利用大豆制品发酵生产大豆肽液体食品及益菌片的方法

摘要

利用大豆制品发酵生产大豆肽液体食品及益菌片的方法，属于食用纳豆杆菌发酵大豆制品，生产大豆肽液体食品及益菌片的方法。本发明解决了菌种安全差、目前益生菌发酵能力低及培养基成本高等问题。它以能产纳豆激酶的纳豆杆菌为菌种，以大豆豆粉、大豆豆饼、大豆豆粕或大豆豆浆为培养基，经发酵、分离后，加入辅料，制成含有纳豆激酶的保健型大豆肽、低聚肽、短肽混合物的液体食品和富含纳豆杆菌及大豆纤维蛋白的益菌片。本发明提供了一种营养丰富、风味独特的保健食品。它可广泛地用于医药、食品、饲料添加剂等诸多领域；并且制备工艺简单、周期短、成本低、适合工业化生产，为蛋白肽工业发展提供有效途径；具有较大的经济效益和社会效益。

说明书

技术领域

本发明属于利用大豆制品发酵生产大豆肽液体食品及益菌片的方法，特别涉及一种采用纳豆杆菌为菌种，以大豆豆粉、大豆豆饼、大豆豆粕或大豆豆浆为培养基，发酵生产大豆肽液体食品及益菌片的制作方法。

技术背景：

大豆肽液体食品及纳豆杆菌益菌片是新兴的优质保健食品。大豆肽的蛋白质含量为85％左右，其氨基酸组成几乎完全与大豆蛋白质相同。但与大豆蛋白相比，大豆肽具有更好的理化性质如易消化吸收、低抗原性、增强人体免疫能力等，且含有某些生理活性物质在机体内有多种生理功能。大豆蛋白活性肽等于将部分人体完成困难的消化过程拿到体外进行，是新兴的营养保健源，国际上对大豆肽的研究始于70年代，其中美国和日本都处在发展大豆肽生产和利用的前列。我国近几年研究逐步活跃起来，大豆肽生产得到迅猛发展。目前，大豆肽常用酶解的方法来制备。但酶解选择性较强，水解率偏低，水解物存在苦味，不易被人接受，且不具有纤溶活性。

益生菌片是应用有益菌，将其培养增殖、浓缩干燥制成菌剂。合格的益生菌应具有以下两个特点，即含有活的微生物以及能通过口腔、胃肠道内发挥作用而改善宿主健康。对菌种基本要求是高安全性，无毒，无致残，无致病，无耐药性、无药残等副作用；必须是活的有益菌，在培养中及生物体内易增殖，加工处理后尚有高存活率；对酸、碱、胆汁有耐受性，可避免防霉剂、抗氧化剂和饲料加工过程以及动物肠道内胃酸、胆汁的影响；在肠道中定植能力好，生长速度快；能产生乳酸或其它抗菌活性物质。目前益菌片往往存在着生产菌种未经过严格的病理和毒理试验，长期使用有耐药性、“三致”等毒副作用；有些有益菌在培养中及生物体内不易增殖，加工处理后存活率低，质量得不到保证。

目前，大豆肽的生产方法主要有：微生物发酵法、酶解法、化学方法三种，其中以微生物发酵法最为先进，它可以在生产肽的同时修饰肽的苦味因子，同时，微生物将原料中的抗营养因子(如KTI和BBI)降解，有效消除这两种影响消化和口味的成分。但也存在一些问题，如所采用的菌种产酶种类少且酶活力低，发酵能力差，生产力水平低，只能采用较精细原料进行发酵，而且发酵产物未得到综合利用，只利用发酵液中一部分，造成产品价格高。综上所述，发酵能力低及生产成本高是影响发酵法生产大豆肽及推广应用关键。为此，研究和开发一种经济实用的生产方法是当务之急。

发明内容

针对上述问题，本发明解决了菌种安全差、发酵能力低及所用原料造价成本高问题，提供了利用纳豆杆菌为菌种，以大豆制品为培养基生产大豆肽液体食品和纳豆杆菌益菌片，并使所得到的益菌片安全性好、活菌数高，肽液体食品具有纤溶活性。

技术方案：

发酵生产大豆肽液体食品及益菌片的方法，其特征是采用纳豆杆菌(Bacillus natto，中国工业微生物菌种保藏中心AS 1.107)为生产菌株，发酵培养基主要以大豆豆粉、大豆豆粕、大豆饼粉或大豆豆浆为原料，经过种子培养，发酵培养，离心或过滤，干燥工艺，得到具有大豆肽液体食品和固体纳豆杆菌益菌片，具体步骤如下：

