一个新的多巴胺能神经元保护因子及其应用

摘要

本发明公开了一种新的利用CYSC治疗中枢神经系统退行性疾病尤其是帕金森病的方法以及利用CYSC筛选、制备治疗中枢神经系统退行性疾病的化合物或药物组合物的新用途。同时本发明公开了一种治疗神经退变以及促进中枢神经再尘尤其是帕金森病的药物组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程和医学领域，具体的本发明涉及一个新的多巴胺能神经元保护因子——赛斯达廷C(cystatin C)及其应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是当今社会一种较为常见的中枢神经系统退行性疾病，该病好发于中老年，在美国，所有人群平均发病率约为1‰，而60岁以上的发病率则为1％。在我国，该病的发病率因人口老化等因素发病率与西方国家相似，并有逐渐上升的趋势。帕金森病病人自主运动的能力逐渐丧失，出现包括震颤、强直、动作迟缓等多种临床症状，病理特征为黑质致密带多巴胺能(Dopaminergic，DA)神经元退行性病变，在残余的黑质神经元出现嗜酸特性的Lewy小体。DA神经元的死亡导致纹状体多巴胺的严重枯竭(OlanowCW，Tatton，WG，Etiology and pathogenesis of Parkinson disease.1999，Annu.Rev.Neurosci.22：123-44；Blandini F，Nappi G，Tassorelli C，et al.Functional changesof the basal ganglia circuitry in Parkinson’s disease.2000，Prog.Neurobiol.，62：63-88)。

迄今为止，国内外神经科学界对它的发生机理的研究虽然已取得显著进展，但仍然缺乏完整的了解，在治疗方面，除缓解病人症状的一些方法外，更是缺乏根本而有效的手段。目前，人们已经认识到帕金森病的神经退行性变化的进程是可以延缓的。有资料显示，在约60-70％黑质DA神经元死亡后，帕金森病的临床症状才会出现，表明黑质——纹状体系统的巨大的可塑性和功能上的代偿能力，因此，如能有效减缓帕金森病退行性变化的进程和/或增强剩余多巴胺能神经元的功能，就有可能显著改善临床症状，从而提高患者的生活质量。从这一点出发，找到能有效保护中脑多巴胺能神经元的因子不失为一种有较大应用前景的治疗方法。

目前，人们已经发现多种与保护多巴胺能神经元相关的神经营养因子，如胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)及其家族的其它因子等等，它们均在各种实验的验证中显示出促进和保护多巴胺能神经元的特性(Airaksinen MS，Saarma M，The GDNF family：signaling，biological functions and therapeutic value，2002 Nature Review Neuroscience 3；383-394)。但是，它们的这种作用只是部分有效。一般认为，要达到更高水平的细胞保护，需要多个因子的联合使用才能实现。另一方面，随着对帕金森病发病机理认识的提高，包括线粒体损伤、氧化应激(ROS)、谷氨酸毒性、遗传因子和细胞凋亡等被认为与帕金森病的发生有非常密切的关系(Olanow CW，Tatton WG，Etiology and pathogenesis of Parkinson’sdisease.1999，Annu.Rev.Neurosci.22：123-44)，表明帕金森病致病机制的多样性和复杂性。由于帕金森病的发生可能同时涉及到上述多个各自独立的因素，因此，同时阻断疾病发生的各个环节才能有效控制其发展，从而达到最佳的治疗效果。因此，目前迫切需要研究新的能有效保护多巴胺神经元的分子，并且品种应是越多越好，以尽可能适应临床实践的需要。

已有的研究表明，6-羟基多巴胺(6-OHDA)所导致的帕金森病大鼠模型及帕金森病病人的纹状体的抽提物均有促进体外培养的腹侧中脑多巴胺能神经元存活的作用(Zhou J，Shen Y，Tang Z，Xu L.et al.Striatal extracts promote the survival and phenotypic expressionof rat fetal dopaminergic neurons in vitro.2000，Neurosci.Lett.292：5-8)。在该大鼠模型的纹状体内，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)家族中的多个分子，如GDNF，neurturin，persephin，artemin的mRNA表达水平显著上升，提示黑质多巴胺能神经元的死亡可导致去神经支配的纹状体内一些因子的mRNA水平的显著提高(Zhou J，Yu，Y，Tang，Z，Shen Y and Xu L.Differential expression of mRNAs of GDNF family in the striatumfollowing 6-OHDA-induced lesion.2000，Neuroreport，11：3289-3293)，并且这些因子中的一部分已被他人证实与神经保护有关，由于它们可能只是一群有神经保护作用分子中的一部分，因此，详细研究这群因子有助于建立和开发与帕金森病相关的创新性治疗方法。

