由禽源性动物组织中制备胶原活性多肽的方法

摘要

本发明公开了一种由禽源性动物组织中制备胶原活性多肽的方法。以鸭脚为原料，用1.0～5.0％稀酸液对原料进行浸泡预处理，水洗后用60℃～85℃热水抽提4～10小时得到胶原明胶提取液，将提取液浓缩至胶原蛋白浓度为5～25％(w/w)，加酸调节pH值为0.5～4.0，65℃～90℃水解3～8小时，加碱液中和至pH为7.0～8.0，离心得到胶原活性多肽的水溶液，向多肽水溶液中加入有机溶剂，有机溶剂与胶原多肽水溶液的比例为3～5∶1(v/v)，充分搅拌后静置5～8小时，离心得多肽沉淀，经减压干燥，制得胶原活性多肽产品。本发明所用原料来源广泛易得，成本低、操作方便，条件温和、生产周期较短、产品收率高。

说明书

技术领域

本发明涉及生物产品制造技术领域，尤其涉及一种由禽源性动物组织中制备胶原活性多肽的方法。

背景技术

胶原蛋白在动物皮肤、软骨、骨骼、肌腱等组织中广泛存在，是一组蛋白，已发现有近20种。真皮中80～85％为胶原蛋白，主要是I、III型胶原蛋白，骨骼三分之一的有机物中，绝大部分是I型胶原蛋白。天然胶原蛋白分子由三股螺旋多肽链缠绕组成，螺旋间以氢键结合，分子量大。胶原蛋白中甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸含量异常丰富。将胶原蛋白进行水解，可得到较小分子量的胶原活性多肽，其水溶性增大，并保持了胶原蛋白的诸多优良性质，在医学美容、化妆品、组织修复、手术止血、医用胶囊、微胶囊、药用、食品工业等众多工业领域有重要应用。

通常，胶原蛋白由牛、猪等家畜的皮肤、肌腱和骨骼中提取。近几年，受世界范围内疯牛病、口蹄疫等家畜流行病的影响，畜源性胶原蛋白的安全性引起了普遍担忧。由禽源性动物皮肤、骨骼、肌腱等组织中提取胶原蛋白，成为获取天然胶原蛋白及其水解活性多肽的一条新途径。目前对禽源性胶原蛋白的提取研究很少，对其水解多肽制品的研究未见报道。美国专利US 5138030(1992)提出了用酶法和有机酸溶解方法从禽类组织中提取胶原蛋白的方法；美国专利US 0142368A1(2002)公开了以鸡、鹅等家禽皮、骨等组织为原料，在水介质中进行加热处理来直接提取胶原蛋白的方法；中国台湾D.C.Liu等在Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，14(11)：1638-1644，2001中报道了用酸溶液浸取从鸡脚中提取酸溶性胶原蛋白的方法。现有的禽源性胶原蛋白提取技术得到的是胶原明胶，分子量大，常温下水溶性差，而且明胶的纯度低，收率不高。

对禽源性胶原明胶进一步水解，可得到胶原多肽。目前针对禽源性胶原活性多肽的制备技术未见报道。对畜源性胶原蛋白的水解已是公知技术，主要有碱法、酶水解法(例如中国专利CN1403585A，2003)和酸法(例如美国专利US4130555，1978)。这些方法各有利弊：碱法易使蛋白质分子结构破坏和变性而失去活性，尤其是大部分胱氨酸和半胱氨酸会被破坏，降低了胶原蛋白水解多肽的营养价值；酶法操作条件温和，得到的产品属分子量较集中的单一产品，但需要的反应时间长，条件控制严格，使用的酶是一次性的，成本往往较高，且易因所用的生物酶难于纯化而使水解产物的分离困难；酸法水解迅速，可避免外消旋作用，减少水解多肽的损失，但得到的多肽分子量范围较大，控制条件要求严格。禽源性天然胶原蛋白与畜源性胶原蛋白的不同主要体现在其胶原间交联的紧密程度不同，禽源性胶原蛋白交联较弱(美国专利US 0142368A1)。因此，禽源性胶原蛋白水解为活性多肽时，需要的水解技术和条件与公知的畜源性胶原蛋白水解技术不同，有特殊性的一面，需要进行研究探索。

