抗耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）的多酸化合物及其制备方法

摘要

抗耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)的多酸化合物及其制备方法，本发明属于化学合成药物及其制备方法。本发明药物是由金刚烷胺、吗啉胍、5－Fu(5－Fc)、异烟肼等临床药物与多金属氧酸盐自组装合成。这里多金属氧酸盐包括化学式分别为XM12O40 n－ (X＝P，As，Si，Ge....；M＝Mo，W...)的Keggin型、X2M18O62 n－ (X＝P，As，Si，Ge....；M＝Mo，W...)的Dowson型和化学式为LnW10O36 n－ (Ln为镧系元素)的杂多酸盐。由金刚烷胺、吗啉胍、5－Fu(5－Fc)、异烟肼等临床药物与多金属氧酸盐自组装形成化合物的一种或几种联合使用对目前抗生素难于治愈的肺炎链球菌感染症有显著的治疗效果。

说明书

技术领域

本发明属于化学合成药物及其制备方法，特别是关于对耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)具有抑制作用的多酸类抗菌药物及其制备方法。

背景技术

肺炎链球菌属于革兰氏阳性菌，是严重侵袭性感染(如脑膜炎、败血症、急性中耳炎、脓毒症、肺炎)和上呼吸道感染最重要的病原体之一。全球每年有400万至600万人死于这种细菌感染。曾经认为青霉素是对肺炎链球菌的常规敏感药物，自从六、七十年代在澳大利亚和南非首先报道了耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP，penicilline-resistant streptococcuspneumoniae)感染以来，近二十年PRSP感染在全世界都有了报道，有调查表明青霉素耐药率在美国为40％，日本37％，香港45％，南韩高达77％。肺炎链球菌对青霉素耐药(耐药机制为青霉素结合蛋白PBP2′的改变)发生率的上升，使许多抗生素正在逐渐失去原有的效力。医生们十分担心，如果细菌的耐药性这样增长下去，将来肺炎、肠炎等疾病都有可能变成不治之症。随着肺炎链球菌对多种抗生素的抗性不断增强，改变原有治疗方案、开发新型治疗药物是十分必要的。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种与以往抗生素不同的对耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)感染有抑制活性的新的抗菌剂。

本发明的目的之二是提供一种制备上述药物的方法。

本发明的抗耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)感染新的抗菌剂是由分子结构中含氨基或含有给电子集团的有机物，如金刚烷胺、吗啉胍、咖啡碱、5-Fu(5-Fc)及异烟肼等，与多金属氧酸盐自组装形成的超分子化合物，或者是这些化合物之间的组合。多金属氧酸盐阴离子有如下特征：Keggin型多阴离子，XM₁₂O₄₀^n-(X＝P，As，Si，Ge....；M＝Mo，W...)；Dowson型多阴离子，X₂M₁₈O₆₂^n-(X＝P，As，Si，Ge....；M＝Mo，W...)和LnW₁₀O₃₆^n-(Ln为镧系元素)型多阴离子。金刚烷胺与上述多阴离子自组装形成的超分子化合物是以通式(C₁₀H₁₈N)mXM₁₂O₄₀·nH₂O(X＝P，As，Si，Ge....；M＝Mo，W...；m＝1，2，3，4或5)、(C₁₀H₁₈N)mX₂M₁₈O₆₂·nH₂O(X＝P，As，Si，Ge....；M＝Mo，W...，1，2，3，4，5或6)和(C₁₀H₁₈N)m LnW₁₀O₃₆·nH₂O(Ln为镧系元素，m为1～9自然数)所表示的，其中C₁₀H₁₈N为质子化的金刚烷胺。吗啉胍与上述多阴离子自组装形成的超分子化合物是以通式(C₆H₁₄N₅O)mXM₁₂O₄₀·nH₂O(X＝P，As，Si，Ge....；M＝Mo，W...；m＝1，2，3，4或5)、(C₆H₁₄N₅O)mX₂M₁₈O₆₂·nH₂O(X＝P，As，Si，Ge....；M＝Mo，W...，1，2，3，4，5或6)和(C₆H₁₄N₅O)LnW₁₀O₃₆·nH₂O(Ln为镧系元素，m为1～9自然数)所表示的，其中C₆H₁₄N₅O为质子化的吗啉胍。氟脲嘧啶与上述多阴离子自组装形成的超分子化合物是以通式(C₄H₅N₃OF)mXM₁₂O₄₀·nH₂O(X＝P，As，Si，Ge....；M＝Mo，W...；m＝1，2，3，4或5)、(C₄H₅N₃OF)mX₂M₁₈O₆₂·nH₂O(X＝P，As，Si，Ge....；M＝Mo，W...，1，2，3，4，5或6)和(C₄H₅N₃OF)mLnW₁₀O₃₆·nH₂O(Ln为镧系元素，m为1～9自然数)所表示的，其中C₄H₅N₃OF为质子化的氟脲嘧啶。异烟肼与上述多阴离子自组装形成的超分子化合物是以通式(C₆H₈N₃O)mXM₁₂O₄₀·nH₂O(X＝P，As，Si，Ge....；M＝Mo，W...；m＝1，2，3，4或5)、(C₆H₈N₃O)mX₂M₁₈O₆₂·nH₂O(X＝P，As，Si，Ge....；M＝Mo，W...，1，2，3，4，5或6)和(C₆H₈N₃O)mLnW₁₀O₃₆·nH₂O(Ln为镧系元素，m为1～9自然数)所表示的，其中C₆H₈N₃O为质子化的异烟肼。