有鉴于此，我们通过抑制消减杂交的方法获得一系列在大鼠帕金森病模型纹状体中差异表达基因的克隆。赛斯达廷C(cystatin C，简称CYSC)是其中的一个。该基因在GenBank的登录号是X05607。

CYSC是赛斯达廷超家族II类家族中的一个成员，具有抑制半胱氨酸蛋白酶(cysteineprotease)的作用。人源的II型赛斯达廷超家族包括赛斯达廷C，D，S，SN，以及近来发现的E/M和F，它们都位于20号染色体的赛斯达廷多基因位点。人源CYSC成熟蛋白含120个氨基酸，起初合成的前体蛋白含26个氨基酸的信号肽。它是半胱氨酸蛋白酶papain，cathepsin B，H，L和S等的抑制剂(Mason RW，Johnson DA，Barrett AJ，Chapman HA.Elastinolytic activity of human cathepsin L，1986，Biochem J.233：925-7；BaricosWH，Zhou YW，Fuerst RS，Barrett AJ，Shah SV.The role of aspartic and cysteineproteinases in albumin degradation by rat kidney cortical lysosomes.1987，ArchBiochem Biophys.256：687-91；Turk D，Podobnik M，Kuhelj R，Dolinar M，Turk V.Crystalstructures of human procathepsin B at 3.2 and 3.3 Angstroms resolution reveal aninteraction motif between a papain-like cysteine protease and its propeptide.1996，FEBS Lett.384：211-4)。

最近的结果还显示，CYSC是碱性成纤维细胞生长因子促进神经干细胞增殖时的辅助因子(Taupin P，Ray J，Fischer WH，Suhr ST，Hakansson K，Grubb A，Gage FH.FGF-2-responsiveneural stem cell proliferation requires CCg，a novel autocrine/paracrine cofactor.2000，Neuron.28：385-97)，并且CYSC的这一作用需要CYSC的糖基化才能实现。

CYSC广泛分布于各种组织，包括体液中，如尿液、血液和脑脊液(Barrett AJ，Davies ME，Grubb A，The place of human gamma-trace(cystatin C)amongst the cysteine proteinaseinhibitors.1984，Biochem Biophys Res Commun.120：631-6；Moller CA，Lofberg H，GrubbAO，Olsson SO，Davies ME，Barrett AJ.Distribution of cystatin C(gamma-trace)，aninhibitor of lysosomal cysteine proteinases，in the anterior lobe of simian and humanpituitary glands.1985，Neuroendocrinology 41：400-4)。有报道表明，CYSC可能参与脑损伤和大脑疾病的某些过程。如在短暂的脑缺血模型中，海马中的锥体细胞和活跃的星型胶质细胞内有特定的上调表达模式(Palm DE，Knuckey NW，Primiano MJ，Spangenberger AG，Johanson CE.Cystatin C，a protease inhibitor，in degenerating rat hippocampalneurons following transient forebrain ischemia.1995，Brain Res.691：1-8)，而且氧化应激反应也能使体外培养的神经元表达CYSC的水平升高(Nishio C，Yoshida K，Nishiyama K，Hatanaka H，Yamada M.Involvement of cystatin C in oxidativestress-induced apoptosis of cultured rat CNS neurons.2000，Brain Res.873：252-62)，提示CYSC参与了由氧化应激导致细胞凋亡的调节。CYSC在去内嗅皮层支配海马的过程中可能参与了中枢神经系统损伤后神经可塑性的过程(Ying GX，Huang C，Jiang ZH，Liu X，JingNH，Zhou CF.Up-regulation of cystatin C expression in the murine hippocampusfollowing perforant path transections.2002 Neuroscience 112：289-98)。最近还有资料显示，在老年性痴呆病人的脑脊液中，CYSC的水平较对照组高(Levy E，Sastre M，KumarA，Gallo G，Piccardo P，Ghetti B，Tagliavini F，Codeposition of cystatin C withamyloid-beta protein in the brain of Alzheimer’s disease patients.2001，JNeuropathol Exp Neurol.60：94-104)。上述资料提示CYSC与中枢神经系统有密切的关系，它可能参与了大脑神经元的退行性病变过程。但CYSC在这些病理条件下的确切功能和意义还不清楚，也没有资料提示它与帕金森病或多巴胺能神经元有任何关联。

