微生物两段发酵法由甘油生产1，3－丙二醇和2，3丁二醇

摘要

本发明公开了属于生物化工技术领域，是采用前期厌氧后期好氧两段发酵的新工艺利用微生物由甘油同时生产1，3－丙二醇和2，3－丁二醇的方法，发酵过程中先将种子液加入含工业甘油或甘油发酵液的初始发酵培养基中，发酵开始3～5小时后流加甘油和葡萄糖混合溶液。通过两段发酵过程中通气量的调节以及发酵温度的控制来调控1，3－丙二醇和2，3－丁二醇的产物浓度，发酵结束时通过脱盐、蒸馏、真空精馏等步骤将1，3－丙二醇和2，3－丁二醇分离、提纯，制备产品。该方法可以有效提高1，3－丙二醇的发酵浓度、得率和生产强度，同时还可获得较高浓度的2，3－丁二醇，从而提高了的原料利用率、降低了生产成本。

说明书

技术领域

本发明属于生物化工技术领域，特别涉及一种微生物两段发酵法由甘油生产1，3-丙二醇和2，3-丁二醇。

背景技术

1，3-丙二醇(PDO)是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业。1，3-丙二醇最主要的用途是作为聚酯和聚氨酯合成的单体，特别是与对苯二甲酸聚合生成的聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)，显示了比以1，2-丙二醇、丁二醇、乙二醇为单体合成的聚合物更优良的性能。目前全球每年消费数千万吨聚对苯二甲酸乙二酯(PET)，而PTT的化学稳定性、生物可降解性等与PET相当，但耐污染性、韧性和回弹性及抗紫外性能等更优越。此外PTT纤维还具有耐磨、吸水性低、低静电等优点，可在地毯领域与尼龙竞争。它还可用于具有优良性能的无纺布、工程塑料、服装、家庭装饰、垫衬料、织物等方面。PTT被评为美国98年六大石化新产品之一，被认为将是PET的升级产品。

PTT的优越性能及市场潜力早在50年前就被人们所认识，只因原料1，3-丙二醇生产技术难度大、成本高而导致PTT很难大规模工业化生产，迄今为止，只有Dupont和Shell两家跨国公司采用传统的化学合成路线，以环氧乙烷或丙烯为原料生产仅供它们合成PTT自用的1，3-丙二醇。化学合成法的缺点是副产物多，选择性差，操作条件需高温高压，设备投资巨大，原料为不可再生资源，且环氧乙烷和另一路线的中间产物丙烯醛分别是易燃易爆或剧毒的危险品。由于发酵法生产1，3-丙二醇选择性高，操作条件温和，因此近年来受到特别的重视。

2，3-丁二醇(2，3-butanediol)作为发酵法生产1，3-丙二醇的一种副产物也是一种重要的化工原料。它是一种无色无味液体，可作为燃料，可用来制备聚合物、油墨、香水、防冻剂、熏蒸剂、增湿剂、软化剂、增塑剂、炸药以及药物的手性载体等。2，3-丁二醇还可作为一个很有价值的化工原料来合成其他化学品，如2，3-丁二醇脱水可产生甲乙酮，甲乙酮的应用相当广泛，再进一步脱水可形成1，3-丁二烯。2，3-丁二醇可通过Diels-Alder反应聚合生成苯乙烯。2，3-丁二醇与甲乙酮缩合并进行加氢反应生成辛烷，辛烷可用来产生高质量的飞行原料。2，3-丁二醇与乙酸反应生成2，3-丁二醇二乙酸酯，此酯类可添加到奶油中改善风味。但由于其在1，3-丙二醇发酵中产量较低，一般不作为产物进行分离、提纯。

目前，由甘油发酵生产1，3-丙二醇主要有以下几条途径：

1)采用肠道细菌厌氧条件下将甘油歧化为1，3-丙二醇(USP5254467，EP0373230 A1)。

2)克雷伯氏杆菌等厌氧菌在厌氧条件下发酵生产1，3-丙二醇(Ruch etal.Regulation of glycerol catabolism in Klebsiella aerogenes.J Bacteriol.1974，119(1)：50-56；Streekstra et al.Overflow metabolism during anaeric growthof Klebsiella pneumoniae NCTC418 on glycerol and dihydroxyacetone inchemostat culture.Arch Microbiol.1987，147：268-275；Zeng et al.Pathwayanalysis of glycerol fermentation by Klebsiella pneumoniae：Regulation ofreducing equivalent balance and product formation.Enzyme Microbiol Technol.1993，15：770-779.)。

