄耀坚等.一株新的紫杉醇产生菌及其抗肿瘤活性.厦门大学学报(自然科学版)，1999，38(4)：485~487)、

小孢盘多毛孢Pestalotiopsis mictospora(参考文献：Strobel G，YangX S，Sars J et al.Taxol from Pestalotiopsis microspora，an endophyticfungus of Taxus wallachiana.Microbiology，1996，142：435~440)等。

所述的产紫杉醇合成前体10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III内生真菌包括：

XT1(束丝菌属Ozonium Lk.ex Fr.)，菌株种类鉴定(真菌鉴定手册 魏景超遗著上海 上海科学技术出版社 1979年645-649)；

TAX-25(茎叶核菌属Ectostroma Fr.)(参考文献：陈毅坚，张硕，王艳等.云南红豆杉(Taxus yunnanensis)内生真菌中产紫杉醇真菌的筛选.生物技术.2003，13(2).-10-11)等。

本方法是利用这两种同类真菌代谢途径互补，一方面使高产紫杉醇合成前体的内生真菌为产紫杉醇内生真菌的生物转化提供大量合成前体(10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III)，充分利用产紫杉醇内生真菌菌株的生物转化能力合成紫杉醇。另一方面产紫杉醇内生真菌为高产紫杉醇合成前体的内生真菌提供了紫杉醇合成酶和信号诱导因子，使产紫杉醇内生真菌菌株合成的大量10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III转化为紫杉醇，从而使发酵物中紫杉醇的产率大大提高。在内生真菌生长末期，促进细胞透性的增加和部分菌体发生的自溶，也为大幅度提高紫杉醇的产率创造了条件。

利用本方法可以大幅提高紫杉醇的含量，使发酵物中的紫杉醇含量提高3.6-4.0倍左右，达到731.3022μg/L-1094.0274μg/L之间，大大高于产紫杉醇内生真菌单独培养的产率水平，使利用内生真菌进行工业化发酵培养生产紫杉醇成为可能。

本方法不但适用于产紫杉醇内生真菌与产紫杉醇合成前体的内生真菌混合培养，提高培养物中紫杉醇含量。也适宜于产生天然有用成分的内生真菌与产生天然有用成分合成前体的内生真菌混合培养，提高培养物中天然有用成分的含量。

                          具体实施方式

实施例1：

本例选用的是从南方红豆杉中分离出的两株内生真菌XT1(高产紫杉醇合成前体10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III，但几乎不产紫杉醇)和XT5(产紫杉醇)的培养物进行混合培养生产紫杉醇。

本例涉及的两个内生菌株种类鉴定(真菌鉴定手册 魏景超遗著上海上海科学技术出版社 1979年645-649)如下表：

                    内生真菌的形态特征、产物和分类地位

菌种代号宿主植物产物形态特征分类地位XT1南方红豆杉Taxus chinnsisvar.mairei10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III只有不孕菌丝，未发现有性和无性孢子，菌丝体呈棉絮状，未发现菌核，菌丝粗，交织成网状，菌体早期呈白色，后期呈浅米黄色束丝菌属OzoniumLk.ex Fr.XT5 南方红豆杉 Taxus chinnsis var.mairei紫杉醇只有不孕菌丝，未发现有性和无性孢子，后期能产生圆形小颗粒状暗色菌核，菌核外层分化不明显，中心无色。茎叶核菌属EctostromaFr.30 276.7554 1094.0274  3.9530

上述XT5和XT1可以采用现有常规的方法分离获得，以下例举一种分离方法：

将南方红豆杉(Taxus chinansis var maurei)的树皮切成约1.5cm的小段，分别经75％的酒精表面消毒5～15min，0.1％的升汞溶液处理15min，然后用无菌水冲洗，接种于含链霉素的PDA固体培养基平皿上，放置于25℃恒温箱中培养，待长出菌落后，按无菌操作程序挑出，在PDA斜面培养基上纯化3次以上。然后分离纯化后得到的真菌菌株进行摇床液体扩大培养，提取发酵物中的紫杉醇和各种前体，利用高效液相色谱测定，根据紫杉醇和紫杉醇合成前体标准品的保留时间定性，用外标法定量，筛选出的内生真菌XT5能够产生紫杉醇，而XT1能够产生紫杉醇的合成前体：10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III，且含量高，但几乎不产生紫杉醇。