发明内容

本发明的目的是提供一种由禽源性动物组织中制备胶原活性多肽的方法。

以鸭脚为原料，用1.0～5.0％稀酸液对原料进行浸泡预处理，水洗后用60～85℃热水抽提4～10小时得到胶原明胶提取液，将提取液浓缩至胶原蛋白浓度为5～25％(w/w)，加酸调节pH值为0.5～4.0，65～90℃水解3～8小时，加碱液中和至pH为7.0～8.0，离心得到胶原活性多肽的水溶液，向多肽水溶液中加入有机溶剂，有机溶剂与胶原多肽水溶液的比例为3～5∶1(v/v)，充分搅拌后静置5～8小时，离心得多肽沉淀，经减压干燥，制得胶原活性多肽产品。

本发明的优点：(1)采用酸法水解，工艺简单迅速，成本低，且减少了水解多肽的损失，产品质量好；(2)采用有机溶剂沉淀法，既分离得到水解多肽产品，又同时实现去杂、去色和去味，提高了产品的质量；(3)产品的氨基酸含量高；(4)通过控制适宜的水解条件，使胶原蛋白大分子断裂为活性多肽，增加了胶原蛋白的水溶性，便于在化妆品、医药、食品等工业领域中应用

具体的实施方式

由禽源性动物组织中制备胶原活性多肽的方法，它的生产步骤如下：

(1)原料预处理与胶原明胶液的提取

取鸭脚即鸭掌、鸭蹼、鸭脚梗为原料，清洗干净，用稀酸液浸泡，水洗，然后用去离子水浸泡，所用酸为硫酸、盐酸、乙酸、柠檬酸中的一种或多种配成的混合物，浓度1.0～5.0％，浸泡时间为400～480小时，水洗后pH值为4.0～6.0，去离子水浸泡时间为12～24小时，将预处理好的原料加入去离子水，在温度60～85℃下进行抽提，得到胶原明胶液，抽提时间为4～10小时；

(2)胶原明胶液浓缩和酸法水解

将所得的胶原明胶液过滤，然后于50～70℃、0.095～0.099MPa下减压浓缩，使浓缩液中胶原蛋白的浓度为5～25％(w/w)，直接用酸法进行水解，所用的酸液为硫酸、盐酸、乙酸、柠檬酸、草酸中的一种或多种配成的混合物，调节pH值为0.5～4.0，水解温度为65～90℃，水解时间为3～8小时；

(3)水解液中和与有机溶剂沉淀

将水解液用碱液进行中和至pH为7.0～8.0，静置2～8小时，6000～8000rpm下离心15～20min，弃去沉淀，得到胶原多肽的水溶液，所用碱液为碳酸钠、碳酸氢钠、氨水、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种；向所得的胶原多肽水溶液中加入有机溶剂将胶原多肽沉淀析出，在6000～8000rpm下离心15～20min，收集沉淀，所用的有机溶剂为丙酮、甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或多种配成的混合物，有机溶剂与胶原多肽水溶液的比例为3～5∶1(v/v)；

(4)干燥

将所得沉淀于50～70℃下进行干燥24～36小时，粉碎，或者配为溶液进行喷雾干燥，得到粉末即为胶原多肽产品。

根据以上方法制得的胶原活性多肽收率为3.5～5.5％(干品/原料湿重)。

产品的指标如下：

外观：白色略带淡黄色粉末

分子量：2kDa～35kDa

含氮量：＞16％

氨基酸总量：＞90％

重金属含量：＜10ppm

水溶性：＞15g/100mL水(25℃)

1％水溶液pH值：为6.5～7.0

水分含量：2.0～4.5％。

以上制备过程中，酸法水解适宜条件的控制和胶原水解多肽的分离纯化是本发明的关键技术。

鸭是我国广泛饲养的家禽。新鲜鸭脚原料来源广，尤其在我国南方地区鸭脚资源丰富，很容易得到，价格便宜。鸭掌和鸭蹼中80％以上为天然胶原蛋白、其次为少量的脂肪、其它蛋白和水分等成分，鸭脚梗1/3有机物中绝大部分也是胶原蛋白，品质优良。本发明所用的鸭脚原料购自浙江杭州。