3)采用克雷伯氏杆菌在微氧条件下发酵生产1，3-丙二醇(王剑锋等，克雷伯氏菌微氧发酵生产1，3-丙二醇的研究，现代化工，2001，21(5)：28-31。修志龙等，一种微生物微氧发酵生产1，3-丙二醇的方法，中国专利公开号：CN1348007)

4)采用克雷伯氏杆菌在厌氧条件下发酵产1，3-丙二醇和2，3-丁二醇(Biebl et al.Fermentation of glycerol to 1，3-propanediol and 2，3-butanediol.Appl Microbiol Biotechnol，1998，50：24-29)。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物两段发酵法由甘油生产1，3-丙二醇和2，3-丁二醇，其特征在于：所述由甘油生产1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的方法是采用微生物前期厌氧、后期好氧的两段发酵新工艺。第一步厌氧发酵是将种子液加入含甘油浓度为20-80g/l的工业甘油或甘油发酵液的初始发酵培养基，在发酵温度30～40℃条件下利用厌氧菌进行厌氧发酵，在发酵的过程中通入0.2-0.4vvm的惰性气体氮气或二氧化碳，发酵开始3～5小时后流加900g/l甘油和90g/l葡萄糖混合溶液，其中甘油∶葡萄糖＝10∶1(w/w)；第二步进行好氧发酵，发酵温度仍保持在30～40℃，在发酵过程中通入空气或氧气，通气量为0.2-0.6vvm，发酵过程中同时流加500-1000g/l甘油、50-200g/l葡萄糖和3-5M氢氧化钠，其中甘油∶葡萄糖∶氢氧化钠＝10∶1∶1(w/w/w)。发酵结束时通过常规的脱盐、蒸馏和真空精馏步骤将1，3-丙二醇和2，3-丁二醇分离、提纯，制备产品。

本发明的有益效果：采用前期厌氧后期好氧的两段发酵新工艺，可通过两段发酵过程中通气量的调节以及两段发酵转换时机的控制来调控1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的产物浓度。提高产物浓度、得率和生产强度，并在得到产物1，3-丙二醇的同时将较高浓度的2，3-丁二醇分离，得到了产物2，3-丁二醇，从而有效提高原料利用率，降低生产成本。

具体实施方式

本发明提供一种微生物两段发酵法由甘油生产1，3-丙二醇和2，3-丁二醇，所述由甘油生产1，3-丙二醇和2，3-丁二醇的方法是采用微生物前期厌氧、后期好氧的两段发酵新工艺：第一步厌氧发酵是将种子液加入含甘油浓度为20-80g/l的工业甘油或甘油发酵液的初始发酵培养基中，在发酵温度30～40℃条件下利用厌氧菌-克雷伯氏杆菌进行厌氧发酵，在发酵的过程中通入0.2-0.4vvm的惰性气体氮气或二氧化碳等，发酵开始3～5小时后流加900g/l甘油和90g/l葡萄糖混合溶液，其中甘油∶葡萄糖＝10∶1(w/w)；第二步进行好氧发酵，发酵温度仍保持在30～40℃，在发酵过程中通入空气或氧气，通气量为0.2-0.6vvm，发酵过程中同时流加500-1000g/l甘油、50-200g/l葡萄糖和3-5M氢氧化钠，其中甘油∶葡萄糖∶氢氧化钠＝10∶1∶1(w/w/w)，发酵结束时通过常规的脱盐、蒸馏和真空精馏步骤将1，3-丙二醇和2，3-丁二醇分离、提纯，制备产品。

下面再举具体实施例对本发明予以进一步说明。

实例1：

(1)菌种：克雷伯氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)M5al

(2)培养基

培养基组分       种子培养基    发酵培养基       微量元素溶液

                 (/l)          (/l)             (mg/l)