以下是将XT5和XT1混合培养提取紫杉醇的具体过程：

1、培养基制备：

PDA培养基的制备：每升含200g土豆水煮上清液和20g葡萄糖，pH自然。

发酵培养基组成(未标注单位的均为mg/L)：

葡萄糖 5g/L        蔗糖 15g/L       蛋白胨 1g/L

醋酸钠 1g/L        MgSO₄ 2.5mg/L   Ca(NO₃)₂ 10mg/L

CuSO₄ 10mg/L      ZnSO₄ 5mg/L     MnCl₂ 2.5mg/L

FeCl₃ 2mg/L          KH₂PO₄ 100mg/L    维生素B₁ 5mg/L

维生素B₆ 5mg/L       苯丙氨酸 2mg/L       苯甲酸钠 400mg/L

乙酰水杨酸钠 1mg/L    甲醇 10ml/L          油酸 5ml/L

pH调到6.8，乙酰水杨酸钠混合培养时再加入。

2、菌体预培养。分别挑取XT1和XT5菌丝接种于含50ml PDA培养基的发酵瓶中，在恒温摇床上28℃，200rpm黑暗培养2d形成发酵种子。

3、菌体生长培养。分别将XT1和XT5的种子发酵液接种于含500ml发酵用培养基的摇瓶瓶中，在恒温摇床上28℃，200rpm黑暗培养3d。为扩大培养规模，可以进行二级生长培养。

4、混合培养生产紫杉醇。将生长好的产紫杉醇内生真菌和高产紫杉醇合成前体内生真菌分别单独培养，然后按1∶0.5～4.0体积份数比混合，补加总体积的0.5-1.0倍的发酵培养基，在恒温摇床上28℃，200rpm黑暗培养6d。

5、紫杉醇提取：将发酵物4000rpm离心15min。上清液60℃旋转蒸发至1/10体积后，加入等体积的乙酸乙酯在超声波下萃取1h；菌体低温冻溶2次后用组织捣碎器处理后加入等体积的乙酸乙酯在超声波下萃取1h，收集乙酸乙酯层，菌体沉淀和上清液再加入等体积的乙酸乙酯超声波提取2次。合并所有乙酸乙酯层，于50℃旋转蒸发至干，加入适量甲醇溶解洗涤固体物，再加入二氯甲烷和水1∶1(v/v)萃取后，将二氯甲烷层于45℃旋转蒸发至干，准确量取1ml乙醇溶解得到紫杉醇样品。

6、含量检测：紫杉醇样品过滤后上高效液相色谱柱，于228nm做定性及定量检测。以保留时间定性，以外标法进行定量分析。标准品均为Sigma公司产品，高效液相色谱条件为：流动相甲醇—水(65∶35)，反向C18柱，柱长15cm，柱温25℃，流速0.8ml/min。

将上述混合培养与两个菌株单独培养的对照进行比较，混合培养发酵物，XT5单独培养，XT1单独培养的发酵物中紫杉醇含量分别为：731.3022μg/L，191.3381μg/L，0μg/L，混合培养的发酵物中所能提取到的紫杉醇含量明显高于菌株单独培养的发酵物。

实施例2：

将例1中，产紫杉醇内生真菌换用组丝核菌属(Phacodium Pers.ExWallr.)；高产紫杉醇合成前体10-去乙酰巴卡亭III和巴卡亭III换用茎叶核菌属(Ectostroma Fr.)。发酵培养基中蔗糖改为10g/L，苯丙氨酸改为1mg/L，其他条件不变，进行TAX-49与TAX-25混合培养，TAX-49和TAX-25单独培养。高效液相色谱检测，发酵物中紫杉醇含量分别为：842.5648μg/L，231.5830μg/L，0μg/L。

实施例3：

将例1中发酵培养基中蔗糖改为10g/L，苯丙氨酸改为1mg/L，乙酰水杨酸钠改为0.5mg/L，油酸改为10ml/L，其他条件不变，进行XT5与XT1混合培养，XT5，XT1单独培养，高效液相色谱检测，发酵物中紫杉醇含量分别为：1094.0274μg/L，276.7554μg/L，0μg/L。

                  表：培养物中紫杉醇含量      单位μg/L

实例编号 XT1或组丝核菌 属单独培养 XT5或茎叶核菌 属单独培养 混合培养 混合培养提高倍 数1 0 191.3381 731.3022 3.82202 0 231.5830 842.5648 3.63833 0 276.554 1094.0274 3.9530