公开/公告号CN1617890A
专利类型发明专利
公开/公告日2005-05-18
原文格式PDF
申请/专利权人 真塔萨卢斯有限责任公司;
申请/专利号CN02827707.4
申请日2002-11-27
分类号C08B37/16;
代理机构72001 中国专利代理(香港)有限公司;
代理人顾晋伟;徐雁漪
地址 美国新泽西州
入库时间 2023-12-17 16:12:33
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2010-01-27
专利权的终止(未缴年费专利权终止)
专利权的终止(未缴年费专利权终止)
2007-06-20
授权
授权
2005-07-20
实质审查的生效
实质审查的生效
2005-05-18
公开
公开
背景技术
本发明涉及新型的聚合物生物活性剂载体。更具体地说，本发明涉及用作生物活性剂载体的环糊精接枝的生物相容聚合物及其制备方法。
许多具有各种不同治疗用功效的生物学活性分子如抗病毒剂、抗癌剂、肽/蛋白和DNA，通过重组DNA和其他技术的进步已作为商品供应了。然而，总是需要某种药物和活性剂用的理想载体来提高其溶解性、释放和疗效。
环糊精(CD)是环状寡糖，通常由6～8个葡糖单元组成，此种单元具有截锥形状，包括由仲羟基基团(2-OH和3-OH)构成的宽开放边和伯羟基基团(6-OH)构成的较窄边。环糊精提供一种独特的微观-多相环境，因为分子的外面是亲水的，而空洞则由于具有较高电子密度而表现为疏水。环糊精的包合性，即，客体分子与环糊精分子之间复合物的形成曾被广泛研究。在固态或溶液中形成的复合物由客体分子和将客体分子保持在其空洞中的宿主环糊精组成，并靠范德华力，和在较小程度上，靠偶极-偶极相互作用维持稳定。在水溶液中的包合复合物被认为依靠疏水相互作用而进一步稳定化，即，依靠溶剂水将适当尺寸和形状的疏水溶质推入到基本疏水的空洞中以便使溶剂达到其“最可能结构”和使整个体系达到最低能量的倾向。
天然环糊精(α-，β-和γ-CD)作为药物载体的实际应用受到其在水中溶解度低的限制。安全是环糊精作为药物载体的另一个主要担忧，因为环糊精具有毒性。对母体环糊精进行改性以改善安全性，同时维持其与各种被作用物形成包合复合物的能力一直是许多研究小组的目标。有些小组还集中在改善药品与环糊精之间的相互作用，而其他小组则试图制备可以在化学上更精确规定的材料。
两种最有希望的适合非经肠给药的环糊精衍生物是羟丙基β-环糊精(HPβCD或HPCD)和磺基丁基醚-β-环糊精(SBEβCD或SBE-CD)。HPβCD通常在对动物或人类非经肠给药时据发现是安全的。[Pitha等人，《药物科学杂志》84(8)，927-32(1995)]。在高剂量动物研究(100～400mg/kg)中曾发现微小、可逆、组织学上的改变，而暗示发生了红血细胞受损的较为显著的血液学改变是在这些高剂量研究中被观察到的。在人体研究中，未观察到不利的影响。SBEβCD，据发现，当对老鼠非经肠给药时也是安全的[Rajewski等人，《药物科学杂志》84(8)，927-32(1995)]。然而，像大多数改性环糊精一样，药品与HPβCD之间的结合常数通常小于其与母体或未改性环糊精的常数。由于宿主分子的空间位阻的缘故，羟丙基取代度越高，样品结合能力越差。
也曾制备过环糊精的疏水改性物，旨在改善某些CD-可包合样品的制剂。据发现，通常在β-环糊精(DM-βCD或DMCD)的2-和6-位羟基基团的部分甲基化，由于疏水相互作用的增加而导致较强的药品结合能力。虽然甲基化环糊精高度可溶于水，但它们也具有较大毒性。DMβCD的毒性可通过以乙酰基团对游离3-羟基基团实施改性而大大降低。这表明，具有优异生物相容性和包合能力的水溶性环糊精衍生物可以制备出来，只要小心选择取代基团。控制取代度对平衡水溶性和复合能力也具有重要作用。当取代基团比甲基基团更偏于疏水，例如，乙基基团、乙酰基团等时，整个环糊精衍生物就将变得实际上不溶于水。这些化合物已证明具有作为水溶性药物的持续释放(缓释)载体的潜在用途。在烷基化环糊精当中，七(2，6-二-O-乙基)-β-环糊精和七(2，3，6-三-O-乙基)-β-环糊精是首批与水溶性地尔硫卓、硝酸异山梨酯和肽裂榄素乙酸酯配合使用的缓释载体。
另一方面，过酰基化具有中等烷基链长(C4～C5)的环糊精由于其多官能和生物适应性因而是特别有用的新疏水载体。它们具有适合各种不同给药途径的宽泛适用性：例如，七(2，3，6-三-O-丁酰)-β-环糊精(C4)的生物粘附性可用于口服或经粘膜制剂，而七(2，3，6-三-O-戊酰)-β-环糊精(C5)的成膜性质则对于经皮制剂很有用。在口服用途中，吗多明，一种水溶性和短半衰期药物，其释放因使用全酰基化-β-环糊精，而随着其溶解度的降低明显变缓，特别是当使用碳链比丁基化衍生物长的那些时。当给小猎犬口服该复合物时，七(2，3，6-三-O-丁酰)-β-环糊精压低了吗多明的峰值血浆浓度值，并在长时间内维持足够的药物水平，而使用其他比七(2，3，6-三-O-丁酰)-β-环糊精链更短或更长的衍生物则证明缓释效果不足。这表明，七(2，3，6-三-O-丁酰)-β-环糊精可能是口服水溶性药物，特别是在胃肠道中代谢的药物用的有用载体。七(2，3，6-三-O-丁酰)-β-环糊精表现出的优异和持续的效果可能是疏水性提高和粘膜粘附性二者共同作用的结果。由于其疏水性，七(2，3，6-三-O-丁酰)-β-环糊精以及其他疏水环糊精衍生物只能以固体或油状制剂形式使用。另一方面，像天然β-环糊精一样，其以浓度依赖方式造成组织刺激和溶血作用的膜毒性则是阻碍其在制药中应用的另一个限制。例如，DM-β-CD诱导人体红细胞50％溶血的浓度低于所谓“生物适应性”CD衍生物如2-羟丙基-β-CD、β-CD的磺基丁基醚和麦芽糖基-β-CD的对应浓度。环糊精的溶血活性与膜组分被萃取，主要是通过与胆固醇的包合作用相联系。但是，这一缺点可以通过烷基化CD的进一步结构改性加以克服，例如，七(2，6-二-O-甲基-3-O-乙酰)-β-CD(DMA-β-CD)，据发现，溶血作用弱得多，同时却维持着与MD-β-CD相近的包合能力[Hirayama等人《药物科学杂志》88(10)，970-5(1999)]。鉴于在口服后，环糊精被胃肠道吸收得很差，故环糊精的口服给药极少会引起因环糊精本身被系统吸收导致的安全隐患。但是，环糊精可通过增加对某些营养素和胆汁酸的胃肠道消除而引起二次系统效应。此种效应在δ-环糊精辅助胆汁酸的粪便消除中表现得最明显。然而，此种消除作用的加强，只有在非常高的环糊精口服剂量(最高达饮食的20％)时才会观察到。加强胆汁酸消除的二次效应提高血清胆固醇向胆汁酸的转化率，其后果是血浆胆固醇水平的降低。
多年来制备了各种各样的环糊精，以改善母体环糊精的生理化学性质和包合能力，并且某些含环糊精药物产品已获得批准。由于要改变所承载的药物的溶解性能需要大量环糊精，故环糊精的毒性必须非常低才能安全地递送需要剂量的药物。因此，减少总剂量或者降低环糊精的内在毒性可拓宽环糊精的药物应用范围。
综上所述，可以看出，提供一种改进的含环糊精生物活性剂载体及其使用方法将是在技术上的一大进步。
发明概述
本发明提供一类新的含聚合物的两亲环糊精，其中多个疏水环糊精或衍生环糊精部分通过适当可生物降解的或不可生物降解的连接体而连接或接枝到一种生物相容亲水聚合物主链上。任选地，一种或多种导向部分(TM)或其混合物也可以共价键连接到聚合物主链上。本发明CD-接枝聚合物可以通过适当连接体将2～30个CD或其衍生物偶联到亲水聚合物，如聚乙二醇(PEG)或聚N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺)(HPMA)上而合成。要求的话，如上所述，一种或多种导向部分(TM)可任选地以共价键连接到该聚合物主链上。采用导向部分的目的是瞄准特定细胞来递送药物。该合成的载体，即，疏水CD-接枝的亲水聚合物，能改善药物/载体复合物的溶解性和降低其细胞毒性。
附图简述
图1是一幅曲线图，显示紫杉醇/CD复合物在50％血清中或10xPBS稀释液中的稳定性。