发明内容

本发明的一个目的就是提供一种新的利用CYSC治疗中枢神经系统退行性疾病尤其是帕金森病的方法。

本发明的另一目的是提供CYSC的一种新用途。

本发明的再一目的是提供一种治疗神经退变以及促进中枢神经再生尤其是帕金森病的药物组合物。

本发明的第一方面，提供了一种治疗中枢神经系统退行性疾病的方法，所述方法包括步骤：给需要所述治疗的病人施用安全有效量的多巴胺能神经元保护因子——赛斯达廷C(cystatin C)。在一优选例中，所述的中枢神经系统退行性疾病为帕金森病。较佳的，所述赛斯达廷C被局部施用于病灶处。

本发明的第二方面，提供了一种赛斯达廷C的用途，所述赛斯达廷C用于制备治疗中枢神经系统退行性疾病的药物组合物。优选的，所述中枢神经系统退行性疾病为帕金森病。

在一优选例中，所述药物组合物是针剂。

本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有安全有效量的赛斯达廷C以及药学上可接受的赋形剂或载体。

较佳的，所述药物组合物的剂量为0.01微克/千克体重-约100微克/千克体重。

本发明的第四方面，提供了一种赛斯达廷C(cystatin C)的用途，所述赛斯达廷C用于筛选治疗中枢神经系统退行性疾病的化合物。

本发明的第五方面，提供了一种保健品，所述保健品含有赛斯达廷C。

如本文所用，术语“赛斯达廷C蛋白”“cystatin C”和“CYSC”可互换使用。

具体而言，本发明的赛斯达廷C蛋白可通过将相应的编码序列引入宿主细胞(直接引入或通过引入含赛斯达廷C编码序列的载体)，并在合适的条件下培养转化的宿主细胞以表达赛斯达廷C蛋白，然后分离和纯化出赛斯达廷C蛋白。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达赛斯达廷C蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

具体而言，本发明的赛斯达廷C蛋白有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：治疗神经退变以及促进中枢神经再生，和用于筛选促进赛斯达廷C蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组赛斯达廷C蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人赛斯达廷C蛋白功能的多肽分子。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与赛斯达廷C蛋白发生相互作用的物质，如抑制剂、激动剂或拮抗剂等。在筛选时，可以将赛斯达廷C蛋白加入生物分析测定中，通过测定化合物影响赛斯达廷C蛋白和其底物之间的相互作用来确定该化合物的影响。此外，还可将测试化合物与赛斯达廷C蛋白一起施用于实验动物，与对照相比中枢神经细胞存活数的变化可以表明，该化合物具有促进或抑制赛斯达廷C蛋白的作用。

此外，还可将赛斯达廷C基因的cDNA装入表达载体，转染哺乳动物细胞株，制备高表达赛斯达廷C蛋白的细胞株：并以此细胞株中的赛斯达廷C蛋白为靶位点，筛选对赛斯达廷C蛋白有激活或抑制作用的药物。并向所述的表达赛斯达廷C蛋白的细胞株培养液中加入测试化合物，检测赛斯达廷C蛋白表达量的变化。促进赛斯达廷C蛋白表达的化合物就是促进中枢神经再生的化合物。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、口服、或局部给药。正常的赛斯达廷C蛋白可直接用于疾病治疗，例如，治疗中枢神经系统退行性疾病。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的赛斯达廷C蛋白、其编码核酸、和/或反义核酸，以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.01微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的蛋白还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的赛斯达廷C蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.01微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.01微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

另外重组人赛斯达廷C基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

本发明的赛斯达廷C蛋白及其拮抗剂不仅可用于治疗，也可用于促进神经再生。因此，本发明还提供了一种保健品，它含有哺乳动物的赛斯达廷C蛋白或其编码序列，或其拮抗剂(如反义核酸)。本发明保健品，可通过保健品领域常规的方法，通过将哺乳动物的赛斯达廷C蛋白或其编码序列，或其拮抗剂(如反义核酸)与合适的稀释剂、食品等混合在一起而制备。优选的保健品是片剂、颗粒剂、口服剂形式。