(一)制备发酵液

·菌种的制备

纳豆杆菌在琼脂斜面上35-37℃培养18-24小时后，4℃冰箱保存待用。斜面培养基灭菌条件110-125℃，15-20分钟；

其中斜面培养基为：牛肉膏    5.0-10.0g

                  蛋白胨    10.0-20.0g

                  氯化钠    5.0-10.0g

                  琼脂      18.0-20.0g

                  水        1000ml

                  pH        7.0-7.2

·种子培养

将在斜面培养基培养好的菌种接一环加入到种子培养基中，种子培养基灭菌条件110-125℃，15-20分钟；在摇床上200rpm转速下，35-37℃振荡培养20-28小时后，即可得到适合接种的种子培养物。

其中种子培养基为：蛋白胨    10.0-15.0g

                  葡萄糖    20.0-30.0g

                  K₂HPO₄ 1.0-1.5g

                  MgSO₄    0.5-0.75g

                  水        1000ml

                  pH        7.0-7.2

·发酵培养

将上述种子培养物以2％-5％(体积比，ml/ml)的接种量接种于经灭菌处理的新鲜发酵培养基，30-40℃培养60-72小时进行深层液体发酵。在发酵过程中，应控制pH值在6.0-8.0；发酵期间pH的调节，视发酵液pH的具体情况，并根据发酵需要，通过流加酸或碱溶液实现。溶氧通过控制通风量调节，溶氧应控制在20-40％。

发酵结束时检查芽孢生成率，要求芽孢生成率达70％以上。

需要说明的是：

调节pH值方法是初始pH的调节可以通过添加浓度为1.0-2.5％磷酸缓冲液实现。发酵期间pH的调节，所用酸液如磷酸溶液，所用碱液如氨水或尿素。当发酵至48小时可将pH调至6.0-6.3或7.7-8.0刺激芽孢产生。

当发酵至48小时后，可降低溶氧，控制溶氧在20-30％以便刺激芽孢的产生。

当发酵48小时后，可降低温度刺激芽孢产生，将温度控制在25-32℃，不仅可促进芽孢产生，还有利于保持纳豆激酶的稳定性，使其不被降解。

当发酵培养基采用大豆饼粉为原料时，其配方是：大豆饼粉20-80g、葡萄糖20-40g、MgSO₄ 0.5-1.0g、Na₂HPO₄ 6.0-12.0g、NaH₂PO₄ 1.0-2.0g、CaCl₂ 0.2-0.4g、1000ml水pH7.0-7.2。

当发酵培养基采用大豆豆粉为原料时，其配方是：大豆豆粉20-80g、葡萄糖20-40g、MgSO₄ 0.5-1.0g、Na₂HPO₄ 6.0-12.0g、NaH₂PO₄ 1.0-2.0g、CaCl₂ 0.2-0.4g、1000ml水、pH7.0-7.2。

当发酵培养基采用大豆豆粕为原料时，其配方是：大豆豆粕20-80g、葡萄糖20-40g、MgSO₄ 0.5-1.0g、Na₂HPO₄ 6.0-12.0g、NaH₂PO₄ 1.0-2.0g、CaCl₂ 0.2-0.4g、1000ml水、pH7.0-7.2。

当发酵培养基采用大豆豆浆为原料时，其配方是：大豆豆浆125-250ml、葡萄糖20-40g、MgSO₄ 0.5-1.0g、Na₂HPO₄ 6.0-12.0g、NaH₂PO₄ 1.0-2.0g、CaCl₂ 0.2-0.4g、用水补足到1000ml、pH7.0-7.2。

上述大豆饼粉、大豆豆粉、大豆豆粕必须磨细，过80-120目筛待用，发酵培养基采取115-125℃，15-25分钟灭菌。

(二)制备大豆肽液体食品和益菌片

·固液分离

发酵结束后，经无菌试验确定无污染杂菌后，采用了冷冻离心法、膜过滤法或离心过滤法中一种或两种联合使用进行固液分离。采用膜过滤法分离固液时，尽量减少发酵液中悬浮物透过膜。采用重力离心处理时，检测离心上清液活菌数，选择转速应大于5000r/min，使发酵液中悬浮物离心下来，离心过滤法处理时，可将离心和过滤结合起来，在离心过程中同时完成过滤。

·制备大豆肽液体食品

澄清上清液，用纤维蛋白平板法测定液体中纳豆激酶酶活力，要求纳豆激酶含量达到100-500U/ml，大豆肽氨基酸含量为20-120g/L。检验合格后，添加少量食品添加剂调配成大豆肽液体食品；