图2表示PEG-SS-AcCD的合成的反应路线。
图3表示PEG-SS-DECD的合成的反应路线。
图4表示PEG-GFLG-DECD的合成的反应路线。
图5表示PEG-C3-AcCD、PEG-C3--DECD和PEG-C3-BnCD的合成的反应路线。
图6表示PEG-L8-AcCD、PEG-L8--DECD的合成的反应路线。
发明详述
在公开和描述本发明组合物及其用于递送药物的方法之前，应了解，本发明不限于本文公开的特定构型、工艺步骤和材料，因为此种构型、工艺步骤和材料可以有一定变化。还应知道，这里所使用的术语仅为描述特定实施方案的目的而使用，不拟具有限制性，因为本发明范围将仅由所附权利要求及其等价物限定。
必须注意，当在本说明书和所附权利要求中使用时，单数形式包括多数所指项，除非在上下文中另行明确指出。
“活性剂”是指可作为本发明的客体分子起作用的那些药剂。活性剂包括化学品和其他物质，只要能与环糊精或衍生环糊精接枝聚合物形成包合复合物，对任何疾病(如肿瘤、梅毒、淋病、流感和心脏病)具有抑制、抗代谢或预防作用，或者对任何致病剂具有抑制或毒性。活性剂包括许多药物，例如，抗癌剂、抗肿瘤剂、抗真菌剂、抗生素、抗病毒剂、心脏病药物、神经学药物和毒品；生物碱(如喜树碱)、抗生素、生物活性肽、类固醇、类固醇激素、多肽激素、干扰素、白介素、麻醉剂、核酸，包括反义寡核苷酸、杀虫剂和前列腺素。活性剂还包括黄曲霉素、蓖麻毒素、环蛇毒素、药薯、丙氧鸟苷、速尿、消炎痛、冬眠灵、氨甲蝶呤、西芬胺衍生物和类似物，包括西法丁、desatrines、绿藜芦。它还包括各种黄酮衍生物和类似物，包括二羟基黄酮(白杨素)、三羟基黄酮、五羟基黄酮、六羟基黄酮、黄羊盐、榭皮素、漆黄素；各种抗生素，包括青霉素衍生物(如氨苄西林)、环霉素(如阿霉素、柔红霉素)、teramycins、四环素、盐酸四环素、羟甲金霉素、布托康唑、艾力替新、胍哌四环素、大环内酯(如两性霉素)、菲力平、制霉色基素、制霉素、各种嘌呤和嘧啶衍生物和类似物，包括5’-氟-尿嘧啶、5’-氟-2’-脱氧尿苷和别嘌呤醇；各种光敏物质，尤其是用于光动力学的单态和三态氧生成的那些、酞菁、卟啉及其衍生物和类似物；各种类固醇衍生物和类似物，包括胆固醇、异羟洋地黄毒苷元；各种香豆素衍生物和类似物，包括二羟基香豆素(马力树皮素)、双香豆素；驱虫豆素、大黄酸、大黄素、黑麦酮酸；各种二羟基苯丙氨酸衍生物和类似物，包括二羟基苯丙氨酸、多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素(盐酸去甲肾上腺素)。
“非经肠(的)”是指，肌肉内、腹膜内、腹腔内、皮下以及只要可行，静脉和动脉内。
“生物相容”是指，该物质为非致免疫、非致过敏并且将引起极小不希望的生理学反应。它们可生物降解并且它们，在其缺乏特异结合性质或生物识别性质的意义上为“生物学中性的”。
“连接体”或“环节”被定义为在化学物质中使用的特定化学部分或基团，它们能将环糊精部分通过共价键连接到聚合物主链上并且可以是可生物降解或非可生物降解的。合适的连接体将在下面更具体地规定。
“药物”应指任何有机或无机化合物或物质，只要具有生物活性并适合或被用于治疗目的。蛋白、激素、抗肿瘤剂、寡核苷酸、DNA、RNA和基因治疗剂都被涵盖在药物的广义定义内。
“肽”、“多肽”和“蛋白”当指肽或蛋白药物时将可互换使用，且将不限于任何特定分子量、肽序列或长度、生物活性或治疗应用的领域，除非具体指出。
“导向部分”指的是结合到特定生物物质或部位上的那些部分。该生物物质或部位被视为结合到它上面的导向部分的“标靶”。合适的导向部分的例子包括抗原、半抗原、生物素、生物素衍生物、外源凝集素、半乳糖胺、岩藻糖胺部分、受体、底物、辅酶、辅助因子、蛋白、组蛋白、激素、维生素、类固醇、前列腺素、合成或天然多肽、碳水化合物、脂类、抗生素、药物、地高辛、杀虫剂、麻醉剂、神经递质和各种核酸。
“核酸”被定义为任何取自任何来源的核酸序列。核酸包括所有类型RNA、DNA和寡核苷酸，包括在聚合酶链式反应(PCR)或DNA测序中使用的探针和引物、反义寡核苷酸和硫代磷酸寡核苷酸。还包括合成核酸聚合物，例如，甲基膦酸酯寡核苷酸、磷酸三酯寡核苷酸、吗啉代-DNA和肽核酸(PNA)，包括PNA夹子、DNA和/或RNA片断和取自任何组织、细胞、细胞核、细胞质、线粒体、核糖体和其他细胞源的衍生物。
“环糊精(CD)”是一种环状寡糖，由葡糖单体彼此偶联在一起形成的锥形、中空分子组成，具有疏水内部或空洞。本发明的环糊精可以是任何合适的环糊精，包括α-、β-和γ-环糊精及其组合、类似物、异构体和衍生物。环糊精可以是天然的或者以疏水基团改性的，正如下面将要更详细地描述的。
在描述本发明的过程中，称环糊精“复合物”指的是一种非共价包合复合物。包合复合物在本文中被规定为，一种环糊精或衍生的环糊精，起着“宿主分子”的作用，与一个或多个“客体分子”相结合，将它们全部或部分地包含或约束在环糊精或其衍生物的疏水空洞内部——这样形成的复合物。最优选的CD是衍生物，诸如羧甲基CD、葡糖基CD、麦芽糖基CD、羟丙基环糊精(HPCD)、2-羟丙基环糊精、2，3-二羟丙基环糊精(DHPCD)、磺基丁基醚CD、酰基化的、乙基化的和甲基化的环糊精。也优选能提供醛的氧化环糊精，和能提供醛的任何衍生物的氧化形式。还包括变换的形式如冠状醚样化合物和环糊精的高级同系物。
“受控释放”的定义是被俘获的客体分子/药物仅通过用于合成该载体的某种键的断裂从CD聚合物载体上的释放。
本发明涉及新型CD-接枝、生物相容、两亲聚合物及其制备方法和作为生物活性剂载体的应用。按照其最一般的定义，本发明涉及一种生物活性剂与至少一种CD-接枝聚合物偶联物之间的复合物，该偶联物包含生物相容亲水聚合物主链如PEG和HPMA、聚-L-赖氨酸(PLL)和聚乙烯亚胺(PEI)，其上接枝了至少一个，优选多个疏水改性CD。任选的是，一种导向部分(TM)可共价地连接到聚合物载体上。
优选的含环糊精聚合物可用这样一种含环糊精聚合物来定义，其中环糊精或衍生的环糊精部分通过单一间隔基臂连接到一种生物相容亲水聚合物主链上，该间隔基臂是按照如下式1代表的方式连接到环糊精的2，3，或6-位的：
(1)P是一种生物相容亲水聚合物主链，分子量介于2,000～1,000,000道尔顿，优选5,000～70,000道尔顿，最优选20,000～40,000道尔顿。优选的是，该生物相容聚合物主链是一种亲水聚合物，选自聚乙二醇(PEG)、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺聚合物(HPMA)、聚乙烯亚胺(PEI)和聚赖氨酸(pLL)，可按现有技术已知的方式适当地封端并且也可取代上对聚合物的预期功能不产生不利影响的取代基。优选的是，生物相容聚合物主链是聚乙二醇(PEG)聚合物。当环糊精以其2、3或6位连接时，则对应的R1O-、R2O-或R3O-基团将被置换，并且吡喃型葡糖的2、3或6-碳原子将与连接体X共价连接；
(2)R’是选自氢、组织-导向部分(TM)或细胞膜融合部分(FM)当中的一种，正如本文所述，条件是，氢、导向部分和细胞融合部分的混合物可存在于同一聚合物主链上和/或聚合物组合物内；
(3)X是连接体，具有通式：
-Q-Z-Q’-
其中Q以共价键键合在亲水聚合物链上，或者直接地或者借助烷基侧基或其他官能团，且Q’以共价键键合在环糊精上。Q和Q’独立地选自NR4、S、O、CO、CONH和COO。换句话说，Q和Q’可包含胺、烷基胺、酰基胺、硫、醚、羰基、酰胺或酯部分。Z包含选自亚烷基二硫醚、[-(CH2)aS-S(CH2)a-]、亚烷基[-(CH2)a]-]、氧化烯(-[(CH2)aO]b(CH2)a-)或短链肽当中的一种，其中a是1～10的整数，b是1～20的整数。优选的是，Q是酰胺，Q’是胺、烷基胺或酰基胺并且连接体具有通式：-CONH-Z-NR4-。最优选的是，Q将通过亚烷基(-CH2)a基团连接到衍生的聚合物链上。当Z是亚烷基二硫醚、氧化烯或肽时，连接体是可生物降解的。当Z是亚烷基时，连接体是不可生物降解的；
