抑制人VEGF基因的表达的siRNA和表达载体及其在制药中的应用

摘要

本发明公开了一种特异性抑制人VEGF基因表达的siRNA及该siRNA的表达载体和它们在制备与人VEGF基因有关的疾病的药物中的应用。本发明利用生物计算机信息技术从GenBank中获得一组人VEGF基因序列，并以RNA干扰技术为基础，设计出一组能诱发RNA干扰的siRNA，通过化学法合成或质粒、噬菌体表达一定量的siRNA，从而特异性抑制人VEGF基因的表达，达到抑制血管增生的目的。该siRNA及其表达质粒可用于制备高效快速、特异性强、副作用少的抗肿瘤及与新生血管异常增生相关的疾病的药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种siRNA，特别是涉及一种抑制人VEGF基因的表达的siRNA和表达载体及其在制药中的应用。

背景技术

肿瘤的生长和转移与肿瘤区血管有着密切的关系，肿瘤血管为肿瘤细胞的生长输送营养物质并排泄代谢废物，肿瘤转移灶的形成和发展也依赖于肿瘤血管的形成。因此，切断肿瘤的血供可能达到抑制肿瘤生长和转移的目的。在已发现的多种刺激新生血管形成的生长因子中，只有VEGF专一作用于血管内皮细胞。VEGF是1979年首次从肿瘤分泌物中分出的生长因子，它高效、特异作用于血管内皮细胞，是新生血管形成的中心调控因子，它在正常组织细胞中不表达，在肿瘤细胞以及受到肿瘤刺激的周围基质细胞中表达，而且，恶性肿瘤的血管形成程度与VEGF mRNA表达具有高度相关性，因此，通过抑制VEGF的异常表达和新生血管的形成，为肿瘤的治疗提供了新方法。

已有研究用VEGF的单克隆或多克隆抗体有效抑制新生血管形成和肿瘤的生长，也有采用专一性高、毒副作用较低的反义寡核苷酸技术抑制肿瘤的生长，但用反义寡核苷酸技术的基因治疗通常所用剂量大，抑制VEGF基因表达仅达20-90％，采用小双链RNA(19-23bp)干涉技术(RNAi)靶向作用明显、有放大持续作用效果，剂量小，体外抑制靶向基因mRNA表达稳定抑制在90％以上，如改变一个碱基则抑制作用消失，因此，用小双链RNA干涉不影响正常基因的作用，它的专一性和靶向性强。

RNAi技术就是利用双链RNA(double-stranded RNA)诱导序列特异的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing)。2001年5月和2001年12月，德国科学家Elabshir、Harborth和Tuschl等人在《Nature》和《J.Cell Sci.》上相继发表了用RNAi技术分别使哺乳类细胞中16个基因表达水平降低或沉默，从而证明RNAi对哺乳类细胞也起作用，这使得这项技术应用于治疗某些由于特定基因表达过多引起的疾病，如癌基因的过度表达引起的癌症成为可能。有望此项技术能成为新的癌症基因治疗的有效手段。

与用反义寡核苷酸技术的基因治疗相比，双链RNA干涉技术的优点为：①靶向性、专一性强。②双链RNA干涉技术有放大持续作用，时间短，见效快，且实验重复性和稳定性均很好。③双链RNA干涉技术所用合成的双链RNA剂量小，比反义技术所用剂量小近万倍。④双链RNA可用载体进行表达，一次转染可持续表达一个月以上，稳定并且表达量较高。

为此，本发明提供一种抑制人VEGF基因表达的小双链RNA，它们可以特异地靶向作用于人VEGFmRNA，从而抑制肿瘤细胞VEGF基因表达，抑制整体动物体内肿瘤组织新生血管的形成与生长和抑制肿瘤的生长，可用于制备治疗与血管增生有关疾病的药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性抑制人VEGF基因表达的siRNA。

本发明的另一个目的是提供一种能够产生上述siRNA的表达载体。

本发明的再一个目的是提供上述siRNA或产生该siRNA的表达载体在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的目的通过以下方式实现：