通过这些多阴离子与金刚烷胺、吗啉胍、5-Fu(5-Fc)及异烟肼等自组装超分子化合物结构有如下特征：

1 这些有机分子，如金刚烷、吗啉胍、5-Fu(5-Fc)及异烟肼等在自组装超分子化合物中一般以质子化形式存在。

2 质子化的金刚烷、吗啉胍、5-Fu(5-Fc)及异烟肼等与多阴离子间以静电力和分子间力结合(氢键)。

3 自组装化合物中，一般金刚烷、吗啉胍、5-Fu(5-Fc)及异烟肼等及多阴离子结构保持不变。

4 这些自组装化合物中常常含有一些溶剂分子，如水等。

上述这些多阴离子与金刚烷胺、吗啉胍、5-Fu(5-Fc)及异烟肼等自组装化合物对耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)显示强的抑制活性。

抗耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)的多酸化合物的制备方法：首先将一定质量含有氨基或给电子集团的有机化合物，如金刚烷胺，吗啉胍，氟脲嘧啶及异烟肼等用稀酸(如盐酸)溶液酸化到pH为3~6，之后滴加到含有一定质量(按化学计量比确定)的Keggin型、Dowson型及LnW₁₀O₃₆^n-(Ln为镧系元素，n为自然数，代表阴离子所带的电荷数)型多金属氧酸盐的水溶液中，搅拌反应，生成大量沉淀(异烟肼的水溶液加入多金属氧酸盐的水溶液中不立即生成沉淀，放置一段时间生成)，沉淀用水、乙醇洗涤，干燥，即得产品。

具体实施方式

合成实施例1

金刚烷胺与Keggin型磷钼酸自组装化合物[(C₁₀H₁₈N)₃PMo₁₂O₄₀·nH₂O]的合成：将金刚烷胺100g溶于200ml水，稀盐酸酸化到pH约为6，在不断搅拌条件下逐滴加入到含有402g(0.33moL)磷钼酸(H₃PMo₁₂O₄₀)水溶液中。随着金刚烷胺的加入，溶液逐渐变浑浊最后产生大量沉淀。继续搅拌1h使反应进行完全，抽滤分离沉淀，用蒸馏水洗两次，再用乙醇洗涤，空气中干燥，得到黄色的粉末为(C₁₀H₁₈N)₃PMo₁₂O₄₀·nH₂O。以金刚烷胺计算产率85％。

合成实施例2

金刚烷胺与Dowson型砷钼酸自组装化合物(C₁₀H₁₈N)₆As₂Mo₁₈O₆₂·nH₂O。的合成：将100g金刚烷胺溶于200 ml水，稀盐酸酸化到pH约为6，搅拌下将其逐滴加入到按化学计量比确定的砷钼酸的水溶液中，生成大量沉淀，抽滤分离沉淀，用蒸馏水洗两次，再用乙醇洗涤，空气中干燥，得到黄色的粉末为(C₁₀H₁₈N)₆As₂Mo₁₈O₆₂·nH₂O。以金刚烷胺计算产率88％。