注：纳豆激酶酶活力单位定义为：在37℃1min内分解1nmol溶解于0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.4)中的浓度5×10^-4mol/L的H-D-Val-Leu-Lys-Pna的纳豆激酶量为1U。或者以尿激酶或纤溶酶的活性单位来表示。

·制备益菌片

将分离得到菌泥进行活菌计数，采用冷冻真空干燥、流化床干燥、喷雾干燥或真空干燥法进行干燥，干燥后再次进行活菌计数，要求活菌损失不大于80-85％。加入赋形剂如淀粉、轻质碳酸纳等，充分搅拌后即可得纳豆杆菌益菌片。

有益效果：

本发明利用微生物发酵技术，依靠纳豆杆菌繁殖快，易培养，产芽孢，代谢能力强等优点，以低廉的原料作培养基，通过特定发酵工艺进行发酵控制，发酵液经固液分离后，离心液制成大豆肽液体食品，菌泥制成纳豆杆菌益生菌片，发酵产品得到综合利用。得到益菌片安全性好、活菌数高，而肽液体食品又具纤溶活性。

该生产方法所采用的菌种为纳豆杆菌，系属枯草芽孢杆菌一个变种，所以纳豆芽孢杆菌具有芽孢，因而能耐酸，耐碱，耐高温及耐挤压，在制粒过程及酸性胃环境中均能保持高度的稳定性；其具有抑制沙门氏菌、伤寒菌、痢疾菌及0157:H7大肠杆菌等致病菌作用；而且由于纳豆杆菌长期作为生产纳豆菌种，其具有高度安全性。由于豆类可诱导纳豆杆菌产生纳豆激酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、植酸酶等100种以上酶，所以纳豆杆菌利用豆饼、豆粕、豆粉、豆浆等廉价原料进行发酵时具有较高发酵能力，不仅解决发酵法生产大豆肽所存在的成本高问题，而且是大豆肽液体食品中还富含大量的纳豆激酶，以致使大豆肽液体食品具有抗胆固醇、抗血栓形成，同时具有强烈体外和体内纤溶活性双重功效，使本发明提供了一种营养丰富、容易吸收的保健食品，可广泛用于医药、食品、饲料添加剂等诸多领域，有着诱人的经济前景；而且该制备方法工艺简单，周期短，成本低，适合工业化生产。从而为蛋白肽工业发展提供有效途径，具有较大经济效益和社会效益。

具体实施方式

实施例1：

(一)制备发酵液

·菌种的制备

生产菌种为纳豆杆菌(Bacillus natto，AS 1.107)。将纳豆杆菌在琼脂斜面上37℃培养18小时后，镜检，菌体生长良好，4℃冰箱保存待用。斜面培养基灭菌条件110℃，20分钟。

其中斜面培养基为：牛肉膏    5.0g

                  蛋白胨    10.0g

                  氯化钠    5.0g

                  琼脂      18.0g

                  水        1000ml

                  pH        7.0-7.2

·种子培养

将在斜面培养基培养好的菌种接一环加入到种子培养基中，种子培养基灭菌条件110℃，20分钟；在摇床上200rpm转速下，37℃振荡培养20小时后，得到适合接种的种子培养物。

其中种子培养基为：蛋白胨    10.0g

                  葡萄糖    20.0g

                  K₂HPO₄ 1.0g

                  MgSO₄    0.5g

                  水        1000ml

                  pH        7.0-7.2

·发酵培养

将种子培养物以2％的接种量接种于新鲜发酵培养基，40℃培养60小时进行深层液体发酵。在发酵过程中，应控制pH值在6.0-8.0。调节pH值办法是：初始pH的调节可以通过添加浓度为1.0％磷酸缓冲液实现；发酵期间pH的调节，视发酵液pH的具体情况，并根据发酵需要，通过流加酸或碱溶液实现。所用酸为磷酸溶液，所用碱为氨水。溶氧通过控制通风量调节，溶氧应控制在20-40％，芽孢生成率达70％。

其中发酵培养基为：大豆饼粉    20g

                  葡萄糖      20g

                  MgSO₄      0.5g

                  Na₂HPO₄  6.0g

                  NaH₂PO₄  1.0g

                  CaCl₂      0.2g

                  水          1000ml

                  pH          7.0-7.2

大豆饼粉必须磨细，过100目筛待用。发酵培养基采取115℃，25分钟灭菌。

(二)大豆肽液体食品和益菌片

·固液分离

发酵结束后，经无菌试验确定无污染杂菌后，采用了冷冻离心法进行固液分离，4℃下5000r/min离心15分钟。

·制备大豆肽液体食品

澄清上清液，用纤维蛋白平板法测定液体中纳豆激酶酶活力。用氨基酸测定仪测定溶液中大豆肽氨基酸含量。纳豆激酶含量为250U/ml，大豆肽氨基酸含量为6g/L。检验合格后，添加少量蛋白糖和柠檬酸调配成大豆肽液体食品。