一种特异性抑制人VEGF基因表达的siRNA，其特征在于它包含下列任意六种siRNA的其中一种或几种，它们的碱基序列及作用部位见表1。

所述的siRNA，它们可通过人工合成、T₇体外合成和质粒载体表达形成，该siRNA在3’端有2～6个dT修饰或2～6个U修饰。

包括表1中所述的siRNA的表达载体。

所述的siRNA在制备治疗和预防肿瘤及与新生血管异常增生相关的疾病的药物中的应用。

所述的表达载体在制备治疗和预防肿瘤及与新生血管异常增生相关的疾病的药物中的应用。

本发明的详细描述：

根据人VEGF mRNA序列，从ATG后第75个核苷酸开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列(其中N19任意19个mRNA核苷酸序列)，并符合核苷酸中G+C比例为占30～70％左右，将符合要求的21个碱基序列通过BLAST证实EST基因库靶向作用的基因是唯一的。设计19～23个碱基的反义RNA序列，并通过机器合成或T₇体外合成2条RNA链(见表1)，在2条RNA链的3’端各加上2～6个dT序列进行修饰，以减少细胞内降解。两条链通过PCR连接成小双链RNA，并通过Oligofectamine试剂将小双链RNA转导入VEGF高表达的细胞中，例Hela细胞和SMMC-7721细胞，作用培养48～72小时后，进行westernblot和荧光免疫组化观察，用VEGF抗体进行检测VEGF蛋白表达含量的下降，确认这六种小双链RNA均有不同程度的抑制人VEGF基因表达效果；然后采用双向或发夹状结构合成DNA链，通过表达小双链RNA的启动子，如U6启动子和H1启动子，由质粒载体或病毒载体在真核细胞内转录形成带有2～6个U小双链RNA或带有发夹状结构的小双链RNA，把这些质粒载体通过脂质体转导或病毒转染癌细胞，抑制癌细胞VEGF基因表达，从而抑制肿瘤生长。结果表明，通过质粒载体或病毒载体可产生小双链RNA，并可抑制癌细胞中VEGF基因表达和抑制移植于动物的肿瘤血管生长和肿瘤生长。

表1抑制人VEGF基因表达的小双链RNA序列、修饰和作用位点

序号小双链RNA序列3’端修饰作用于人VEGF的mRNA位点1(SEQ ID NO.1)5’GGA GGA GGG CAG AAT CAT C 3’3’CCU CCU CCC GUC UUA GUA G 5’dU或U 132～1502(SEQ ID NO.2)5’UCA UCA CGA AGU GGU GAA G 3’3’AGU AGU GCU UCA CCA CUU C 5’dU或U 146～1643(SEQ ID NO.3)5’GUG GUG AAG UUC AUG GAU G 3’3’CAC CAC UUC AAG UAC CUA C 5’dU或U 156～1744(SEQ ID NO.4)5’GUU CAU GGA UGU CUA UCA G 3’3’CAA GUA CCU ACA GAU AGU C 5’dU或U 164～1825(SEQ ID NO.5)5’GCC AUC CUG UGU GCC CCU G 3’3’CGG UAG GAC ACA CGG GGA C 5’dU或U 260～2786(SEQ ID NO.6)5’CAU CAC CAU GCA GAU UAU G 3’3’GUA GUG GUA CGU CUA AUA C 5’dU或U 341～359

本发明的优点：

本发明根据人VEGF mRNA序列设计合成和通过质粒载体系统转录形成的小双链RNA，作用剂量小，特异性高，可有效抑制癌细胞内VEGF基因表达85～90％以上，可抑制移植于整体动物体内的肿瘤血管生长和肿瘤生长，它比VEGF单克隆抗体或多克隆抗体有更高的底物专一性和更低的毒副作用，并经动物试验证明本发明可应用于配制成治疗肿瘤及新生血管异常增生相关的疾病的药物。

附图说明

图1：通过T₇ RNA聚合酶合成的siRNA抑制肝癌和宫颈癌细胞中VEGF基因的表达westernblot图

图2：鉴定有U6启动子的pRK5质粒的琼脂糖电泳图

图3：psiRNA质粒鉴定琼脂糖电泳图

图4：裸鼠接种Hela细胞22天后瘤体重量直方图

图5：pcDNA3.1(+)图谱

图6：pRK5质粒图谱

图7：pAVU₆₊₂₇图谱

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

实施例1、机器合成小双链干涉RNA(siRNA)抑制Hela宫颈癌细胞中VEGF基因的表达

(1)通过机器合成siRNA

先从GenBank查找VEGF基因的mRNA序列(Xm166457)，从上述基因序列中的起始密码后75个碱基开始寻找AA+N19+UU序列或AA+N19序列，其中N19任意19个mRNA核苷酸序列。一般从中找出21个核苷酸中G+C比例为50％左右，并不高于70％或不低于30％的核苷酸序列。将符合要求的21个碱基序列在NCBI database中通过BLASU搜索小核苷酸序列同源性核ESTLibrary，以保证所靶向的目的基因是唯一的。