(4)R1、R2、R3和R4独立地选自H、烷基(Cn’H2n’+1)、链烯基(Cn’+1H2(n’+1)-1)或酰基(Cn’H2n’+1CO)，其中n’是1～16的整数，优选1～8，最优选1～4。当R1、R2、R3和R4是氢时，环糊精具有较为亲水的本性。当R1、R2、R3和R4之一或多个是烷基、链烯基或酰基基团时，衍生的环糊精在性质上变得较疏水。因此，当R1、R2、R3和R4每一个是烷基、链烯基或酰基时，环糊精最为疏水。酰基衍生的环糊精比烷基或链烯基衍生的环糊精更容易生物降解；
(5)q是5、6或7的整数，这使得侧基环糊精部分分别变成α-、β-或γ-环糊精衍生物。优选的是，q是6或7，最优选q是6。换句话说，优选的环糊精是β-环糊精；
(6)w是使每个聚合物主链含有1.5～30，优选2～15个环糊精部分/20KD(千道尔顿)聚合物主链的整数。整数“w”代表在聚合物组合物中环糊精部分的平均数目，因为聚合物组合物是一种聚合物链的混合物，其中每个聚合物链的链长、分子量和环糊精部分的数目是可变的。因此，在此种聚合物组合物中每种聚合物具有某一重均分子量和环糊精部分的平均数，每20KD聚合物主链。
本发明的一种实施方案是一类新的CD-接枝生物相容聚乙二醇(PEG)聚合物，可用下面通式2代表：
其中q、w、X、R、R1、R2、R3和R4如同通式1中所述，m和n是满足下列条件的整数：当与w组合时，它们代表其分子量如同针对通式1中的亲水聚合物所述的聚环氧乙烷聚合物链。换句话说，如通式1所示，生物相容聚环氧乙烷亲水聚合物主链的分子量优选介于5,000～1,000,000，更优选介于5,000～70,000，最优选20,000～40,000范围内。正如通式1所示，CD可借助单臂连接体X，通过CD分子的2、3或6位接枝到聚合物上，优选通过CD分子的6位接枝。当w具有与通式1相同的数值时，要理解，w被用来代表每20KD聚合物主链的环糊精单元数目，不是指含有顺序衔接的“w”个聚乙二醇(CH2CHXO)单体的聚合物单元。换句话说，聚合物主链含有“w”个沿聚合物主链间隔分布的含有环糊精侧基的单体单元。间距可以是无规的或者是均匀的，取决于合成过程。
最优选的是，含环糊精聚合物是具有如下通式3的含侧基CD的聚乙二醇聚合物主链：
其中Q、Q’、Z、R、R1、R2、R3、R4、a和q如同通式1中所述，w是使每个聚合物主链含有1.5～30，优选2～15个环糊精单元/20KD聚合物链的整数，按平均计，m和n是满足下列条件的整数：当与w组合时，它们代表分子量如同针对通式1中的亲水聚合物所述的聚环氧乙烷聚合物链。正如在通式2中所解释的，含有环糊精侧基的单体聚乙二醇单元不是连续衔接的，而可以是无规或均一地沿聚合物主链间隔分布的。
属于通式3范围的具体β-环糊精共聚物载于下表1。
表1
在表1中，SS是-CH2CH2SSCH2CH2-，C3是-CH2CH2CH2-，L8是-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2-，GFLG是四肽Gly-Phe-Glu-Gly。
作为药物载体，本发明的这些新型CD-接枝聚合物与其单体前体相比具有以下优点。
首先，它们的水溶性较高，毒性较低。聚乙二醇(PEG)是一种具有许多有用性质的线型聚醚二醇，例如，溶解性、生物相容性好，因为毒性、致免疫性和抗原性极小并且排泄动力学好。这些特征使得PEG在制药研究中被研究得最广泛并最终导致FDA(食品及药物管理局)批准用于内服药。因此，PEG可改变偶联的环糊精的物理化学性质和毒性，从而使其更为生物相容。
另外，这些CD-接枝的聚合物还提供提高的客体分子结合稳定性。CD的疏水改性提供更为疏水的环糊精空洞内部和外部，从而提高了包合复合物的稳定性。另外，在一个聚合物主链中有多个CD，将增加局域CD浓度并在药物结合上产生协同效应。因此，在结合到适当客体药物上以后，通过额外的疏水相互作用或离子相互作用，两亲共聚物可形成聚合物胶束。另外，这些含CD-接枝聚合物的药物可通过胞吞作用而不是通过被动的扩散，被细胞吸收。
此外，CD-接枝聚合物可用于生物活性剂的受控释放和导向-递送。该聚合物很容易与适当药物形成特殊类型的聚合物胶束。被动药物的导向通过瞄准特定细胞和器官可提高药物效率，从而降低药物在健康组织内的积累和大大减少其毒性，因此如果需要的话允许给予较高剂量的药物。在静脉给药以后，该聚合物胶束，据发现，具有持久的系统循环时间，因为它们尺寸小和具有亲水性外壳，这将大大减少被单核吞噬细胞系统(MPS)摄取的可能，还因为它们具有较高分子量从而防止肾脏的排泄。结合聚合物胶束的药物在肿瘤中可累积到比采用游离药物时更高的程度，并显示向非标靶区域如心脏内分布的减少[Kwon等人，《J Control Rel》，29，17-23(1994)]。聚合物胶束在有害或发炎的组织中的积累可能是由于血管通透性的增加和淋巴引流受到损伤(通透性增加以及储留(EPR)效应)造成的。EPR效应被认为是一种被动导向方法，但药物的导向可通过结合到导向部分如抗体或糖上，或者通过引入对温度或pH值变化敏感的聚合物，而进一步加强。导向胶束或pH敏感胶束可起到将药物递送给肿瘤、发炎组织或内体腔室的作用，因为这些部位都与pH值低于正常组织的数值相联系[Litzinger等人，《Biochim Biophys Acta》1113(20，201-27(1992)；Tannock等人，《癌症研究》49(16)，4373-84(1989)；Helmlinger等人，《Nat Med》3(2)，177-82(1997)]。
PEG在商业上以各种分子量、低多分散性(Mw/Mn＜1.1)的产品供应。根据其分子大小，可将它们主观地划分为低分子量PEG(Mw＜20,000)和高分子量PEG(Mw＞20,000)。PEG的最新应用集中在将细胞毒性抗癌药物固定在PEG上或将PEG接枝到蛋白、胶束或脂质体上，这样可降低系统毒性、延长在体内的停留时间、改变生物学分布和改善疗效[Takakura等人，《Crit Rev Oncol，Hematol》18(3)，207-31(1995)；Duncan等人，《抗癌药物》3(3)，175-210(1992)]。最近的研究发现，PEG的肾清除率随着分子量的增加而下降，静脉给药后最急剧的变化发生在MW＝30,000处。PEG在血液内循环的半衰期(t1/2)也显示伴随和急剧的增加。例如，随着分子量从6,000增加到50,000，PEG的t1/2从大约18min增加到16.5h。因此，抗癌药物与分子量20,000或更高的PEG的结合可防止PEG-偶联结合的化学物质被迅速消除并提供被动肿瘤积累效应[Greenwald等人，《Crit Rev DrugCarrier Syst》17(2)，101-61(2000)]。
在本发明的一种实施方案中，羧基接枝的PEG(20,000道尔顿或25,000道尔顿，含有8～10个羧基/每个PEG分子)被用作原料与环糊精偶联。为使空间位阻效应维持在最低水平，让CD部分以其空洞的小开放端(6-位)通过7个伯羟基之一连接到PEG主链上。另外，采用一种柔性线型连接体使CD部分与聚合物主链保持一定距离并让它自由运动。由于本发明聚合物材料的生物相容性和聚合物的柔顺性，它们所引起的毒性将最小，对周围组织的机械刺激作用也最低。
将由含有溶解的药物或者作为悬浮体或乳液的药物的接枝聚合物溶液组成的剂量形式向身体给药。关于在制剂中可加载多少药物的唯一限制是功能之一，即，药物加载量可增加到，直至聚合物所要求的性质受到的不利影响达到不可接受的地步，或者直至制剂的性质受到不利影响以致使制剂的给药困难到不可接受的地步。一般而言，预计在大多数情况下，药物将占到制剂重量的约0.01～50wt％，最常见约0.1％～25％。这些药物加载量范围不构成对本发明的限制。只要保持功能性，即使药物加载量不在这些范围内，它仍属于本发明范围之内。