合成实施例3

金刚烷胺与LnW₁₀O₃₆^n-(Ln为镧系元素，n为自然数，代表阴离子所带的电荷数)的自组装化合物(C₁₀H₁₈N)₉PrW₁₀O₃₆·nH₂O的合成：100g金刚烷胺溶于200ml水，稀盐酸酸化到pH约为6，搅拌下将其逐滴加入到按化学计量比确定的Na₇H₂PrW₁₀O₃₆(合成方法见文献Shiozaki，R；Inagaki，A；Nishiro，A；Nishio，E；Maekawa，M；Kominami，H；Kera，Y.Journal ofAlloys and Compounds，1996，234，193-198.)的水溶液中，生成大量沉淀，抽滤分离沉淀，用蒸馏水洗两次，再用乙醇洗涤，空气中干燥，得到淡绿色粉末为(C₁₀H₁₈N)₉PrW₁₀O₃₆·nH₂O，以金刚烷胺计算产率90％。

合成实施例4

吗啉胍与Keggin型硅钨酸自组装超分子化合物[(C₆H₁₄N₅O)₄SiW₁₂O₄₀·nH₂O]的合成：100g吗啉胍溶于200mL蒸馏水中，搅拌溶解，用盐酸酸化到pH约为3～4，将其逐滴滴加到一定质量(按化学计量比确定)的H₄SiW₁₂O₄₀水溶液中，有沉淀生成，直到不再生成沉淀为止，过滤，用水、乙醇洗涤，干燥，得白色粉末，为(C₆H₁₄N₅O)₄SiW₁₂O₄₀·nH₂O。以硅钨酸计算产率为78％。

合成实施例5

吗啉胍与Dowson型磷钨酸自组装化合物(C₆H₁₄N₅O)₆P₂W₁₈O₆₂·nH₂O的合成：100g吗啉胍溶于200mL蒸馏水中，搅拌溶解，用盐酸酸化到pH约为3～4，将其逐滴滴加到一定质量(按化学计量比确定)的Dowson型磷钨酸(H₆P₂W₁₈O₆₂)溶液中，有沉淀生成，直到不再生成沉淀为止，过滤，用水、乙醇洗涤，干燥，得白色粉末，为(C₁₀H₁₈N)₆P₂W₁₈O₆₂·nH₂O。以Dowson型磷钨酸(H₆P₂W₁₈O₆₂)计算产率为72％。

合成实施例6

吗啉胍与LnW₁₀O₃₆^n-(Ln为镧系元素，n为自然数，代表阴离子所带的电荷数)的自组装化合物(C₆H₁₄N₅O)₉PrW₁₀O₃₆·nH₂O的合成：100g(0.66moL)吗啉胍溶于200ml水，用盐酸酸化到pH约为3～4，将其逐滴加入到一定质量(按化学计量比确定)的Na₇H₂PrW₁₀O₃₆(合成方法见文献Shiozaki，R；Inagaki，A；Nishiro，A；Nishio，E；Maekawa，M；Kominami，H；Kera，Y.Journal of Alloys and Compounds，1996，234，193-198.)的水溶液中，生成大量沉淀，抽滤分离沉淀，用蒸馏水洗两次，再用乙醇洗涤，空气中干燥，得到淡绿色粉末为(C₆H₁₄N₅O)₉PrW₁₀O₃₆·nH₂O，以吗啉胍计算产率90％。

合成实施例7

异烟肼与Keggin型硅钨酸自组装超分子化合物(C₆H₈N₃O)₄SiW₁₂O₄₀·nH₂O的合成：100g异烟肼溶于250mL蒸馏水中，搅拌溶解，用盐酸酸化到pH约为5，将其逐滴加入到一定质量(按化学计量比确定)的H₄SiW₁₂O₄0水溶液中，有沉淀生成，直到不再生成沉淀为止，过滤，用水、乙醇洗涤，干燥，得白色粉末，为(C₆H₈N₃O)₄SiW₁₂O₄₀·nH₂O。以硅钨酸计算产率为70％。