以序列3(SEQ ID NO.3)为例：

首先设计好含21个碱基的正链(sense)RNA和反链(antisense)RNA序列，为减少细胞内降解，3’端用两个dU修饰，通过siACE-RNAi合成，

sense：    5’GUG GUG AAG UUC AUG GAU GdTdT 3’

antisense：5’dTdTCAC CAC UUC AAG UAC CUA C 3’

分别将两条RNA链引物用无RNA酶的水配成50μM，将两条RNA链引物各30μl加入15μl的5×配对缓冲液(100mM醋酸钾，30mM HEPES-KOH pH7.4和2mM醋酸镁)，共计75μl，用PCR仪90℃ 1分钟，37℃ 1小时，然后关掉PCR仪使之冷却到室温后，-20℃贮存，并反复冻融5次，这样dsRNA的最终浓度为20μM。

(2)siRNA抑制Hela宫颈癌细胞中VEGF基因的表达

HeLa细胞24孔板上用RPMI-1640培养液，含6％的小牛血清(FBS)和双抗(青霉素、链霉素，下同)在37℃ 5％ CO₂细胞培养箱中培养至满瓶的50％。然后，吸去培养液，用不含双抗和FBS的RPMI-1640洗1次。在转染siRNA前，加入无血清和双抗的DMEM197μl/孔。接下来取20μM siRNA 3μl(终浓度为60pM)，加入40μl Opti-MEM混合稀释，另一试管加入2μl oligofectamine Reagent，用8μl OpUi-MEM混合稀释。两试管在室温无菌条件下放置10分钟，两试管合并混合后室温无菌条件下放置15～20分钟，待溶液变稠后移入24孔板中，每孔加入53μl共计250μl/每孔培养介质，37℃ 5％ CO₂下培养4小时，每孔再加入含3倍FBS和3倍双抗的RPMI-1640培养液250μl，37℃ 5％ CO₂下分别培养48小时和72小时。

转染siRNA后，细胞培养48小时和72小时吸去培养介质，用0.1M PBS液洗细胞一次，每孔加入50μl 1％ SDS，取出细胞后，轻微超声粉碎细胞10分钟，-70℃冻存。同时取出3μl用Bio-Rad DC测蛋白浓度，OD₇₅₀测吸收值，从标准曲线查出蛋白浓度。调节蛋白浓度使每个样品的的蛋白量为100μg作10％SDS-PAGE电泳，并转印到硝酸纤维素膜上，进行westernblot。含有样品的硝酸纤维素膜用2％脱脂奶粉配制的PBS洗30分钟，用兔多抗(兔抗人VEGF多克隆抗体一抗)按1∶250用2％脱脂奶粉-PBS稀释后，振荡反应1.5小时，用2％脱脂奶粉-PBS洗30分钟。然后用HRP-山羊抗兔IgG1∶50 2％脱脂奶粉-PBS稀释后反应1小时，PBS洗30分钟，DAB试剂盒显色处理，计算蛋白表达抑制率。

实施例2、通过T₇ RNA聚合酶合成的小双链干涉RNA(siRNA)抑制SMMC-7721肝癌细胞中VEGF基因的表达

(一)通过T₇ RNA聚合酶合成siRNA

本发明所提供的双链RNA(siRNA)，是根据发明人由GenBank中所查找到的关于人VEGFmRNA的序列而得到的，这些RNA序列及其所对应的人VEGF mRNA的作用位点见表1，以序列1(SEQ ID NO.1)为例：

先设计合成引物：

T₇：5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3’(SEQ ID NO.7)

sense：5’-TCG TGA TGA TTC TGC CCT CCT CCT ATA GTG AGT CGT ATT A-3’

(SEQ ID NO.8)

antisense：5’-AAG GAG GAG GGC AGA ATC ATC ACT ATA GTG AGT CGT ATT A-3’

(SEQ ID NO.9)

将三种引物各溶于100μl中。

(1)先形成双链DNA(dsDNA)：取1nmol的T₇引物和1nmol的VEGF的sense引物溶于50μl TE buffer(10mmol Tris-HCL pH8.0，1mmol EDTA)作为A1；取1nmol的T₇引物和1nmol的VEGF的antisense引物溶于50μl TE buffer(10mmol Tris-HCL pH8.0，1mmol EDTA)作为B1，分别将A1和B1管95℃加热2分钟后逐步冷却至4℃。