发明人通过多种实验手段，证实了CYSC与多巴胺能神经元的相关性及其在帕金森病大鼠模型中的特定上调模式。借助体外细胞培养和在体动物实验，证实了CYSC对多巴胺能神经元具有明显的促进存活和降低神经毒素对其毒害的作用，提示该分子在帕金森病的治疗方面具有潜在的应用前景。

如前所述，CYSC具有半胱氨酸蛋白酶抑制剂的特性，但CYSC在中枢神经系统疾病状态下的确切功能和意义还不清楚，迄今也没有文献资料提示它与帕金森病或多巴胺能神经元有任何关联。发明人的研究结果显示，CYSC的mRNA在不同时期帕金森病大鼠模型大脑中纹状体内的表达水平显著升高(图1，图2)。免疫组织化学染色结果显示，CYSC的高表达分布于纹状体的尾壳核和苍白球(图3，表1)，并来源于多种细胞成分，即神经元、星型胶质细胞和小胶质细胞(图4)。在黑质，它的表达上调同样也很明显。CYSC对体外培养的胚胎腹侧中脑多巴胺能神经元有显著的促进其存活的作用，与对照组细胞存活相比，达2倍以上。已知神经毒素N-甲基-4-苯吡啶(N-methyl-4-phenylpyridinium，MPP⁺)对多巴胺神经元具有高度特异的毒性作用，体外培养的多巴胺能神经元MPP⁺处理后，细胞存活数为对照组的50％左右，但CYSC(20ng/ml)与MPP⁺(如20μM)同时加入培养的多巴胺神经元中则能显著对抗MPP⁺的这一毒性作用，说明CYSC具有对多巴胺神经元的保护作用(图5)。为进一步验证CYSC能否对抗另一种针对多巴胺神经元的神经毒素6-羟基多巴胺，我们预先将CYSC(每只动物5微克或15微克)注射进黑质，然后再在同一部位给予6-羟基多巴胺，动物存活4周后，对照组黑质残留的多巴胺能神经元约为正常对照的6.9％(与文献中报告的相符)，而在分别给予5微克或15微克CYSC的两组动物中黑质残留的多巴胺能神经元分别至27％和28％，约为对照组的4倍(图6，表2)。上述结果提示，由于受损伤大脑自身增加合成CYSC的反应滞后同时产量不足，因而，不足以对抗神经毒素所致对多巴胺神经元的毒性作用，外源性给予的CYSC则有助于保护多巴胺能神经元，表明该分子用作临床治疗的潜在价值。它的这一作用为研究治疗神经退变以及促进中枢神经再生的新方法提供了崭新的资料。

附图说明

图1.用Northern blot印迹法显示帕金森病大鼠纹状体中赛斯达廷C mRNA水平的变化。损伤2周和5周后，损伤侧的赛斯达廷C mRNA水平(箭头所指)与对侧相比有明显增高。图的下半部分显示各样品的总RNA水平，以示各泳道上样量基本一致。

图2.原位杂交法显示在帕金森病大鼠模型的尾壳核(A，B)和苍白球(C，D)CYSC mRNA的变化。

损伤侧(B，D)表达CYSC mRNA的细胞(蓝色点状物，每个点代表一个细胞)比损伤对侧(A，C)增多，表明CYSC可能与脑损伤相关。

图3.用免疫组织化学方法显示CYSC在帕金森病大鼠纹状体中表达水平有升高。损伤侧(B，D，F)表达CYSC的细胞数(棕色点状物)比损伤对侧(A，C，E)增多。

图4.免疫荧光双标记显示CYSC的来源。

A-C：CYSC与胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial fibrilary acid protein，GFAP，星型胶质细胞的标志物)在部分细胞(箭头所指)中共存，表明星型胶质细胞是CYSC的来源之一。