甘油             20g           20-80g        ZnCl₂             70

K₂HPO₄·3H₂O 4.45g         2.225g        MnCl₂·4H₂O      100

(NH₄)₂SO₄    2.0g          2.0g          H₃BO₃            60

KH₂PO₄        1.3g          0.65g         CoCl₂·6H₂O      200

MgSO₄·7H₂O   0.2g          0.2g          NiCl₂·6H₂O      25

酵母粉           1.0g          1.5g          NiCl₂·H₂O       27.64

微量元素溶液     2ml           2ml           Na₂MoO₄·2H₂O   35

CaCO₃           2.0g                        CuCl₂·H₂O       20

消泡剂                         0.1ml         CuSO₄·5H₂O      29.28

                                             浓盐酸(37％)        0.9ml

(3)培养方式：

A.种子培养：

甘油管保藏的菌种转接至LB斜面，30℃下活化12小时。种子培养采用有氧培养，使用500ml三角瓶，装液量100ml。培养温度30℃，摇床转速140rpm。

B.发酵培养：发酵培养使用5L发酵罐，装液量4L，培养温度35℃，pH值7。发酵过程中用含浓度为50g/l的工业甘油的初始发酵培养基，发酵开始3.5小时后流加900g/l甘油和90g/l葡萄糖混合溶液，其中甘油∶葡萄糖＝10∶1(w/w)。

(4)发酵方式

克雷伯氏杆菌发酵产1，3-丙二醇和2，3-丁二醇：发酵过程中发酵温度控制为35℃，前期厌氧发酵，通入氮气，通气量0.2vvm。在发酵进行至30小时进行后期好氧发酵，发酵过程中通入空气，通气量0.2vvm，发酵罐搅拌转速150rpm。。

(5)发酵结果如下：

发酵共进行68小时，残余甘油浓度8.3g/l，发酵液中含1，3-丙二醇61.7g/l，2-丁二醇20g/l，乳酸12g/l浓度，醋酸5g/l。1，3-丙二醇摩尔得率0.48，生产强度0.91g/(1h)，2，3-丁二醇摩尔得率0.13。总二醇摩尔得率0.61

实例2：

(1)菌种：同实例1

(2)培养基：同实例1

(3)培养方式：

A.种子培养：

甘油管保藏的菌种转接至LB斜面，30℃下活化12小时。种子培养采用有氧培养，使用500ml三角瓶，装液量100ml。培养温度30℃，摇床转速140rpm。

B.发酵培养：发酵培养使用5L发酵罐，装液量4L，培养温度37℃，pH值7。发酵过程中用含浓度为30g/l工业甘油的初始发酵培养基，发酵开始4小时后流加800g/l甘油和80g/l葡萄糖混合溶液。其中甘油∶葡萄糖＝10∶1(w/w)

(4)发酵方式：

克雷伯氏杆菌发酵产1，3-丙二醇和2，3-丁二醇：发酵过程中发酵温度控制为37℃，前期厌氧发酵，发酵过程中通入二氧化碳，通气量0.2vvm。在发酵进行至32小时进行后期好氧发酵，发酵过程中通入空气，通气量0.2vvm，发酵罐搅拌转速150rpm。。

(5)发酵结果如下：

发酵共进行68小时，残余甘油浓度10.7g/l，发酵液中含1，3-丙二醇69.6g/l，2，3-丁二醇16g/l，乳酸9.2g/l浓度，醋酸5.2g/l。1，3-丙二醇摩尔得率0.51，生产强度1.0g/(1h)，2，3-丁二醇2，3-丁二醇0.09。总二醇摩尔得率0.6.

实例3：

(1)菌种：同实例1

(2)培养基：同实例1

(3)培养方式：

A.种子培养：

甘油管保藏的菌种转接至LB斜面，30℃下活化12小时。种子培养采用有氧培养，使用500ml三角瓶，装液量100ml。培养温度30℃，摇床转速140rpm。

B.发酵培养：发酵培养使用5L发酵罐，装液量4L，培养温度40℃，pH值7。发酵过程中用含80g/l甘油的甘油发酵液作为初始发酵培养基，发酵开始5小时后流加1000g/l甘油和100g/l葡萄糖混合溶液，其中甘油∶葡萄糖＝10∶1(w/w)。

(4)发酵方式：

克雷伯氏杆菌发酵产1，3-丙二醇和2，3-丁二醇：发酵过程中发酵温度控制为40℃，前期厌氧发酵，发酵过程中通入氮气，通气量0.2vvm。在发酵进行至32小时进行后期好氧发酵，发酵过程中通入空气，通气量0.2vvm，发酵罐搅拌转速150rpm。

(5)发酵结果如下：

发酵共进行68小时，残余甘油浓度11.8g/l，发酵液中含1，3-丙二醇52.4g/l，2，3-丁二醇10.6g/l，乳酸7.4g/l浓度，醋酸3.7g/l。1，3-丙二醇摩尔得率0.53，生产强度0.77g/(1h)，2，3-丁二醇摩尔得率0.09。总二醇摩尔得率0.62。