转录：在50μl的转录反应体系中：

200pmol dsDNA(A1或B1)

1mmol rNTPs

U yeast pyrophosphatase

40U RNA酶抑制剂(RnaseOUT)

100U T₇ RNA聚合酶(T₇ RNA polymerase)

1×T₇转录缓冲液(40mmol Tris-HCL pH8.0

                       6mmol MgCl2

                       10mmol DTT

                       10mmol NaCl

                       2mmol spermidine)

分别称为A2和B2。将A2和B2置37℃加热2小时后，各加入1U无RNA酶的DNA酶(RNase free Dnase)后再37℃加热15分钟得到A3和B3。

形成siRNA：

将A3和B3混合，95℃加热5分钟，37℃加热1小时，逐步冷却至4℃。

此液体用3M醋酸钠调pH值为5.2，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀，离心后沉淀再用70％乙醇洗一次，吹干，溶于50μl无RNA酶的水(RNase-free)水中，-20℃冻存待用。

(二)siRNA抑制SMMC-7721肝癌细胞中VEGF基因的表达

SMMC-7721细胞24孔板上用RPMI-1640培养液，含6％的小牛血清(FBS)和双抗(青霉素、链霉素，下同)在37℃ 5％ CO₂细胞培养箱中培养至满瓶的50％。然后，吸去培养液，用不含双抗和FBS的RPMI-1640洗1次。在转染siRNA前，加入无血清和双抗的DMEM197μl/孔。接下来取20μM siRNA 3μl(终浓度为60pM)，加入40μl Opti-MEM混合稀释，另一试管加入2μl oligofectamine Reagent，用8μl Opti-MEM混合稀释。两试管在室温无菌条件下放置10分钟，两试管合并混合后室温无菌条件下放置15～20分钟，待溶液变稠后移入24孔板中，每孔加入53μl共计250μl/每孔培养介质，37℃5％CO₂下培养4小时，每孔再加入含3倍FBS和3倍双抗的RPMI-1640培养液250μl，37℃ 5％ CO₂下培养72小时。

转染siRNA后，细胞培养72小时吸去培养介质，用0.1M PBS液洗细胞一次，每孔加入50μl 1％SDS，取出细胞后，轻微超声粉碎细胞10’，-70℃冻存。同时取出3μl用Bio-Rad DC测蛋白浓度，OD750测吸收值，从标准曲线查出蛋白浓度。调节蛋白浓度使每个样品的的蛋白量为100μg作10％SDS-PAGE电泳，并转印到硝酸纤维素膜上，进行westernblot。含有样品的硝酸纤维素膜用2％脱脂奶粉配制的PBS洗30分钟，用兔多抗按1∶200用2％脱脂奶粉-PBS稀释后，振荡反应1.5小时，用2％脱脂奶粉-PBS洗30分钟。然后用HRP-山羊抗兔IgG1∶100 2％脱脂奶粉-PBS稀释后反应1小时，PBS洗30分钟，DAB试剂盒显色处理，结果见图1，图中1为SMMC7721细胞，2为转染T₇-siRNA的SMMC7721细胞，3为Hela细胞，4为转染T₇-siRNA的Hela细胞。可观察到与未转染肿瘤相比转染细胞中VEGF量显著减少，计算蛋白表达抑制率。

实施例3：构建的发夹状双链RNA抑制SMMC-7721肝癌细胞中VEGF基因的表达

(一)：U6启动子的制备

1、U6启动子PCR引物的设计和PCR的过程

引物：

3’端引物

AATCTGCAGAAAAAGCGGACCGAAGTCCGCTCTAGATGCATGCTCGAGGTCGTCCGGTGTTTCGTCCTTTCCA

C

(SEQ ID NO.10)

5’端引物

CGCGGATCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC

(SEQ ID NO.11)

PCR模板：pTZU6+27

PCR的过程

94℃ 1分，57℃ 1分，72℃ 1分，35个循环后，72℃ 10分，4℃保存。

2.PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在280bp有一条很深很亮的条带，这就是U6启动子的条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，取17μl回收的DNA，加10×限制性内切酶PstI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶PstI 1μl，混匀，37℃保温酶解5小时，反应后，反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃30分钟，14000g 4℃ 15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10×限制性内切酶BamHI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶BamHI 1μl，混合，37℃保温酶解2小时。最后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在280bp有一条很深很亮的条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为A液，-20℃保存备用。