以下通过实施例对本发明作进一步的描述：

实例1

取鸭脚(鸭趾、鸭蹼和鸭脚梗)10000g，清洗干净，于5.0％乙酸液中浸泡400小时，水洗pH值6.0，去离子水浸泡24小时。然后，在72℃热水中抽提8小时，过滤，所得滤液于50℃、0.099MPa下减压浓缩，使得浓缩液中胶原蛋白的含量为5％(w/w)，向浓缩液中加入柠檬酸调pH为3.5。于90℃下水解3小时，用碳酸钠调pH值为7.0，静置2小时，然后在8000rpm下离心20min，弃去沉淀，得胶原多肽水溶液。向其中加入有机溶剂混合物(丙酮和甲醇1∶1，v/v)，与胶原多肽水溶液的比例为4∶1(v/v)，8000rpm下离心20min，弃上清液得沉淀，将沉淀于65℃干燥30小时，得胶原多肽粉末440g，胶原多肽收率为4.4％(干品/原料湿重)。

实例2

取鸭脚梗2000g，清洗干净，于3.0％柠檬酸液中浸泡480小时，水洗pH值5.0，去离子水浸泡16小时。然后，在85℃热水中抽提4小时，过滤，所得滤液于55℃、0.099MPa下减压浓缩，使得浓缩液中胶原蛋白的含量为15％(w/w)，向浓缩液中加入硫酸调pH为4.0。于68℃下水解7小时，用氢氧化钾调pH值为7.5，静置8小时，然后在8000rpm下离心15min，弃去沉淀，得胶原多肽水溶液。向其中加入有机溶剂混合物(丙酮和乙醇2∶1，v/v)，与胶原多肽水溶液的比例为4.5∶1(v/v)，8000rpm下离心15min，弃上清液得沉淀，将沉淀于50℃干燥30小时，得胶原多肽粉末90g，胶原多肽收率为4.5％(干品/原料湿重)。

实例3

取鸭脚750g，清洗干净，于1.0％硫酸液中浸泡450小时，水洗pH值4.0，去离子水浸泡18小时。然后，在65℃热水中抽提8小时，过滤，所得滤液于65℃、0.097MPa下减压浓缩，使得浓缩液中胶原蛋白的含量为25％(w/w)，向浓缩液中加入乙酸和盐酸混合液(乙酸和浓盐酸6∶1，v/v)，调pH为0.5。于65℃下水解8小时，用碳酸氢钠调pH值为7.0，静置8小时，然后在7000rpm下离心18min，弃去沉淀，得胶原多肽水溶液。向其中加入有机溶剂混合物(乙醇和异丙醇4∶1，v/v)，与胶原多肽水溶液的比例为3∶1(v/v)，7000rpm下离心18min，弃上清液得沉淀，将沉淀于61℃干燥28小时，得胶原多肽粉末31g，胶原多肽收率为4.1％(干品/原料湿重)。

实例4

取鸭蹼约40g，清洗干净，4.0％盐酸浸泡420小时，水洗，去离子水浸泡12小时，再水洗pH值5.0。60℃热水抽提10小时，得提取液于50℃、0.095atm下减压浓缩，使得浓缩液中胶原蛋白的含量为10％(w/w)，向浓缩液中加入草酸与柠檬酸混合液(草酸和柠檬酸2∶1，v/v)，调pH约2.5。72℃下水解4小时，用氢氧化钠调pH值为8.0。静置5小时，然后在6000rpm下离心20min，弃去沉淀，得胶原多肽水溶液。向其中加入丙酮，与胶原多肽水溶液的比例为4∶1(v/v)，6000rpm下离心20min，弃上清液得沉淀，将沉淀于70℃干燥24小时，得胶原多肽粉末2.1g，胶原多肽收率为5.2％(干品/原料湿重)。

实例5

取鸭脚4500g，清洗干净，于3.5％盐酸和乙酸液(重量比2∶1)中浸泡480小时，水洗pH值4.0，去离子水浸泡18小时。然后，在65℃热水中抽提8小时，过滤，所得滤液于70℃、0.099MPa下减压浓缩，使得浓缩液中胶原蛋白的含量为20％(w/w)。向浓缩液中加入乙酸和盐酸混合液(乙酸和浓盐酸6∶1，v/v)，调pH为1.5。于71℃下水解8小时，用碳酸氢钠调pH值为7.0，静置8小时，然后在8000rpm下离心15min，弃去沉淀，得胶原多肽水溶液。向其中加入乙醇和异丙醇(2∶1，v/v)，与胶原多肽水溶液的比例为5∶1(v/v)，7000rpm下离心20min，弃上清液得沉淀，将沉淀于55℃干燥36小时，得胶原多肽粉末220g，胶原多肽收率为4.8％(干品/原料湿重)。