·制备益菌片

将分离得到菌泥进行活菌计数，采用冷冻真空干燥后再次进行活菌计数，活菌损失不大于80％。其加入赋形剂淀粉，充分搅拌后即可得纳豆杆菌益菌片。该益菌片活菌数达到1.1亿个/g。

实施例2：

菌种的制备时，将纳豆杆菌在琼脂斜面上36℃培养2Q小时，斜面培养基灭菌条件为125℃，15分钟。

其中斜面培养基为：牛肉膏    10.0g

                  蛋白胨    20.0g

                  氯化钠    10.0g

                  琼脂      20.0g

                  水        1000ml

                  pH        7.0-7.2

种子培养时，种子培养基灭菌条件125℃，15分钟；36℃培养24小时。

其中种子培养基为：蛋白胨    15.0g

                  葡萄糖    30.0g

                  K₂HPO₄ 1.5g

                  MgSO₄    0.75g

                  水        1000ml

                  pH        7.0-7.2

将种子培养物以4％的接种量接种于经120℃，20分钟灭菌处理的新鲜发酵培养基，35℃培养66小时进行深层液体发酵。  初始pH的调节可以通过添加浓度为1.8％磷酸缓冲液实现。发酵至48小时将pH升高到7.7-8.0。

其中发酵培养基：大豆饼粉    50g

                葡萄糖     30g

                MgSO₄     0.7g

                Na₂HPO₄ 9.0g

                NaH₂PO₄ 1.5g

                CaCl₂     0.3g

                水         1000ml

                pH         7.0-7.2

发酵培养基采取120℃，20分钟灭菌。赋形剂采用轻质碳酸纳。其他同实施例1。

测定液体中纳豆激酶酶活力为200U/ml，大豆肽氨基酸含量为7g/L重量，纳豆杆菌益菌片活菌数达到1.5亿个/g。

实施例3：

菌种的制备时，将纳豆杆菌在琼脂斜面上35℃培养24小时。斜面培养基灭菌条件为115℃，18分钟。

其中斜面培养基：牛肉膏    7.5g

                蛋白胨    15g

                氯化钠    7.5g

                琼脂      19.0g

                水        1000ml

                pH        7.0-7.2

种子培养时，种子培养基灭菌条件125℃，15分钟；35℃培养20小时。

其中种子培养基：蛋白胨    12.5g

                葡萄糖    25.0g

                K₂HPO₄ 1.3g

                MgSO₄    0.6g

                水        1000ml

                pH        7.0-7.2

将种子培养物以5％的接种量接种于经灭菌处理的新鲜发酵培养基，30℃培养72小时进行深层液体发酵。初始pH的调节可以通过添加浓度为2.5％磷酸缓冲液实现。发酵至48小时可降低溶氧，控制溶氧在20-30％以便刺激芽孢的产生。