(二)：pRK5质粒的酶切和与U6启动子的连接

1.取质粒pRK5(4716bp)0.5μg(0.5μl)，加10×限制性内切酶PstI缓冲液2μl，无菌水17μl和限制性内切酶PstI 1μl，混匀，37℃保温酶解5小时，反应后，反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃30分钟，14000g 4℃ 15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10×限制性内切酶BamHI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶BamHI 1μl，混合，37℃保温酶解2小时。最后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在4500bp上方有一条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为B液，-20℃保存备用。

2.取上述的A液7μl，B液1μl，加入10μl的无菌水，2μl的10×T4 DNA连接酶缓冲液和1μl的T4 DNA连接酶，22℃孵育1小时。

在孵育液中加入100μl的感受态大肠杆菌DH5a，转化大肠杆菌，然后涂布在100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养16-18小时，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶PstI和BamHI酶切，反应液在1％琼脂糖凝胶电泳分离，结果见图2，图中，4、7、8为阳性菌。选择出现300bp左右插入片段的质粒，保存备用。

(三)：VEGF抑制基因的制备和连接

本发明所提供的发夹状双链RNA(siRNA)，是根据发明人由GenBank中所查找到的关于人VEGF mRNA的序列而得到的，这些RNA序列及其所对应的人VEGF mRNA的作用位点见表1，

发明人根据以上原则，设计合成了权利要求书1中序列2(SEQ ID N0.2)：

5’AA UCA UCA CGA AGU GGU GAA G 3’

3’UU AGU AGU GCU UCA CCA CUU C 5’

作用于VEGF mRNA的第146-164位。

两端留下SalI和XbaI的酶切位点，具体的发夹状RNA的基因序列为：

N端

5’TCGACC TCATCACGAAGTGGTGAAGTTCAAGAGACTTCACCACTTCGTGATGATTTTTTGGAAAT

(SEQ ID N0.12)

C端

5’CTAGATTCCAAAAAATCATCACGAAGTGGTGAAGTCTCTTGAAGCTTCACCACTTCTGATGACGG

(SEQ ID NO.13)

1.把分别合成的上述两条单链DNA配成双链

把配成50μM的单链DNA各取2μl，加入46μl的annealing Buffer(100mM醋酸钾，30mM Hepes-KOH pH7.4，2mM醋酸镁)，在PCR仪中，95℃ 4分钟，70℃ 10分钟，关机后冷却至室温，4℃存放后，-20℃保存备用。

2.合成双链DNA的磷酸化

2μl合成双链DNA

1μl T4多聚核苷酸激酶的缓冲液A

1μl 1mMATP

1μl T4PNK

5μl无菌水

把总体积为10μl的液体混匀，37℃ 30分钟，70℃10分钟，然后冷却至室温，4℃存放后，-20℃保存备用。

3.取已经连接上U6启动子的pRK5质粒16μl(1μg)，加10×限制性内切酶SalI缓冲液2μl，限制性内切酶SalI和XbaI各1μl，混匀，37℃保温酶解5小时，反应后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在5000bp下方有一条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，  -20℃保存备用。

4.将上述酶切的质粒1μl和磷酸化的VEGF的双链DNA 7μl，加入10μl的无菌水，2μl的10×T4 DNA连接酶缓冲液和1μl的T4 DNA连接酶，22℃孵育1小时。

5.在孵育液中加入100μl的感受态大肠杆菌DH5a，转化大肠杆菌，然后涂布在100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养16-18小时，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶SalI和XbaI酶切，反应液在2.5％琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现64bp插入片段的质粒，此即pRI质粒。

(四)：含G418抗性基因双链RNA质粒pCI的构建方法

1.把已经构建好的pRI质粒，取17μl(约1μg)，加10×限制性内切酶EcoRI缓冲液2μl，限制性内切酶EcoRI 1μl，混匀，37℃保温酶解1小时，反应后，反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃30分钟，14000g 4℃ 15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10×限制性内切酶XbaI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶XbaI 1μl，混合，37℃保温酶解5小时。最后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在400bp有一条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为A液，-20℃保存备用。

2.取pcDNA3.0质粒17μl(约1μg)，加10×限制性内切酶EcoRI缓冲液2μl，限制性内切酶EcoRI 1μl，混匀，37℃保温酶解2小时，反应后，反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃30分钟，14000g 4℃ 15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10×限制性内切酶XbaI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶XbaI 1μl，混合，37℃保温酶解5小时。最后，1％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在5400bp有一条带，切下，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收凝胶上的双链DNA，溶解于20μl无菌水中，是为B液，-20℃保存备用。