合成实施例8

异烟肼与Dowson型磷钨酸自组装化合物(C₆H₈N₃O)₆P₂W₁₈O₆₂·nH₂O的合成：100g异烟肼溶于250mL蒸馏水中，搅拌溶解，用盐酸酸化到pH约为5，将其逐滴加入到一定质量(按化学计量比确定)的Dowson型磷钨酸(H₆P₂W₁₈O₆₂)溶液中，有沉淀生成，直到不再生成沉淀为止，过滤，用水、乙醇洗涤，干燥，得白色粉末，为(C₆H₈N₃O)₆P₂W₁₈O₆2·nH₂O。以Dowson型磷钨酸(H₆P₂W₁₈O₆₂)计算产率为69％。

合成实施例9

异烟肼与稀土铈的杂多化合物[(C₆H₈N₃O)₉PrW₁₀O₃₆·nH₂O]的合成：100gg异烟肼溶于250mL蒸馏水中，搅拌溶解，用盐酸酸化到pH约为5.6，将其逐滴加入到一定质量(按化学计量比确定)的Na₇H₂PrW₁₀O₃₆(合成方法见文献Shiozaki，R；Inagaki，A；Nishiro，A；Nishio，E；Maekawa，M；Kominami，H；Kera，Y.Journal of Alloys and Compounds，1996，234，193-198.)的水溶液中，生成大量沉淀，用蒸馏水洗两次，再用乙醇洗涤，空气中干燥，得产物(C₆H₈N₃O)₉PrW₁₀O₃₆·nH₂O。以异烟肼计算产率为76％。

合成实施例10

氟脲嘧啶与Keggin型硅钨酸自组装超分子化合物(C₄H₅N₃OF)₄SiW₁₂O₄₀·nH₂O的合成：100克的氟脲嘧啶溶于300mL水，用稀盐酸酸化到pH约为5，将其滴加到一定量(按化学计量比确定)的H₄SiW₁₂O₄₀水溶液中，将会得到大量沉淀，直到继续滴加氟脲嘧啶水溶液不再生成沉淀为止，收集沉淀，乙醇洗涤，干燥，得白色粉末，为(C₄H₅N₃OF)₄SiW₁₂O₄₀·nH₂O。以硅钨酸计算产率为70％。

合成实施例11

氟脲嘧啶与Dowson型磷钨酸自组装化合物(C₄H₅N₃OF)₆P₂W₁₈O₆₂·nH₂O的合成：100克氟脲嘧啶溶于300mL水，用稀盐酸酸化到pH约为5，将其滴加到一定量(按化学计量比确定)的Dowson型磷钨酸(H₆P₂W₁₈O₆₂)水溶液中，将会得到大量沉淀，直到继续滴加氟脲嘧啶水溶液不再生成沉淀为止，收集沉淀，乙醇洗涤，干燥，得到化学式为(C₄FH₅N₃O)₆P₂W₁₈O₆₂·nH₂O的白色粉末。以H₆P₂W₁₈O₆₂计算产率为65％。

合成实施例12

氟脲嘧啶与稀土镨的杂多化合物[(C₆H₈N₃O)₉CeW₁₀O₃₆·nH₂O]的合成：100克氟脲嘧啶溶于300mL水，用稀盐酸酸化到pH约为5，将其滴加到一定量(按化学计量比确定)的Na₇H₂PrW₁₀O₃₆(合成方法见文献Shiozaki，R；Inagaki，A；Nishiro，A；Nishio，E；Maekawa，M；Kominami，H；Kera，Y.Journal of Alloys and Compounds，1996，234，193-198.)的水溶液中，生成大量沉淀，用蒸馏水洗两次，再用乙醇洗涤，空气中干燥，得产物(C₄H₅N₃OF)₉PrW₁₀O₃₆·nH₂O。以氟脲嘧啶计算产率76％。