其中发酵培养基：大豆饼粉   80g

                葡萄糖     40g

                MgSO₄     1.0g

             Na₂HPO₄  12.0g

             NaH₂PO₄  2.0g

             CaCl₂      0.4g

             水          1000ml

             pH          7.0-7.2

发酵培养基采取125℃，15分钟灭菌。发酵结束后，经无菌试验确定无污染杂菌后，采用了膜过滤法进行固液分离，其他同实施例1。

测定液体中纳豆激酶酶活力为300U/ml，大豆肽氨基酸含量为10g/L重量，益菌片活菌数达到1.2亿个/g。

实施例4：

发酵培养基：大豆豆粕    20g

            葡萄糖      20g

            MgSO₄      0.5g

            Na₂HPO₄  6.0g

            NaH₂PO₄  1.0g

            CaCl₂      0.2g

            水          1000ml

            pH          7.0-7.2

大豆豆粕必须磨细，过100目筛待用。

发酵至48小时后，将pH调至7.7-8.0；降低溶氧，控制溶氧在20-30％以便刺激芽孢的产生，降低温度至25℃。其他同实施例1。

测定液体中纳豆激酶酶活力为430U/ml，大豆肽氨基酸含量为7g/L重量，益菌片活菌数达到1.3亿个/g。

实施例5：

发酵培养基：大豆豆粕    50g

            葡萄糖      30g

            MgSO₄      0.7g

            Na₂HPO₄  9.0g

            NaH₂PO₄  1.5g

            CaCl₂      0.3g

            水          1000ml

            pH          7.0-7.2

大豆豆粕必须磨细，过100目筛待用。

发酵至48小时可将pH调至6.0-6.3刺激芽孢产生。其他同实施例1。

测定液体中纳豆激酶酶活力为360U/ml，大豆肽氨基酸含量为9g/L重量，益菌片活菌数达到1.1亿个/g。

实施例6：

发酵培养基：大豆豆粕       80g

            葡萄糖         40g

            MgSO₄         1.0g

            Na₂HPO₄     12.0g

            NaH₂PO₄     2.0g

            CaCl₂         0.4g

            水             1000ml

            pH             7.0-7.2

大豆豆粕必须磨细，过100目筛待用。

发酵至48小时可降低溶氧，控制溶氧在20-30％，同时将pH降低到6.0-6.3，以便刺激芽孢的产生。其他同实施例1。

测定液体中纳豆激酶酶活力为350U/ml，大豆肽氨基酸含量为6.5g/L重量，益菌片活菌数达到1.3亿个/g。

实施例7：

发酵培养基：大豆豆粉  20g

            葡萄糖    20g

            MgSO₄    0.5g

            Na₂HPO₄ 6.0g

            NaH₂PO₄ 1.0g

            CaCl₂    0.2g

            水        1000ml

            pH        7.0-7.2

大豆豆粉必须磨细，过100目筛待用。

发酵48小时后可降低温度刺激芽孢产生，将温度控制在28℃。其他同实施例1。

测定液体中纳豆激酶酶活力为450U/ml，大豆肽氨基酸含量为7.8g/L重量，益菌片活菌数达到1.1亿个/g。

实施例8：

发酵培养基：大豆豆粉    50g

            葡萄糖      30g

            MgSO₄      0.7g

            Na₂HPO₄   9.0g

            NaH₂PO₄   1.5g

            CaCl₂       0.3g

            水           1000ml

            pH           7.0-7.2

大豆豆粉必须磨细，过100目筛待用。

发酵至48小时可将pH调至6.0-6.3，控制溶氧在20-30％左右，将温度控制在28℃，其他同实施例1。

测定液体中纳豆激酶酶活力为500U/ml，大豆肽氨基酸含量为12g/L重量，益菌片活菌数达到1.5亿个/g。

实施例9：

发酵培养基：大豆豆粉   80g

            葡萄糖     40g

            MgSO₄     1.0g

            Na₂HPO₄ 12.0g

            NaH₂PO₄ 2.0g

            CaCl₂     0.4g

            水         1000ml

            pH         7.0-7.2

大豆豆粉必须磨细，过100目筛待用。

发酵至48小时后可将pH调至7.7-8.0；降低溶氧，控制溶氧在20-30％以便刺激芽孢的产生，降低温度至32℃。其他同实施例1。

测定液体中纳豆激酶酶活力为490U/ml，大豆肽氨基酸含量为8g/L重量，益菌片活菌数达到1.3亿个/g。

实施例10：

发酵培养基：大豆豆浆   125ml

            葡萄糖     20g

            MgSO₄     0.5g

            Na₂HPO₄ 6.0g

            NaH₂PO₄ 1.0g

            CaCl₂     0.2g

            用水补足到 1000ml

            pH         7.0-7.2

发酵至48小时后降低溶氧，控制溶氧在20-30％以便刺激芽孢的产生，降低温度至25℃。其他同实施例1。

测定液体中纳豆激酶酶活力为250U/ml，大豆肽氨基酸含量为7g/L重量，益菌片活菌数达到1.2亿个/g。

实施例11：

发酵培养基：大豆豆浆    180ml

            葡萄糖      30g

            MgSO₄      0.7g

            Na₂HPO₄  9.0g

            NaH₂PO₄  1.5g

            CaCl₂      0.3g

            用水补足到  1000ml

            pH          7.0-7.2

发酵至48小时后可将pH调至7.7-8.0，降低温度至28℃。其他同实施例1。

测定液体中纳豆激酶酶活力为500U/ml，大豆肽氨基酸含量为5g/L重量，益菌片活菌数达到1.4亿个/g。

实施例12：

发酵培养基：大豆豆浆    250ml

            葡萄糖      40g

            MgSO₄      1.0g

            Na₂HPO₄  12.0g

            NaH₂PO₄  2.0g

            CacL₂      0.4g

            用水补足到  1000ml

            pH          7.0-7.2

发酵至48小时后可将pH调至6.0-6.3，降低温度至32℃。其他同实施例1。

测定液体中纳豆激酶酶活力为480U/ml，大豆肽氨基酸含量为10g/L重量，益菌片活菌数达到1.4亿个/g。