作为本发明目标的组合物的显著优点在于接枝聚合物能提高药物物质的溶解度和稳定性的能力。疏水CD和亲水聚合物的组合赋予聚合物两亲的本性。就此而论，它在很大程度上起到环糊精包合和聚合物胶束体系的组合的作用。这对于疏水或水溶性较差的药物，如环孢菌素A、藤霉素、噻喹努佛和紫杉醇的增溶来说特别有利。
本发明组合物的另一个优点在于该聚合物能提高许多药物物质化学稳定性的能力。各种各样药物降解机理，据观察，当药物在该聚合物存在时将得到抑制。例如，与相同药物在有机助溶剂存在下的某些含水溶液相比，紫杉醇和环孢菌素A在本发明含水聚合物组合物中被显著稳定化。此种对紫杉醇和环孢菌素A的稳定效应只不过是对许多其他药物物质同样也可以实现的效应的一个例子而已。
加载在本发明CD-接枝聚合物上的药物可通过各种途径给药，包括非经肠、局部、经皮、经粘膜、吸入或插入到体腔中，例如采取经口、阴道、颊、经尿道、直肠、鼻子、口、肺部和耳朵给药。
本发明适用于所有类型生物活性剂和药物，包括核酸、激素、抗癌剂，并且它提供有效途径递送多肽和蛋白质。对可采用的多肽或蛋白质药物的唯一限制是功能的限制问题。在某些情况下，多肽和蛋白质药物的功能或物理稳定性还可以通过加入各种添加剂到多肽或蛋白质药物的水溶液或悬浮体中而提高。添加剂，例如，多元醇(包括糖)、氨基酸、表面活性剂、聚合物、其他蛋白和某些盐都可使用。蛋白工程方面的发展可能提供提高多肽或蛋白固有稳定性的可能。虽然此种设计或改性的蛋白就管制部门的定义而言可能被视为新的实体了，但这并不改变它们对本发明的适用性。
除了以肽或蛋白为基础的药物之外，其他来自所有治疗和医药有用类别的药物都可使用。这些药物描述在许多著名的文献中，例如，《Merck Index》、《内科医生必备参考》和《治疗学的药理学基础》。
紫杉醇是一种二萜类天然产物，表现出令人鼓舞的抗卵巢、乳腺、头和非小细胞肺癌的活性。最近，其用于治疗乳腺癌和顽固性人体癌症的紫杉醇形式已获核准。紫杉醇存在的主要问题之一是其水溶性极低。此种药物的目前制剂含有30mg紫杉醇在5mL50/50 CremophoreEL(聚乙氧基化蓖麻油，一种增溶表面活性剂)和乙醇的混合物中。当在盐水中稀释时，根据服用建议，紫杉醇的浓度是0.6～1.2mg/ml(0.7-1.4ml)。预料该稀溶液含有紫杉醇/Cremophor的混合“胶束”颗粒，且据报道，长期贮存后物理上不稳定，因为稀释到一定浓度显然将生成过饱和溶液。另外，Cremophor，一种不带电荷的表面活性剂，据报道，能引起组胺的释放并且与诸如严重过敏反应之类的负面效应相联系[Sharma等人，《国际癌症杂志》71(1)，103-7(1997)]。曾研究过环糊精衍生物是否能增溶紫杉醇的问题。现已发现，甲基化环糊精的功效要比其他亲水环糊精衍生物在改善紫杉醇的水溶性方面好得多(在50％CD浓度下，HPCD和DMCD能分别溶解约0.7和33mg/ml紫杉醇)。[Sharma等人，《药物科学杂志》84(10)，1223-30(1995)]。然而，DMCD的毒性以及为复合治疗含量的紫杉醇需要的高浓度限制了其临床应用。本发明CD-接枝的两亲聚合物由于制备和服用方便、毒性较低和活性剂释放迅速和可控以及可导向递送而提供相对于现有技术制剂的显著优点。
反义寡核苷酸及其类似物，例如，肽DNA(PNA)、吗啉代-DNA、P-乙氧基DNA、甲基膦酸酯-DNA等，已证明在生物医学研究中具有重要用途，但其在制药方面的应用在很大程度上一直受到稳定性和/或溶解性，以及细胞摄取行为等方面的限制。目前尚没有安全、完好地递送反义寡核苷酸到体内标靶部位的有效手段，而这对于其中性类似物，例如，PNA、吗啉代DNA、P-乙氧基DNA和甲基磷酸酯-DNA来说尤其如此，因为它们不能有效地结合到任何目前大多为聚合-阳离子聚合物的反义寡核苷酸载体上。然而，本发明CD-接枝的两亲聚合物则可以成为中性类似物的有效载体，因为每个核苷单元都具有芳族碱基残基，它们可作为潜在标靶被环糊精包括进去，从而使CD-接枝聚合物能够通过CD包合机理的强化来结合寡核苷酸及其类似物。此种结合因在聚合物上的大量CD部分与反义寡核苷酸上的大量芳族碱基环之间的结合作用而可能变得非常牢固。另外，额外的离子相互作用(对于带电荷的寡核苷酸来说)或疏水相互作用(对于不带电荷的寡核苷酸类似物来说)也可增强反义寡核苷酸与CD-聚合物载体之间的结合。结果，最终结合的复合物可形成一种疏松或紧密，取决于其内容物，的聚合物胶束，因此可安全地递送反义寡核苷酸及其中性类似物到细胞中。
总之，本发明CD-接枝聚合物能通过大量CD-部分协同作用和外部疏水或离子相互作用改善药物/结合复合物的稳定性。很可能，包合是本发明聚合物的药物-结合能力的主要机理。然而，离子相互作用和外部疏水相互作用(在CD空洞以外)也可能作出重要贡献，取决于具体共聚物和客体的分子结构。另外，恰当构造的本发明PEG-CD共聚物是优异的紫杉醇增溶剂和安全治疗用的载体。它们还可用作其他疏水药物的增溶剂和载体。本发明CD-接枝两亲聚合物可溶于水并且是生物相容的，并具有非常慢的释放动力学特性，尤其当它们含有高重量比例疏水部分时。另外，药物/聚合物复合物的强结合常数造就了稀释后被结合药物的缓慢释放，有时甚至需要以其他分子置换它。因此，它们可用作递送某些水溶性药物的口服制剂的成分。
再者，恰当构造的本发明CD-接枝聚合物可用来递送反义寡核苷酸及其不带电荷的类似物，乃至疏水肽和蛋白，因为外部疏水相互作用可为疏水反义寡核苷酸或疏水肽提供足够的稳定性。带负电荷的寡核苷酸预计也是某些专门构造的聚合物的良好客体分子，因为聚合物的连接体中的碱性氮在适当条件下能中和负电荷。
给出下面的例子旨在举例说明制备本发明组合物的方法和使用本发明组合物的方法。
实例1
材料和方法：带有丙酸侧基的PEG(PEG-10PA和PEG-8PA Mw＝～20KD，SunBio公司，Anyang市，南韩)在室温、真空下干燥过夜。使用前，β-环糊精(TCI(美国)，波特兰，OR)在130℃和真空下干燥过夜。其他化学品来自Aldrich化学公司(密尔沃基，WI)，以原封供货形式使用，不经进一步提纯。在Waters系统上实施HPLC(高压液相色谱)分析，系统配备RI检测器和Ultrahydrogel 120和Ultrahygel 500SEC柱。1H-NMR被记录在Varian 400MHz机上。
PECG-SS-CD(化合物2)的合成
单-6-(6-氨基-3，4-二硫代-己基氨基)-6-脱氧-β-环糊精(化合物1)：
2，2’-二硫双乙胺二氢氯化物(1.0g，4.44mol，Fw＝225.2)溶解在30mL蒸馏水中，随后加入1.0M KOH(8.88mol)和单-6-甲苯磺酰-β-环糊精(0.5g，Fw＝1289)粉末。获得的悬浮体在70℃油浴上搅拌过夜，随后浓缩至约4mL。混合物加载到Sephadex G-25柱(2.5×80cm)上，以0.1M TEA洗脱。得到约0.38g化合物1。
PEG-SS-CD(化合物2)
羧基基团接枝的PEG(2.24g，PEG-8PA，20KD，含约8个丙酸侧基的聚乙二醇，平均分子量约20,000)溶解在25mL无水DMF中，混合物在冰上和氩气保护下冷却至0℃。向其中加入280μL三丁基胺(1.18mmol，Fw＝185.36，d＝0.778)，随后加入175μL氯甲酸异丁酯(IBCF，Fw＝136.6，d＝1.053)在1mL DMF中的溶液。混合物在0℃下搅拌1h。随后，反应混合物在室温下慢慢加入到1.75g化合物2在100mLDMF中的溶液中。在室温下搅拌过夜后，通过加入1mL水停止反应。混合物经浓缩，随后以60mL水稀释。产物溶液在Sephadex G-50柱上以0.1M TEA洗脱随后加醚沉淀以实现提纯。1H-NMR分析指出，约5个CD部分偶联到分子量约20,000道尔顿的PEG主链上。该产物的保留时间比原料PEG的长约0.45min，根据HPLC色谱术测定[GPC柱，Rt(产物)＝17.33min，相比之下，Rt(PEG-8A)＝16.87min]。
1H-NMR(400MHz，D2O)：δ，5.0(s，7H，H1’)，3.3-3.9(m，370H，41H-CD，329H-PEG).