3.质粒的连接、转化和鉴定

(1)取上述的A液7μl，B液1μl，加入10μl的无菌水，2μl的10×T4 DNA连接酶缓冲液和1μl的T4 DNA连接酶，22℃孵育1小时。

(2)在孵育液中加入100μl的感受态大肠杆菌DH5a，转化大肠杆菌，然后涂布在100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养18小时，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，反应液在1％琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现400bp插入片段的质粒，即为pCI质粒。

(五).pCI质粒对SMMC-7721肝癌细胞VEGF基因表达的抑制作用

1.SMMC-7721肝癌细胞的培养和转染

SMMC-7721肝癌细胞细胞来自上海中科院细胞所，1640培养基+10％小牛血清培养，待培养到细胞的贴壁率在80％左右，铺6孔细胞培养板，1.5×10⁵个细胞/孔，过夜培养后，细胞的贴壁率在90％左右时，吸去培养液，用不含双抗和小牛血清的1640洗1次。接下来取pCI质粒4μg，加入250μl Opti-MEM混合稀释，另一试管加入10μl lipofectamin2000，用250μl Opti-MEM混合稀释。两试管在室温无菌条件下放置5分钟，两试管合并混合后室温无菌条件下放置20分钟，待溶液变稠后移入6孔板中，每孔加入560μl培养介质，37℃ 5％ CO₂下培养4小时，每孔再加入含2倍小牛血清和2倍双抗的1640培养液1440μl，37℃ 5％ CO₂下培养72小时。

2.细胞的筛选

吸去培养介质，用含200μg/ml G418的1640培养基筛选阳性细胞，中间不断更换新鲜的含200μg/ml G418的1640培养基，待细胞完全贴壁后，此即为含有pCI质粒的SMMC-7721肝癌细胞(阳性细胞株)。

3.细胞的回收和抑制效果的鉴定

把含有pCI质粒的SMMC-7721肝癌细胞在不含G418的1640培养基培养72小时后，吸去培养介质，用Hank’s液洗一次，每孔加入50μl 1％SDS，取出细胞后，轻微超声粉碎细胞10秒，-70℃冻存。同时取出3μl用Bio-Rad DC测蛋白浓度，OD750测吸收值，从标准曲线查出蛋白浓度。调节蛋白浓度使每个样品的的蛋白量为100μg作10％SDS-PAGE电泳，并转印到硝酸纤维素膜上，进行westernblot。含有样品的硝酸纤维素膜用2％脱脂奶粉配制的PBS(0.1M，pH7.0)洗30分钟，用兔多抗按1∶200用2％脱脂奶粉-PBS稀释后，振荡反应1.5小时，用2％脱脂奶粉-PBS洗30分钟。然后用HRP-山羊抗兔IgG1∶50 2％脱脂奶粉-PBS稀释后反应1小时，PBS洗30分钟，DAB试剂盒显色处理。结果发现，与未转染细胞比较，计算转导有pCI质粒的细胞其VEGF基因蛋白表达抑制率。

实施例4：构建双向表达sense和antisense形成小双链RNA表达载体

1、包含目的基因的双链DNA的形成

为了将设计好的小双链RNA序列能在质粒中表达出来，首先合成3个引物，利用PCR技术形成相应的分别包含U6+27启动子的双链DNA片段。

以序列4(No.260)为例，3个引物的序列分别是：

a.3’末端正链(sense)引物序列为：

5’ATT GGG CCC GTC GAC ATC GAT AAA AAA GTT CAT GGA TGT CTA TCA GTT CGG TGTTTC GTC CTT TCC AC 3’

(SEQ ID NO.14)

b.3’末端负链(antisense)引物序列为：

5’CCG GAA TCC TCT AGA AAA AAA CAA GTA CCT ACA GAT AGT CTT CGG TGT TTC GTCCTT TCC AC 3’

(SEQ ID NO.15)

5’末端引物序列为：

5’ATA AGA ATG CGG CCG CCC CGG GGA TCC AAG GTC GGG 3’

(SEQ ID NO.16)

分别将3’末端的正链和负链引物与5’末端引物通过PCR扩增形成两条DNA双链(sense链、antisense链)，PCR模板为pTZU6+27，PCR的过程：94℃ 1分，57℃ 1分钟，72℃ 1分钟，35个循环后，72℃ 10分钟，4℃保存，称为PCR产物1和PCR产物2。

2、酶切包含目的基因U6+27-antisense的双链DNA及质粒载体pcDNA3.1(5.428kb)