抗菌活性实验方法及结果

实验方法

实验所用菌株均为标准菌株，购自中国药品生物制品检定所。

最小抑菌浓度(MIC)通过试管稀释法测定。在营养肉汤中采用二倍稀释法配制浓度为256-0.125μg·mL^-1的化合物。向每个管中加入被测菌株至最终接种浓度达到5×10⁵CFU/mL。对肺炎链球菌的试管，需补充5％脱纤维马血。培养基37℃孵育24h。化合物的MIC定义为孵育时间内没有可观察到的细菌生长的化合物的最低浓度。

体外细胞毒性实验通过在微孔板上的HeLa细胞生长确定。Hela细胞用含有10％胎牛血清及抗生素的RPMI-1640全培养基在5％CO₂，37℃条件下培养。对数生长期细胞用Tripan蓝排染。向96孔培养板中每孔加入90μL细胞，每孔再加纯化的溶于DMSO中的测试样品的体积为10μL，使之总体积为100μL，调细胞浓度为每孔含5×10³个细胞，于CO₂培养箱中培养48h后从井中除去介质。MTT制成5mg·mL^-1储备液0.15M PBS缓冲溶液通过0.22μm过滤器过滤，并在含抗生素的RMPI-1640中稀释为1mg·mL^-1。每井加入200微升上述溶液并孵育4h。所有未转化的MTT(介质)从井中仔细吸出。兰色formazan晶体溶解在100μLisopropanol-1N HCl(24∶1)中。振荡孔板确保兰色formazan晶体溶解，在DG3022酶联免疫检测仪上测定光密度值(OD)，取波长560nm，参考波长为690nm，溶剂做对照。

肺炎链球菌在1mL Todd-Hewitt肉汤中孵育到指数级生长并同各种浓度的化合物共同培养30min。然后在每种细胞的悬浊液中加入放射性前驱体(37kBq[³H]胸苷，27.75kBq[³H]尿苷，148kBq[³H]亮氨酸，111kBqN-乙酰葡萄糖胺)，37℃反应10min后，通过加入5％三氯乙酰酸(TCA)终止反应。TCA不溶部分用玻璃漏斗真空过滤，连续用5％TCA和95％乙醇洗。空气干燥过滤器，放射性残留物用Beckman LS6500液体闪烁记数仪记数。

结  果

1 抗菌活性

金刚烷胺、吗啉胍、氟脲嘧啶及异烟肼与多金属氧酸盐自组装化合物对肺炎链球菌(Molecular formula)和耐青霉素肺炎链球菌(Penicilline Resistant Streptococcus Pneumoniae，PRSP)的抑制活性，以临床有效药物氨苄青霉素(Ampicillin)为对照，得到的结果见表1。可见，一些含有金刚烷胺、吗啉胍、5-Fu(5-Fc)及异烟肼的多金属氧酸盐对肺炎链球菌和耐青霉素肺炎链球菌有强的抑制活性，其最小抑菌范围低于对照药物氨苄青霉素。

  表1多金属氧酸盐对肺炎链球菌及其耐青霉素肺炎链球菌的抑菌活性

 分子式*        MIC(μM·mL) 肺炎链球菌     耐青霉素肺炎链球菌 含有金刚烷胺的多金属氧酸盐 1  (C₁₀H₁₈N)₄SiMo₁₂O₄₀ 2  (C₁₀H₁₈N)₃PMo₁₂O₄₀ 3  (C₁₀H₁₈N)₄SiW₁₂O₄₀ 4  (C₁₀H₁₈N)₆As₂Mo₁₈O₆₂ 5  (C₁₀H₁₈N)₆P₂W₁₈O₆₂ 6  (C₁₀H₁₈N)₉PrW₁₀O₃₆    含有吗啉胍的多酸盐 7  (C₆H₁₄N₅O)₄SiMo₁₂O₄₀ 8  (C₆H₁₄N₅O)₄SiW₁₂O₄₀ 9  (C₆H₁₄N₅O)₆P₂W₁₈O₆₂ 10 (C₆H₁₄N₅O)₉PrW₁₀O₃₆    含有氟脲嘧啶的多酸盐 11 (C₄H₅N₃OF)₄SiMo₁₂O₄₀ 12 (C₄H₅N₃OF)₄SiW₁₂O₄₀ 13 (C₄H₅N₃OF)₆P₂W₁₈O₆₂ 14 (C₄H₅N₃OF)₉PrW₁₀O₃₆    含有异烟肼的多酸盐  2.6-16.8       3.2-18.5 4.5-32.7       6.7-22.3 1.8-8.9        3.9-12.6 8.0-32.6       8.9-42.0 4.3-16.4       4.2-18.6 1.0-16.7       2.2-18.4  8.6-64.2       7.9-45.8 16.9-32.3      19.4-55.0 8.3-32.2       9.3-50.4 4.5-32.9       7.8-35.6  64.6-128.2     ＞200 4.1-32.5       4.8-56.8 2.2-16.9       3.1-35.7 2.8-32.1       3.8-40.8