D-F：CYSC与RIP蛋白(少突胶质细胞的标志物)没有在任何细胞中共存，表明少突胶质细胞不是CYSC的来源。

G-I：CYSC与Integrin αM(小胶质细胞的标志物)在部分细胞(箭头所指)中共存，表明小胶质细胞也是CYSC的来源之一。

图5.赛斯达廷C对体外培养的多巴胺能神经元的存活有促进作用。

将取自胚胎14天的腹侧中脑(含多巴胺能神经元)在适当的培养基中培养3天，届时将这些培养的细胞用多聚甲醛固定，然后用酪氨酸羟化酶(TH)抗体进行免疫组化染色，随后进行细胞计数。

A：空白对照。

B：CYSC处理后的细胞培养，与A相比，可见存活的多巴胺能神经元(颜色较深者)数增加。

C：Leupeptin(作为阳性对照)处理后的细胞培养，与A相比，同样可见存活的多巴胺能神经元(颜色较深者)数增加。

D：CYSC的剂量效应图。

E：Leupeptin的剂量效应图。

F：在0-20μM MPP⁺存在下，CYSC能部分阻断其毒性作用，挽救多巴胺能神经元。

图6.  在体情况下，赛斯达廷C脑内注射对多巴胺能神经元的保护作用。

A、C、E、G：首先在大鼠纹状体内通过注射荧光金逆向标记黑质的多巴胺能神经元，已被标记的细胞可在330nm波长处被激发而呈现绿色，因而它被用来标记黑质存活的多巴胺能神经元。

B、D、F、H：通过酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组织化学的染色，观察了多巴胺能神经元的存活情况。在530nm光波的激发下，被酪氨酸羟化酶抗体标记的多巴胺能神经元呈红色(B，D，F，H)，有完整细胞形态的神经元均记数在内。损伤对侧的细胞数记数为100％，而对照组损伤侧残留的神经元为6.9％，这和文献报道的结果相符，说明我们模型的制备是成功的。在5微克加药组和15微克加药组的动物，损毁侧存活的细胞分别为27％和28％(F，H)，从另一个角度显示了CYSC对受损的多巴胺能神经元的保护作用。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验材料：

TOTALLY RNA分离试剂盒(Ambion，Austin，TX，USA)，in vitro transcription试剂盒(Roche，USA)，羊血清(Invitrogen公司，USA)，抗RIP抗体(美国路易斯维尔大学徐晓明博士惠赠)，抗IntegrinαM抗体(Chemicon，CA，USA)，人源赛斯达廷C(Calbiochem，USA)，荧光金(Flurogold，Flurochrome，CA，USA)，DMEM/F12(GIBCO，Invitrogen，USA)

以下试剂均来自美国Sigma公司(St.Louis，MO)：

生物素化的羊抗兔IgG，生物素化的羊抗鼠IgG，荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG，得克萨斯红标记的羊抗兔IgG，Cy3标记的亲和素，DTAT标记的亲和素(Jackson Immuno Research，USA)，抗酪氨酸羟化酶(TH)单克隆抗体，抗胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体。所用大鼠来自于中国科学院上海实验动物中心(松江九亭)。

实施例1帕金森病大鼠模型的制备

将体重为180-220克的雌性Sprague-Dawley大鼠经麻醉后固定在小动物立体定位仪上。利用微型注射器将4微升6-羟基多巴胺(Sigma，USA)(2.5微克/微升溶于0.2毫克/毫升抗坏血酸(Sigma，USA))注射入大鼠右侧内侧前脑束(相对于前囟的定位坐标：AP，-4.4mm，ML，+1.2mm，DV，+7.8mm)，注射速度为0.4微升/分钟，完成注射后留针10分钟再将注射器缓慢退出。手术后一周腹腔注射阿朴吗啡(Sigma，USA)(0.05毫克/公斤体重)，测试大鼠旋转，旋转每分钟6圈以上者为合格的帕金森病大鼠模型。

实施例2 Northern blot印迹

利用TOTALLY RNA分离试剂盒(Ambion，Austin，TX，USA)从成年大鼠脑内抽取出总RNA，经电泳后利用毛细管现象将总RNA转移至尼龙膜，然后与32磷标记的CYSC探针在42℃下杂交16小时，经漂洗后，在-80℃下与X光片共同曝光3天，显影后即得到图1。在该图中可以清楚地看到帕金森病大鼠纹状体中赛斯达廷C mRNA水平的变化。损伤2周和5周后，损伤侧的赛斯达廷C mRNA水平(箭头所指)与对侧相比有明显增高。图的下半部分显示各样品的总RNA水平，以示各泳道上样量基本一致。