PCR产物2经1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在350bp左右有一条很深很亮的条带，是U6+27-antisense DNA条带，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收。取17μl回收的含U6+27-antisense DNA，加10×限制性内切酶XbaI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶XbaI1μl，混匀，37℃酶切过夜，再在反应体系中加限制性内切酶BamHI 1μl，37℃酶切3h。同样的方法用XbaI和BamHI酶切质粒载体pcDNA3.1(5.428kb)。电泳并回收，得到含U6+27-antisense小片段DNA(酶切位点为XbaI和BamHI)以及大片段质粒载体pcDNA3.1(酶切位点为XbaI和BamHI)。-20℃保存备用。

3、酶切包涵目的基因U6+27-sense的双链DNA及质粒载体pcDNA3.1(5.428kb)

PCR产物1经1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外光下在350bp左右有一条很深很亮的条带，是U6+27-sense DNA条带，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收。取17μl回收的含U6+27-senseDNA，加10×限制性内切酶NotI缓冲液2μl，再加入限制性内切酶NotI 1μl，混匀，37℃酶切过夜，然后反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，混合，-20℃ 30分钟，14000g 4℃ 15分钟离心，去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10×限制性内切酶ApaI，酶切3h。同样的方法用NotI和ApaI酶切pcDNA3.1。得到含U6+27-sense小片段DNA(酶切位点为NotI和ApaI和)以及大片段质粒载体pcDNA3.1(酶切位点为NotI和ApaI)。-20℃保存备用。

4、将目的基因U6+27-antisense连接到质粒载体pcDNA3.1中

取酶切大片段质粒载体pcDNA3.1(酶切位点为XbaI和BamHI)1μl，再取U6+27-antisense小片段DNA(酶切位点为XbaI和BamHI)7μl，加入10μl的无菌水，2μl的10×T4 DNA连接酶缓冲液和1μl的T4 DNA连接酶，22℃孵育1小时。在孵育液中加入100μl的感受态大肠杆菌DH5α，转化大肠杆菌，然后涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养16-18h，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶XbaI和BamHI酶切鉴定，反应液在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，选择出现350bp插入片段的质粒，保存备用。

5、将目的基因U6+27-sense连接到质粒载体pcDNA3.1中

取酶切大片段质粒载体pcDNA3.1(酶切位点为NotI和ApaI)1μl，再取U6+27-sense小片段DNA(酶切位点为NotI和ApaI)7μl，同步骤(4)进行连接、转化，37℃过夜培养16-18h，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶NotI和ApaI酶切鉴定，反应液在1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，出现350bp插入片段的质粒，保存备用。

6、psiRNA质粒的构建

将步骤(4)中的阳性克隆菌提质粒，并用Apa I酶切3h后，在反应液中加0.5μl平头酶，37℃孵育15min，75℃灭活10min，然后反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，沉淀，离心。去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10×限制性内切酶HindIII缓冲液和1μl HindIII，酶切3h。1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，得到350bp的含U6+27-antisense小片段DNA，其酶切位点为HindlII和Apa I(平)。胶回收备用。

将步骤(5)中的阳性克隆菌提质粒，并用EcoR I酶切2h后，在反应液中加0.5μl平头酶，37℃孵育15min，75℃灭活10min，然后反应体系中加入16μl 4M醋酸铵溶液，84μl无水乙醇，沉淀，离心。去上清，吹干后，加入17μl无菌水和10×限制性内切酶HindIII缓冲液和1μl HindIII，酶切3h。1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，得到包含U6+27-sense的大片段，其酶切位点为HindIII和EcoR I(平头酶)。胶回收备用。

取步骤(7)中的包含U6+27-sense的大片段1μl，再取步骤(6)中的U6+27-antisense小片段DNA(酶切位点为XbaI和BamHI)7μl，按步骤(4)中的连接方法将小片段介入大片段中。转化大肠杆菌，然后涂布在含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃过夜培养16-18h，随机挑取菌落于含100μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中扩增细菌，抽提质粒，分别用限制性内切酶BamHI酶切鉴定，电泳分离，出现350bp片段的为阳性克隆菌，结果见图3，图中1号为阳性菌。阳性菌测序。结果表明新构建的质粒载体中包含U6+27-antisense和U6+27-sense，命名为psiRNA。