 15  (C₆H₈N₃O)₄SiMo₁₂O₄₀ 16  (C₆H₈N₃O)₄SiW₁₂O₄₀ 17  (C₆H₈N₃O)₆P₂W₁₈O₆₂ 18  (C₆H₈N₃O)₉PrW₁₀O₃₆     对照药物 19  Ampicillin ＞128       ＞200 4.6-64.5    ＞200 4.6-64.7    5.9-45.8 4.2-32.8    6.0-59.9  3.7-64.9    7.8-67.3

*表中化合物均略去了结晶水

2细胞毒性

以3个典型的化合物(C₁₀H₁₈N)₆As₂Mo₁₈O₆₂·nH₂O(化合物4)、(C₆H₁₄N₅O)₄SiW₁₂O₄₀(化合物8)和(C₄H₅N₃OF)₉PrW₁₀O₃₆(化合物14)为例，探讨了上述化合物的细胞毒性和抗菌活性机理。

用不同浓度的(C₁₀H₁₈N)₆As₂Mo₁₈O₆₂·nH₂O(化合物4)、(C₆H₁₄N₅O)₄SiW₁₂O₄₀(化合物8)和(C₄H₅N₃OF)₉PrW₁₀O₃₆(化合物14)处理HeLa细胞后，观察形态变化，发现低浓度(＜12.5nmol·mL^-1)时，化合物4、8和14处理后HeLa细胞形态没有发生明显变化，说明低浓度时化合物的毒性很小。对化合物4和14，当浓度大于12.5nmol·mL^-1时，随着浓度的增加对HeLa细胞的毒性也逐渐增加，而化合物8，当浓度范围是12.5-100nmol·mL^-1时，对HeLa细胞的毒性不随浓度增加而发生明显变化。

3.作用机理探讨

化合物4[(C₁₀H₁₈N)₆As₂Mo₁₈O₆₂]、8[(C₆H₁₄N₅O)₄SiW₁₂O₄₀]和14[(C₄H₅N₃OF)₉PrW₁₀O₃₆]对肺炎链球菌细胞生物合成DNA，RNA蛋白质及细胞壁合成的影响，通过检验放射性胸苷、尿苷、亮氨酸及N-乙酰葡萄糖胺掺入肺炎链球菌细胞来确定。化合物4、8和14对葡萄糖掺入肺炎链球菌细胞的影响也被检验。如表2所示，化合物4、8和14非选择性抑制胸苷、尿苷、亮氨酸及葡萄糖掺入肺炎链球菌细胞，其IC₅₀范围是0.08-0.32nmol·mL^-1，接近于化合物的MIC值。而化合物4、8和14对N-乙酰葡萄糖胺掺入细胞抑制的IC₅₀则为1.28-2.56nmol·mL^-1。ICP分析用化合物4、8和14处理30min后的肺炎链球菌细胞，结果表明有大量K⁺从细胞中流出。这些结果暗示多金属氧酸盐化合物在细胞膜上底物和离子交换的部位发挥抗菌活性。

                表2  化合物对葡萄糖掺入肺炎链球菌细胞的影响

                              IC₅₀(nmol·mL^-1)

        Thymidine   Uridine     Leucine     Glucose     N-Acetylglucosamine

4       0.32        0.32        0.16        0.32        2.56

8       0.08        0.16        0.32        0.08        1.28

14      0.32        0.08        0.16        0.16        2.56