实施例3原位杂交分析

首先根据欧洲分子生物学数据库(EMBL)中登录的CYSC的基因(登录号X16957.1)序列设计引物并利用PCR获取一690碱基长的cDNA片断，利用in vitro transcription试剂盒(Roche，USA)合成相应的地高辛标记的cRNA探针。将帕金森病大鼠模型的大脑用4％多聚甲醛固定后，切片，然后与CYSC的cRNA探针在50℃下杂交过夜，杂交液含50％甲酰胺，10％右旋糖苷，10mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.5)，600毫摩尔氯化纳，1×Denhardt’s溶液and 400微克/毫升鱼精DNA。杂交结束后，经漂洗，与抗地高辛抗体孵育，加入适当底物后即可显现被标记的阳性细胞(图2)。用该方法可以灵敏地显示在帕金森病大鼠模型的尾壳核(A，B)和苍白球(C，D)CYSC mRNA的变化。在图2中可见，损伤侧(B，D)表达CYSC mRNA的细胞(蓝色点状物，每个点代表一个细胞)比损伤对侧(A，C)增多，表明CYSC可能与脑损伤相关。

实施例4免疫组织化学染色

脑片经常规方法固定，用含0.01％曲拉通X-100的磷酸盐缓冲液漂洗后用4％羊血清(Invitrogen公司，USA)孵育30分钟，在4℃下与含1％羊血清的第一抗体孵育48小时，漂洗，然后在生物素化的第二抗体中孵育1.5小时，再与结合有卵白素的辣根过氧化酶孵育1小时，最后加入底物DAB显色反应。用光学显微镜下经放大200倍进行细胞计数。结果可见(图3)，损伤侧(B，D，F)表达CYSC的细胞数(棕色点状物)比损伤对侧(A，C，E)增多，在损伤侧黑质和纹状体的CYSC免疫反应阳性的细胞较对侧数目多，且着色深，说明黑质多巴胺能神经元的受损导致CYSC的表达水平上升，进一步表明CYSC可能与脑损伤相关。详细的细胞计数结果列于表1中。

实施例5免疫荧光双色标记染色

脑片经常规方法固定，用含0.01％曲拉通X-100的磷酸盐缓冲液漂洗后用4％羊血清孵育30分钟，在4℃下与含1％羊血清的第一抗体孵育48小时，漂洗，将脑片与生物素结合的第二抗体(Sigma，USA)孵育1.5小时，漂洗，再与结合有卵白素的荧光素孵育1小时，漂洗。然后4％多聚甲醛固定20分钟，漂洗，用4％羊血清孵育30分钟，然后与各类细胞标记分子的抗体孵育，漂洗，然后与对应的荧光素标记的第二抗体(如荧光素标记的羊抗鼠IgG、得克萨斯红标记的羊抗兔IgG，Cy3标记的亲和素或DTAT标记的亲和素)孵育，漂洗。用荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察，照相。结果显示，在纹状体CYSC免疫反应阳性细胞从形态上看除有神经元之外，星型胶质细胞和小胶质细胞也表达CYSC。在黑质CYSC出现在多巴胺能神经元和小胶质细胞中(图4)。

第一抗体蛋白英文名称对应使用的第二抗体第一抗体的用途Cystatin C(Calbiochem，USA)抗兔IgG(Sigma，USA)识别表达cystatin C的细胞抗胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)抗体：Glialfibrillary acid protein抗小鼠IgG(Sigma，USA)识别星型胶质细胞(Sigma，USA)抗酪氨酸羟化酶(TH)单克隆抗体：Tyrosinehydroxylase(Sigma，USA)抗小鼠IgG(Sigma，USA)识别多巴胺能神经元Integrin αM(Chemicon，CA，USA)抗小鼠IgG(Sigma，USA)识别小胶质细胞RIP(美国路易斯维尔大学徐晓明博士惠赠)抗小鼠IgG(Sigma，USA)识别少突胶质细胞