实例2
PEG-SS-AcCD(化合物3)的合成
PEG-SS-CD(化合物2，1.0g，约5CD/20KD-PEG)在P2O5干燥器中进行干燥，随后与50mL无水吡啶共蒸发。残余物在氩气保护下溶解在30mL吡啶中，随后加入2.0mL乙酐(Fw＝102.1，d＝1.08)中。混合物在室温下搅拌2日后放在旋转蒸发器上干燥。粗产物通过从甲醇中反复醚沉淀达到提纯。HPLC(GPC)分析显示与原料聚合物相比，该产物比原料聚合物延长0.46min(该产物Rt＝19.70min，比反应物聚合物的Rt＝19.24min)。1H-NMR分析指出每20KD PEG含有约5个CD部分并且所有的羟基基团都被乙酰化。
1H-NMR(400MHz，D2O)：δ，4.7-5.5(s，14H，H1’，H3’)，3.4-5.5(m，382H，35H-CD，347H-PEG)，2.05(m，20H，H-Ac).
实例3
PEG-SS-DECD(化合物7)的合成
PEG-SS-NH2(化合物4)：
羧基基团接枝的PEG(PEG-8PA，2.6g，约2.0mmol COOH基团)溶解在30mL无水DMF中并在冰上冷却至0℃。向其中加入三丁基胺(0.35mL，1.5mmol，Fw＝185.36，d＝0.778)，随后加入氯甲酸异丁酯(0.20mL，1.5mmol，Fw＝136.6，d＝1.053)。混合物在0℃下搅拌80min，然后小心地加入到2，2’-二硫双乙胺(3.5g，Fw＝152.2，23mmol)在50mL无水DMF中的溶液中。混合物在室温下搅拌20h，在40℃、旋转蒸发器上浓缩至约20mL，随后，在以50mL水稀释之后向蒸馏水中透析(4×5L，26小时，Sigma D-0655，MWCO＝12,000)。透析溶液通过在40℃下旋转蒸发而浓缩，结果获得4.1g浆。将浆溶解在10mL甲醇中，随后通过加入80mL乙基醚使其沉淀。通过离心处理收集沉淀，并重复该沉淀过程2次。最终产物是白色粉末，重约2.2g。该产物在其HPLC(GPC)色谱中仅显示一个完整的峰，保留时间(18.66min)比原料PEG-8PA(17.11min)长约1.5min。
N-(β-环糊精-6-基)甘氨酸甲酯(化合物5)：
甘氨酸甲酯盐酸盐(1.5g，Fw＝125.56，12mmol，Aldrich生产)在氩气保护下溶解在100mL无水DMF中。向其中加入DIPEA(2.1ml，12mmol，Fw＝129.25，d＝0.724)，随后加入6-单-甲苯磺酰环糊精粉末(3.0g，Fw＝1289，～80％纯，～1.8mmol)。 混合物在室温下搅拌至澄清溶液。温度慢慢升高到约70℃，随后再搅拌4h。混合物随后在旋转蒸发器上、55℃下浓缩为浆。粗产物溶解在40mL热水中，冷却至室温后加入～80mL丙酮而沉淀出来。过滤收集白色沉淀粉末，在真空下干燥过夜。获得约2.3g要求的化合物5。该产物不经进一步提纯直接用于下一步骤。
N-(七-2-O-乙基-6B，6C，6D，6E，6F，6G-六-O-乙基-β-环糊精-6A-基)-甘氨酸(化合物6)：
N-(β-环糊精-6-基)甘氨酸甲酯(化合物5，约2.0g，Fw＝1206，～1.6mmol)溶解在15mL DMSO(二甲基亚砜)和15mL DMF(二甲基甲酰胺)中。溶液在冰浴上冷却至0℃，随后在氩气保护下加入10g BaO和10g Ba(OH)2.H2O。向该白色悬浮体中慢慢加入20mL硫酸二乙酯，混合物在0℃搅拌1h，随后在室温下再搅拌24h。在1h时间内再慢慢加入20mL硫酸二乙酯，随后在室温下再搅拌24h。在0℃，向该粘稠反应混合物中慢慢加入60mL 5N氢氧化钠，随后混合物在室温下再搅拌1h。对其以2×200mL氯仿进行萃取。合并的有机相在用硫酸钠干燥后浓缩至蜡状产物。粗产物溶解在20mL甲醇中，随后加入20mL蒸馏水。混合物在真空中过滤以除掉痕量沉淀。澄清的滤液进行浓缩，结果获得橙色泡沫固体(约1.8g)，它包含约50％要求的化合物6。该粗产物在P2O5干燥器中干燥过夜以后直接用于下一反应中。
PEG-SS-DECD(化合物7)：
粗化合物6(1.4g，～0.46mmol)通过与2×20mL无水DMF共蒸发进行干燥，随后再溶解在20mL无水DMF中，继而加入0.19mL三丁基胺(0.8mmol，Fw＝185.36，d＝0.778)。混合物在冰上冷却至0℃。向该冷溶液中慢慢加入氯甲酸异丁酯(60μL，0.46mmol，Fw＝136.6，d＝1.053)在2mL DMF中的溶液。混合物在0℃下搅拌1.5h，随后在室温下转移到PEG-SS-NH2(化合物4，0.4g)在10mL无水DMF中的溶液中，随后加入DIPEA(28μL，0.16mmol，Fw＝129，d＝0.724)。混合物在室温下搅拌过夜之后被浓缩为浆。浆与30mL乙基醚一起研制，从而产生橙色沉淀。通过过滤收集沉淀并以乙基醚洗涤。固体通过从甲醇中的醚沉淀2次而进一步提纯。获得约0.55g浅橙色固体。1H-NMR指出该产物是所要求的PEG-SS-DECD产物，但仅有约1.5个CD部分偶联到20KD PEG分子上并有约13个乙基基团/每个环糊精。
1H-NMR(400MHz，D2O)：δ，5.1(7H，m，H1’和H3’)，3.2-3.9(m，1041H，41H-CD，1000H-PEG)，2.78(m，30H，CH2-Et)，1.15(b，45，CH3-Et).