实施例5：构建的小双链RNA抑制SMMC-7721细胞表达VEGF

1.SMMC-7721肝癌细胞培养实验

分别将SMMC-7721肝癌细胞和转染小双链RNA的阳性细胞株在含10％小牛血清的RPMI-1640培养基内繁殖到一定数目，0.25％胰酶消化，离心收集，PBS洗三次，改换无血清培养基，种至96孔板上，每孔为200μl体积，含有10×10³个细胞.相同条件下培养，第三天收集培养液，4℃离心收集上清。

2.VEGF的测活实验

将该上清加入96孔板人脐静脉血管内皮细胞培养基中，每孔50μl，72小时后收集脐静脉血管内皮细胞，MTT染色法检测内皮细胞生长情况，以下式计算生长抑制率。

抑制率＝(1-Nn/N)×100％，其中N为用SMMC-7721肿瘤细胞的上清处理后的细胞数，Nn为用转染小双链RNA的阳性细胞株上清处理后细胞数(加收集上清后的细胞数)，No为初始细胞数。实验得到平均生长抑制率为72.4％

实施例6：构建的小双链RNA体内抑瘤实验

将BALB/C裸鼠随机分为对照组(未处理组)、转空白质粒细胞组(转pcDNA3.0的细胞)、转pcDNA3.0-VEGF发夹状小双链RNA的肿瘤细胞组，分别取对数生长期的肿瘤细胞、转pcDNA3.0的肿瘤细胞和阳性转染细胞株，0.25％胰酶消化后置于无血清1640培养液中，调整浓度为5×10⁷/ml，分别接种于BALB/C裸小鼠的右腋皮下，每只0.1ml，待形成肉眼可见肿瘤后，隔日用游标卡尺测量肿瘤的长、宽，肿瘤体积按下列公式计算：V＝(L×W2)×0.52。各组在注射肿瘤细胞22天后，颈椎脱臼处死，剖出肿瘤，测量肿瘤重量，结果见图4，图中1为对照组，2为转空白质粒细胞(转pcDNA3.0的细胞)，3为转pcDNA3.0-VEGF发夹状小双链RNA的肿瘤细胞。计算抑瘤率，并进行肿瘤组织中微血管密度测定和肿瘤细胞凋亡检测。结果表明，pcDNA3.0-VEGF发夹状小双链RNA有明显的抑制肿瘤生长的作用。

                               序列表

<110>徐根兴

<120>抑制人VEGF基因的表达的siRNA和表达载体及其在制药中的应用

<160>16

<210>1

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>1

ggaggagggc agaatcatc                                             19

<210>2

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>2

ucaucacgaa guggugaag                                             19

<210>3

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>3

guggugaagu ucauggaug                                            19

<210>4

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>4

guucauggau gucuaucag                                            19

<210>5

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>5

gccauccugu gugccccug                                              19

<210>6

<211>19

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的小双链RNA

<400>6

caucaccaug cagauuaug                                              19

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：T₇引物

<400>7

taatacgact cactatag                                                18

<210>8

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：VEGF的正义链引物

<400>8

tcgtgatgat tctgccctcc tcctatagtg agtcgtatta                        40

<210>9

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：VEGF的反义链引物

<400>9

aaggaggagg gcagaatcat cactatagtg agtcgtatta                         40

<210>10

<211>74

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：U6启动子PCR 3’端引物

<400>10

aatctgcaga aaaagcggac cgaagtccgc tctagatgca tgctcgaggt cgtccggtgt 60

ttcgtccttt ccac                                                   74

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：U6启动子PCR 5’端引物

<400>11

cgcggatcca aggtcgggca ggaagagggc                                    30

<210>12

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：单链DNA的N端序列

<400>12

tcgacctcat cacgaagtgg tgaagttcaa gagacttcac cacttcgtga tgattttttg 60

gaaat                                                             65

<210>13

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：单链DNA的N端序列

<400>13

ctagattcca aaaaatcatc acgaagtggt gaagtctctt gaagcttcac cacttctgat 60

gacgg                                                             65

<210>14

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：双向作用的双链RNA 3’端正义链引物序列

<400>14

attgggcccg tcgacatcga taaaaaagt tcatggatgt ctatcagttc ggtgtttcgt 60

cctttccac                                                        69

<210>15

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：双向作用的双链RNA 3’端反义链引物序列

<400>15

ccggaatcct ctagaaaaaa acaagtacct acagatagtc ttcggtgttt cgtcctttcc 60

ac                                                                62

<210>16

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：双向作用的双链RNA 5’端引物序列

<400>16

ataagaatgc ggccgccccg gggatccaag gtcggg                          36