实施例6胚胎大鼠腹侧中脑细胞的原代培养及CYSC作用的观察

取怀孕14天Sprague-Dawley孕鼠(发现阴栓之日为怀孕第0天)的胚胎置于预先冷却的无钙、镁离子的D-Hanks缓冲液中，在解剖显微镜下分离腹侧中脑。先以D-Hanks缓冲液洗涤组织2次，再加入胰蛋白酶(25微克/毫升)室温下孵育5-10分钟，以10％胎牛血清终止反应，DMEM/F12(1∶1)(GIBCO，Invitrogen，USA)洗涤组织2次，轻柔吹散组织块，静置5分钟取上清细胞悬液，台盼蓝染色后计数活细胞数。以每平方厘米1×10⁵个细胞的密度种入预先铺多聚赖氨酸的96孔培养板，培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12。4小时后更换为含1％N2的DMEM/F12，同时加入CYSC。细胞培养液体积为100微升，换液后24小时固定细胞。由图5可见，与对照组相比，CYSC对多巴胺能神经元的促进存活的作用可达2.2倍。

为观察CYSC对N-甲基-4-苯吡啶(MPP⁺)(Sigma，USA)处理的体外培养的腹侧中脑细胞是否有促进存活作用，将胚胎14天大鼠腹侧中脑细胞的原代培养如上，4小时后更换为含1％N₂的DMEM/F12，随即加入MPP+或CYSC加MPP+，36小时后多聚甲醛固定，用TH单克隆抗体进行免疫组织化学染色。结果显示，在不同浓度MPP⁺存在的情况下，20纳克/毫升CYSC对培养的中脑多巴胺能神经元有明显的对抗MPP+毒性的作用(图5F)。

实施例7  CYSC的脑内注射对在体动物黑质多巴胺能神经元保护作用的观察

Sprague-Dawley雌性大鼠，体重180-220克，麻醉后固定于定位仪上，如前，鼻高设为0。按以下坐标于纹状体两侧注射0.2微升用2％生理盐水配制的荧光金：相对于前囟的定位坐标为：AP，+0.5mm；ML，±3.4mm；DV，-5.0mm。一周后，注射CYSC，分为5微克组，15微克组及对照组。对照组注射0.1％牛血清白蛋白(溶于0.1摩尔磷酸盐缓冲液)。各组注射液体积均为3.4微升.坐标为：AP，-5.4mm；ML，-2.2mm；DV，-8.5mm。鼻高为-3.3mm.注射速度为0.4微升/分钟，留针5分钟后缓慢退针。6小时后，每只大鼠在同一坐标点注射用含0.02％抗坏血酸的生理盐水配置的6-羟基多巴胺2微克/3.4微升，手术同前PD模型。4周后将动物处死、灌注并制备大脑组织切片。

在脑片上识别多巴胺神经元的两种方法：一是通过在纹状体注射荧光金，一周后逆行运输到黑质的多巴胺神经元，通过紫外光的激发(330nm波长)可在荧光显微镜下看到被荧光金标记的细胞(图6A，C，E)。二是，多巴胺神经元本身有丰富的酪氨酸羟化酶，通过免疫组织化学染色可以显示(图6B，D，F)。这两种方法相互独立，可以更客观地衡量CYSC脑内注射后的效果。

由荧光金标记结果可见，损伤对侧被荧光金标记的细胞在黑质的分布完整，且细胞形态完整，数量为100％。对照组中被荧光金标记的细胞多数为凋亡状态(图6C)，形态完整的细胞约为对侧的6.9％，这和文献报道6.1％的结果相符。5微克给药组和15微克给药组损毁侧细胞数接近，约为对照组的28％和27.1％，说明CYSC对细胞的保护作用。另一方面，通过酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组织化学染色，我们考察了TH免疫反应阳性神经元的存活情况。在530nm光波的激发下，被TH标记的多巴胺能神经元呈红色，只有细胞形态完整的神经元才列入记数。损伤对侧的TH阳性细胞数设为100％，而对照组损伤侧残留的TH免疫反应阳性神经元为对照的6.9％(图6D)，在5微克给药组和15微克给药组损毁侧存活的细胞分别为27％和28％(图6F，6H，表2)，显示了CYSC对受损的多巴胺能神经元的保护作用。详细细胞计数结果列于表2中。

实施例8  药物组合物的制备

将CYSC蛋白制成针剂，使用时对患处进行皮下注射，直接保护病灶处的中枢神经细胞，使病人的中枢神经系统退行性疾病特别是帕金森病得到改善，从而达到治疗的目的。

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