实例4
PEG-GFLG-DECD(化合物11)的合成
单-6-(N3-Boc-3-氨基-丙基氨基)-6-脱氧-β-环糊精(化合物8)：
单-Boc-1，3-二氨基-丙烷(3.5g，～3.0mol，按照Jean FrancoisPons等人，《Eur.J.Org.Chem》，1998，853-859，中所描述的方法制备)通过与2.8mL(12mmol，Fw＝185.36，d＝0.778)三丁基胺和30mL无水DMF一起共蒸发2次达到干燥。最终干燥的油与100mL无水DMF进行混合，随后加入DIPEA(2.1mL，12mmol，Fw＝129，d＝0.742)。向该溶液中加入3.5g6-单-甲苯磺酰-6-O-β-环糊精。混合物在室温下搅拌至固体完全溶解。随后，混合物在70℃下、油浴中搅拌过夜。混合物在45℃、旋转蒸发器上浓缩至约10mL，随后以100mL丙酮进行沉淀。过滤收集白色沉淀，再以丙酮洗涤。获得约3.2g产物。它含有约60％要求的化合物8，根据TLC(薄层色谱法)(Rf＝0.12，硅胶，在80∶10∶10/AcOH∶CHCl3∶H2O中展开，以5％磷钼酸在95％乙醇中的溶液染色)估计。该产物直接送往下一步骤进行乙基化。
单-(七-2-O-乙基-6B，6C，6D，6E，6F，6G-六-O-乙基-β-环糊精-6A-基)-1，3-二氨基-丙烷(化合物9)：
单-6-(N3-Boc-3-氨基-丙基氨基)-6-脱氧-β-环糊精(化合物8，3.0g)在0℃下溶解在40mL无水DMF和40mL DMSO中，随后与10g氧化钡和10mL氢氧化钡合一水在氩气保护下进行混合。混合物冷却至0℃，随后慢慢加入20mL硫酸二乙酯。混合物在0℃下搅拌6h，随后在室温下再搅拌2日。向反应混合物中加入25mL冷氨，随后在室温下再搅拌3h。最终反应混合物以50mL水稀释，以3×100mL乙酸乙酯萃取。有机相以2×200mL饱和碳酸氢钠和3×200ml水彻底洗涤，随后以硫酸钠干燥后进行浓缩。在真空下干燥过夜后获得约2.8g橙色固体。产物溶解在10mL三氟乙酸中。澄清溶液在室温下搅拌3h，随后加入15mL水。混合物在室温下再搅拌20min，随后在45℃、旋转蒸发器上干燥。残余物溶解在150mL乙酸乙酯中，以3×100毫升饱和碳酸氢钠和100mL盐水进行洗涤。有机相在以硫酸钠干燥以后进行浓缩。获得约2.0g粗化合物9。该产物直接用于下一步骤的偶联反应中。
PEG-GFLF-DECD(化合物11)：
PEG-GFLG(四肽Gly-Phe-Leu-Gly接枝的PEG聚合物，化合物10，约4.5个GFLG肽在20,000D的PEG中，由PEG-8PA和GFLG肽制成)(2.0g，约0.4mmol-COOH，与30mL DMF共蒸发而干燥)在氩气保护下溶解在30mL无水DMF和0.17mL三丁基胺(0.7mmol，Fw＝185.36，d＝1.053)中。冷却至0℃后，向其中加入0.078mL(0.6mmol)氯甲酸异丁酯在2mL DMF中的溶液。混合物在0℃下搅拌1.5h，随后在室温下慢慢加入到2.0g化合物9在20mL DMF中的溶液中，随后加入0.087mL DIPEA(0.5mmol)。混合物在室温下搅拌过夜，浓缩至约10mL，以90mL冷乙基醚沉淀。过滤收集橙色沉淀并利用醚从甲醇中进一步沉淀3次。最终产物为约2.2g。产物的保留时间(Rt＝18.42min)比原料PEG-GFLG聚合物(Rt＝17.76min)长0.67min，按HPLC(GPC)色谱术测定。1H-NMR指出该产物是所要求的化合物11：每20KD聚合物含有约4.5个四肽GFLG和1.8个CD部分并且每个CD部分具有约13个乙基基团。
1H-NMR(400HMz，D2O)：δ，7.20(5H，m，ArH-Phe)，5.1(2.8H，m，H1’-CD)，3.0-4.0(645H，m，41H-CD，574H-PEG，30H-Et)，1.1(15.6H，m，30H，CH3-Et)，0.9(6H，d，CH3-Leu).
实例5
PEG-C3-AcCD，PEG-C3-DECD和PEG-C3-BnCD的合成
单-6-(γ-氨基-丙基-氨基)-6-脱氧-β-环糊精(化合物12)：
单-6-甲苯磺酰-6-脱氧-环糊精(6.5g，Fw＝1269)在室温和剧烈搅拌下溶解在200mL无水DMF和60mL二氨基丙烷中。澄清的混合物在室温下搅拌2h，随后在65℃下再搅拌20h。混合物在45℃下浓缩至约20mL。在室温下向其中加入200mL冷异丙醇。过滤收集白色沉淀。将该固体再次溶解在25mL水和25mL TEA中。在0℃下向其中慢慢加入300mL丙酮。过滤收集沉淀，并另外重复再沉淀程序2次。最终产物为约5.5g。它含有约80％要求的化合物12和约20％游离环糊精。产物不经进一步提纯直接用于下一反应中。
PEG-C3-CD(化合物13)：单-6-(γ-氨基-丙基氨基)-6-脱氧-β-环糊精(化合物12，6.2g)采用与上面PEG-SS-CD合成中描述的同一方法偶联到PEG-8 PA(4.1g)上。GPC提纯以后获得约4.3g纯产物。产物的保留时间(17.87min)比原料PEG-8PA(17.11min)长0.76min。1H-NMR指出该产物是所要求的化合物13，含有约4.5个CD部分每20KDPEG分子中。
1H-NMR(400HMz，D2O)：δ，5.0(7H，s，H1’-CD)，3.4-3.9(412H，m，41H-CD，371H-PEG).
PEG-C3-AcCD(化合物15)：PEG-C3-CD(1.0g，～4.5个CD/20KDPEG)采用与PEG-SS-AcCD制备中描述的同一方法进行乙酰化。获得约1.0g产物，其保留时间(17.99min)比原料聚合物(PEG-C3-CD，17.87min)仅长约7.2s。然而，1H-NMR指出该产物是所要求的化合物15，该聚合物含有约4.5个CD部分每20KD PEG分子并且在侧链CD上的羟基有约90％被乙酰化。
1H-NMR(D2O)：δ，4.9-5.4(14H，m，H1’-CD和H3’-CD)，3.2-4.5(m，490H，35H-CD，455 H-PEG)，2.03(d，64H，CH3CO-).
PEG-C3-BnCD(化合物16)：PEG-C3-CD(化合物13，0.9g，～4.5个CD/20KD PEG)通过与20mL无水吡啶共蒸发而干燥，随后在氩气保护下再次溶解在30mL吡啶中。在室温下(反应温度升高时用冰冷却)，向其中慢慢加入3mL丁酰氯(Fw＝106.55，d＝1.026)。混合物在室温下搅拌4h后，加入甲醇(5.0mL)，随后在室温下再搅拌30min。混合物在旋转蒸发器上浓缩至蜡状固体。该固体溶解在20mL甲醇中并以20mL水稀释。澄清溶液向2×5L20％异丙醇/水中进行透析。不透明的透析溶液在室温下、Speed-Vac中进行浓缩。颗粒利用醚从甲醇中进一步沉淀3次。产物实际不溶于水，但非常容易溶解在甲醇和氯仿中。收率＝90％。1H-NMR指出产物是要求的化合物16：侧链环糊精上的羟基基团中约80％被丁酰化。
1H-NMR(CDCl3)：δ，4.6-5.3(14H，m，H1’and H3’)，3.2-4.5(m，541，35H-CD，486H-PEG)，2.30(m，36H，CH3CH2CH2CO-，1.65(m，36H，CH3CH2CH2CO-)，0.95(m，54H，CH3CH2CH2CO-).
实例6
PEG-L8-AcCD和PEG-L8-DECD的合成
单-6-(8-氨基-3，6-二氧基-辛基氨基)-6-脱氧-β-环糊精(化合物17)：
在500mL圆底烧瓶中、氩气保护下加入2，2’-(亚乙基二氧基)双(乙基胺)(300mL，Fw＝148)和单-6-甲苯磺酰-β-环糊精(24.4g，Fw＝1269，在P2O5干燥器中干燥过夜)。悬浮体在室温下搅拌至所有固体完全溶解(～1.0h)。混合物在75℃下再搅拌4h。反应混合物慢慢倒入到1.8L冷异丙醇中。过滤收集沉淀并以异丙醇洗涤。沉淀溶解在200mL温水(50℃)中，随后在搅拌下慢慢倒入到1.8L冰冷的异丙醇中。冷却至-20℃后，过滤收集沉淀。该异丙醇沉淀过程再重复2次。获得约24g白色粉末。HPLC分析(GPC，以0.1M硝酸钠洗脱)显示，产物含有约85％要求的化合物(Rt＝39.21min)和约15％未改性的β-CD(Rt＝32.25min)，未检测到游离二胺反应物。于是，该产物被直接用于下一偶联步骤中。
1H-NMR(400HMz，D2O)：δ，4.97(7H，m，H1’)，3.7-3.9(26H，m，7H3’，7H5’，6H6’，6H6”)，3.3-3.6(24H，m，7H2/，7H4’，1H6’，1H6”，8H-连接体)，2.71(4H，m，CH2N-连接体).
PEG-L8-CD(化合物18)：
PEG-8PA(4.0g，约8-COOH/PEG--20K，约1.7mmol COOH，在P2O5干燥器中干燥过夜并与50mL无水DMF共蒸发)溶解在50mL无水DMF和0.54mL三丁基胺(TBA，Fw＝185.36，d＝0.778，2.27mmol)中。澄清的混合物在冰上冷却，随后在0℃下加入0.29mL氯甲酸异丁酯(IBCF，Fw＝136.6，d＝1.053，2.2mmol)。混合物在0℃下再搅拌1h，随后在室温下慢慢加入到单-6-(8-氨基-3，6-二氧基-辛基氨基)-6-脱氧-β-环糊精(化合物17，5.0g，Fw＝1336，～80％纯，～2，6mmol，在P2O5干燥器中干燥过夜)在50mL无水DMF中的溶液中。搅拌过夜后，混合物在50℃、旋转蒸发器上浓缩至约20mL。混合物以60mL水稀释并在Sephadex-G-50柱(2.5×80cm，以0.1M TEAA洗脱，pH＝10.0，收集到8mL/mL)上提纯。各个级分用GPC-HPLC分析，聚合物级分合并分成2部分：部分A：级分9～30；部分B：级分31～35。
两部分都在旋转蒸发器上浓缩为蜡状固体，随后再溶解在15mL甲醇中。产物用5mL TEA和120mL乙基醚沉淀。过滤收集白色沉淀。部分A和部分B分别重4.7g和0.55g。1H-NMR分析确认两部分都是要求的产物PEG-L8-CD产物，但区别在于环糊精加载量不同：部分A和部分B，平均每20KD-PEG聚合物，分别含有约5.5和8.5个环糊精部分。
1H-NMR(400MHz，D2O)：δ，部分A：5.0(s，7H，H1’)，3.3-3.9(382H，m，41H-CD，12H连接体，329H-PEG；部分B：5.0(s，7H，H1’)，3.3-3.9(256H，m，41H-CD，12H连接体，203H-PEG).
PEG-L8-AcCD(化合物19)：
PEG-L8-CD(化合物18，1.0g，约5.5CD/20KD PEG，在P2O5干燥器中干燥过夜)通过与40mL无水吡啶共蒸发达到干燥，随后在氩气保护下再溶解在40mL无水吡啶中。向其中加入3.0mL乙酐。混合物在室温下搅拌2日，在45℃、旋转蒸发器上浓缩至约10mL。向其中慢慢加入90mL乙基醚。过滤收集沉淀。产物通过再从甲醇中进行3次醚沉淀达到进一步提纯。最终白色粉末在真空下干燥，称重结果为1.07g。1H-NMR确认，产物是要求的产物19：每20KD PEG含有约5.5个CD部分，并且聚合物的侧链CD部分上的羟基基团中约90％被乙酰化。
1H-NMR(D2O)：δ，4.9-5.4(14H，m，H1’-CD和H3’-CD)，3.2-4.5(m，422H，34H-CD，12H-连接体，376H-PEG)，2.03(d，64H，CH3CO-).
PEG-L8-DECD(化合物20)：
PEG-L8-CD(化合物18，1.0g，约5.5个CD/20KD PEG，在P2O5干燥器中干燥过夜)溶解在5mL无水DMSO和5mL无水DMF中，溶液在氩气保护下在冰上冷却至0℃。向其中加入0.75g氧化钡和0.75g氢氧化钡合一水粉末，紧接着在1h时间内分3份加入3mL硫酸二乙酯。悬浮体在0℃下搅拌2h，随后在4℃再搅拌2日。随后在0℃下加入80mL冷乙基醚，随后在0℃下再搅拌30min。过滤收集橙色沉淀并溶解在50mL50％甲醇/水中。混合物向5L 0.01N HCl，随后向2×5L水中进行透析。最终透析溶液进行浓缩，获得约1g蜡状产物。将其通过从甲醇中进行2次醚沉淀达到进一步提纯。1H-NMR分析指出，每20KD-PEG中有约4个CD，且每个CD部分带有约11个乙基基团。这就是说，约30％CD部分在烷基化过程中从PEG主链上脱除。
1H-NMR(400HMz，D2O)：δ，4.9-5.3(7H，m，H1’-CD)，3.1-4.0(540H，m，41H-CD，469H-PEG，8H-连接体，22H-CH2-乙基)，1.2(33H，m，CH3-乙基)
按照实例1～6和图4～8制备了13种代表性环糊精-接枝的PEG聚合物(表1)，其中连接体为可生物降解的(X＝-SS-或-GFLG-)或者非可生物降解的(-C3-或-L8-)。侧基环糊精部分或者是天然的β-CD(PEG-X-CD)或者是以疏水基团改性的，包括乙基(PEG-X-DECD)、乙酰基(PEG-X-AcCD)或丁酰基(PEG-C3-BnCD)。用GPC-HPLC来监测制备过程的每一步骤，结果发现，所有的最终产物都具有比对应PEG前体长的保留时间。所有产物聚合物的结构都用1H-NMR分析加以确认，结果发现，它们的CD含量从平均1.5个CD到8.5个CD每20KD PEG主链不等(表2)。它们全都高度溶解在大多数有机溶剂(氯仿、甲醇、乙醇等)中。它们也高度溶于水，但PEG-C3-BnCD除外。
表2.某些环糊精接枝的PEG共聚物的结构特征
聚合物名称 tR CD数 CDs/ CD改性**
(min*) 20Kd聚合物**
PEG-ss-CD 19.34 3.9 无
PEG-ss-AcCD 19.24 3.9 ～100％乙酰化
PEG-C3-CD 18.07 4.8 无
PEG-C3-AcCD 17.86 4.8 ～80％乙酰化
PEG-L8-CD(A) 18.12 4.6 无
PEG-L8-AcCD(A) 17.98 4.6 ～95％乙酰化
PEG-L8-CD(B) 18.43 5.9 无
PEG-L8-AcCD(B) 18.08 5.9 ～84％乙酰化
PEG-L8-CD(C) 18.71 5.4 无
PEG-L8-AcCD(C) 18.53 5.4 ～100％乙酰化
PEG-GFLG-DECD 2.5 ～67％乙基化
PEG-L8-DECD 18.0 3.9 ～67％乙基化
PEG-C3-BnCD 4.5 ～80％丁酰化
*Waters Ultrahydrogel GPC柱(120和500)，以0.1M硝酸钠洗脱；
**按照在Varian 400HMz上记录的1H-NMR图谱计算；
实例7
紫杉醇与CD聚合物或CD单体的复合物的制备
(A)共-溶解方法：该方法适合所有与水溶性聚合物的复合物
聚合物(或单体对照)的水溶液(一般约100mg/mL)与等体积(一般40～2000μL)紫杉醇溶液(C紫杉醇＝0.1～8.0mg/ml，甲醇中)进行混合。混合物在室温下孵化约半小时。随后，在室温下、离心浓缩机中除掉溶剂。浓缩的浆或蜡状固体通过加入水或PBS缓冲液而再生成原来的体积。经过30min再生以后，混合物通常是澄清或略微浑浊的溶液。未溶解的紫杉醇颗粒采用超滤(0.2μm滤材)或离心(20min，20,800g和室温)除掉。上层清液中的紫杉醇浓度根据以对应环糊精聚合物溶液作为背景标定在290nm的紫外吸收率进行定量。
(B)透析方法：该方法适合制备所有紫杉醇/聚合物复合物溶液：
聚合物的甲醇溶液(一般约100mg/mL)与等体积(一般100μL)紫杉醇溶液(1～3mg/ml，甲醇中)进行混合。澄清的混合物在室温下孵化约半小时。随后，在室温下向2L水中透析(MWCO＝12,000)过夜。透析溶液一般为澄清溶液。痕量紫杉醇颗粒通过超滤(0.2μm滤材)或离心(20min，20,800g和室温)除掉。澄清溶液贮存在4℃或更低的温度下。
实例8
反义寡核苷酸/CD-聚合物复合物的制备
环糊精PEG聚合物(50mg/ml)与一定数量21-聚体-荧光标记的寡核苷酸在20mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)中进行混合。溶液在Speed-Vac中干燥，随后采用相同数量水再生。溶液形式的DNA/聚合物复合物采用1％琼脂糖凝胶在pH＝7.4的TAE缓冲液中进行分析。
表3.紫杉醇或寡核苷酸用某些该共聚物和
用其他现有CD衍生物承载之间的比较
聚合物 CD部分/ 紫杉醇加载量 寡核苷酸
承载聚合物
(mg/50mg聚合物*) (mg/50mg
聚合物*)
PEG-ss-CD 3.9 ＜0.05 ND**
PEG-ss-AcCD 3.9 0.8 ND
PEG-C3-CD 4.8 ＜0.05 ND
PEG-C3-AcCD 4.8 ～2.0 ND
PEG-L8-CD(A) 4.6 ＜0.05 ND
PEG-L8-AcCD(A) 4.6 ～2.6 ND
PEG-L8-CD(B) 5.9 ＜0.05 ND
PEG-L8-AcCD(B) 5.9 ～2.9 ND
PEG-ss-DECD 1.5 0.4 ～0.06
PEG-GFLG-DECD 2.5 3.0 ～0.2
PEG-C3-DECD 2.6 ＜1.0 ～0.15
PEG-L8-DECD 3.9 ＜1.0 ～0.2
对照样
HP-CD(来自Sigma) ＜0.05
(SBE)7-CD(来自Cydex) ＜0.05
DM-CD(来自Sigma) ～0.2(第1天)
EP-CD(来自Sigma) ＜0.05
*在1.0mL水或PBS中的药物量，在50mg聚合物或其他CD衍生物存在下。
**未检测到。
实例9
紫杉醇/CD复合物在50％血清中的或以PBS稀释到10倍以后的稳定性
(A)在50％胎牛血清中的稳定性：紫杉醇/PEG-L8-AcCD(2.0mg/50mg在1.0mL PBS缓冲液中)或紫杉醇/DMCD(0.5mg/50mg在1.0mL PBS缓冲液中)复合物溶液按照实例7的方法A中所描述的那些制备。50μL复合物溶液分别以等体积胎牛血清稀释。两种混合物分别在室温下孵化2h、21h、49h和144h后，在室温下以20,8000g进行离心分离。每种上层清液中的紫杉醇浓度通过测定在230nm的紫外吸收率加以定量。
(B)以PBS稀释到10倍以后的稳定性：紫杉醇/PEG-L8-AcCD(2.0mg/50mg在1.0mL PBS缓冲液中)或紫杉醇/DMCD(0.5mg/50mg在1.0mL PBS缓冲液中)复合物溶液按照实例10中所描述的那些制备。50μL复合物溶液分别以450μL PBS缓冲液稀释。两种混合物分别在室温下孵化2h、21h、49h和144h后，在室温下以20,8000g进行离心分离。每种上层清液中的紫杉醇浓度通过测定在230nm的紫外吸收率加以定量。
表4.紫杉醇/PEG-L8-AcCD和紫杉醇/DMCD复合物
在50％血清中的或以PSBS稀释后的稳定性试验一览表
实例10
紫杉醇从紫杉醇/PEG-L8-AcCD和紫杉醇/DMCD复合物的释放以及游离共聚物的细胞毒性
游离紫杉醇从紫杉醇/PEG-L8-AcCD复合物的有效释放由该复合物的细胞毒性得到证实。紫杉醇/PEG-L8-AcCD复合物制剂(本发明)和目前市售供应的紫杉醇/Cremophor制剂(紫杉醇，Bristol-MyersSquibb)这两种复合物，在所有3种试验的细胞系中按照下面描述的改进的MTT检验法进行了测定，获得相近的IC50值。但是，单独PEG-L8-AcCD自己在最高试验浓度下都显示不出可检测的细胞毒性，而cremophor则在约0.5mg/ml(表5)浓度下杀死了一半细胞：
1.将细胞按照约5,000细胞/孔铺在96-孔板上的每孔0.1mL的培养基中，并在37℃下孵育24h；
2.除掉旧培养基并在每孔中加入新鲜培养基80μL；
3.在每个孔中加入20μL样品溶液(按5倍系列稀释，每种样品至少8种浓度)；
4.细胞孵育3或4日；
5.除掉培养基。加入80μL新鲜培养基连同20μLMTS溶液(Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent #G358A)。在37℃孵育2～4h；
6.读取在490nm的吸光度；
7.计算IC50，以无细胞孔作为空白对照样，无药物孔作为100％存活对照样。
表5.不同紫杉醇制剂和载体对照样在
3种不同细胞系中的IC50*比较
制剂 IC50(ng/ml)
Hela HT1080 MCF7
紫杉醇/PEG-L8-AcCD 3.0 2.0 2.0
紫杉醇/Cremophor 3.0 4.0 2.0
Cremophor 500,000 500,000 500,000
PEG-L8-AcCD ＞10,000,000 ＞10,000,000 ＞10,000,000
*按照改进的MTT检验法评估50％细胞存活率的浓度：
实例11
共聚物及其可能的生物降解产物的溶血活性：
为进一步考察本发明聚合物及其可能的生物降解产物的细胞毒性，与市售CD单体对照，就各自对新鲜人血细胞的溶血作用进行了试验。溶血程度以占蒸馏水中血红蛋白的总流出量的百分数给出(表6)。
1.通过以1000g离心10min从全血中离析出红血细胞。
2.除掉血浆，将红血细胞再悬浮于通常的缓冲盐水中(PBS，0.154M氯化钠和0.01M磷酸盐，pH＝7.4)。通过离心(1000g，10min)使红血细胞成丸粒状。
3.重复步骤2两次，以除掉从损坏的细胞释放的血红素。
4.以PBS将最终丸粒稀释成为约12(或5％)，按离心沉降测定，的红细胞比容。
5.在37℃PBS缓冲液中平衡的、2mL从0到50mg/ml的在PBS缓冲液中系列浓度的聚合物或环糊精溶液在37℃进行平衡。向其中加入100μL红血细胞悬浮体，随后通过缓缓倒置来混合样品。样品在37℃下孵育30min。
6.完整细胞和细胞碎片通过以1000g离心5min来成粒。上层清液用分光光度计在543nm分析的数值作为血红素释放量。
表6.不同PEG-CD聚合物及其前体单体与
市售CD衍生物的溶血活性比较。
成分或 溶血
CD单体 (HC50.mM)
PEG-L8-AcCD ND
PEG-L8-DECD ND
PEG-L8-CD ND
CD-L8-NH2 25
(SBE)7-CD ND
DM-CD 1.0
βCD 4.0
HPβCD 35
以上数据显示，本发明新型PEG-CD聚合物具有作为紫杉醇的安全药物载体的巨大潜力(表3，表4，表5和表6)。在50mg/ml聚合物存在下，紫杉醇能够在水中溶解至少达2.2mg/ml的浓度，这相当于游离紫杉醇在水中溶解度的10,000倍以上，且比羟丙基-β-环糊精(HPCD)和甲基-β-环糊精(DMCD)在近似条件下[Sharma等人，《药物科学杂志》84(10)，1223-30(1995)]分别至少好1000倍和20倍。溶解度的急剧增加可能是由于至少以下3个因素的组合：1)CD部分的局部浓度提高；2)借助协同作用使结合常数增加，紫杉醇的结构具有三个苯基基团围绕着大的稠合、萜环体系；以及3)在CD空洞外面的额外疏水相互作用。
正如所料，偶联到PEG聚合物上以后，β-环糊精的毒性明显降低。从所有具有环糊精侧链的PEG聚合物都未检测到细胞毒性，正如MTT和溶血检验所指出的(表5和表6)。即便是单体(结构单元)，其毒性也比天然β-环糊精小得多。另一方面，由于CD部分在本发明共聚物中的重量比才不到25％，按照1H-NMR测定，在我们的实验浓度中(50mg共聚物/ml水)的实际CD浓度小于12.5mg/ml。换句话说，环糊精：紫杉醇的重量比，在本发明聚合物复合物中小于6∶1。因此，具有非生物降解连接体的该共聚物是具有非常高效的药物释放特性、非常安全的药物载体(表5)。另外，可生物降解连接体也可接受，如果需要加速药物释放的话。
给出上面的实例的目的仅在于举例说明，不应视为以任何方式构成对本发明的限制。本发明化合物和方法的各种修改方案可在不偏离本发明精神和范围的条件下仍可制定出来，要知道本发明唯一地由所附权利要求规定。
机译： 制备和使用环糊精和接枝生物相容性两亲聚合物的方法
机译： 环糊精接枝的生物相容性两亲性聚合物及其制备和使用方法
机译： 环糊精接枝的生物相容性两亲性聚合物及其制备和使用方法
