精液乳酸脱氢酶X同工酶活性定量检测试剂

摘要

本发明公开了一种精液乳酸脱氢酶X同工酶(LDH－X)活性定量检测试剂，包括底物A、底物B和终止液。所述底物A是含有β－NADH的Tris－EDTA－Na2缓冲液或缓冲液冻干粉；所述底物B是含碳链大于5个的2－酮基酸的Tris－EDTA－Na2缓冲液或缓冲液冻干粉。通过配制底物A、底物B，可利用速率法在生化分析仪上对精液乳酸脱氢酶X同工酶(LDH－X)进行自动检测；通过配制终止液，可利用两点法对精液乳酸脱氢酶X同工酶(LDH－X)进行手工检测。本发明还公开了采用上述试剂制作的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外诊断试剂，具体适用于精液乳酸脱氢酶X同工酶(以下简称LDH-X)活性定量检测。

背景技术

LDH-X主要分布于精母细胞、精子细胞的胞质及精子的胞质和粗子型线粒体内，其合成自初级精母细胞粗线期中期开始直至精子形成，其合成调节受雄激素分泌的影响。LDH-X为精子在生殖道运动提供充足能源，测定精液LDH-X并结合激素水平测定，可作为评价生精上皮状态指标；LDH-X也是评价精液质量的可靠指标。

现有精液LDH-X活性定量检测试剂(如：底物采用磷酸盐缓冲液)，存在如下不足：1、检测范围窄，不能含盖正常、异常的病理范围。2、难以避免金属离子对同工酶检测的干扰。3、底物的稳定性差、贮藏期短，不适合于做试剂盒使用。

测定人精子LDH-X主要有聚丙烯酰胺电泳法和分光光度法，前者操作复杂、灵敏度不够，且检测的是LDH-X的量而不是其活性。后者是采用速率法检测LDH-X的活性，操作简单，但存在如下不足：1、由于反应时前后数据变化较快，测定误差非常大，达不到临床检测试剂手工操作要求，只能在自动生化分析仪上检测；2、不能精确控制反应时间；3、由于在分光光度计上没有控温设备，无法控温(要求反应温度是37℃)。

本发明为分光光度法，采用速率法和两点法检测LDH-X活性，可手工与自动化双选择操作。

发明内容

本发明目的之一在于提出一种检测范围广，能避免金属离子对同工酶检测的干扰，底物的稳定性好、贮藏期长的精液乳酸脱氢酶X同工酶(LDH-X)活性定量检测试剂及试剂盒。

进一步地，本发明的另一目的在于提出一种操作简便，适于手工和自动化双选择操作的精液LDH-X活性定量检测试剂及试剂盒。

实现上述目的的技术方案：

一种精液乳酸脱氢酶X同工酶(LDH-X)活性定量检测试剂，包括底物A和底物B，所述底物A是含有β-NADH的Tris-EDTA-Na₂缓冲液或缓冲液冻干粉；所述底物B是含碳链大于5个的2-酮基酸的Tris-EDTA-Na₂缓冲液或缓冲液冻干粉。

所述碳链大于5个的2-酮基酸优选2-酮基己酸。

还包括终止液，用于终止LDH-X的催化反应，终止液优选含十二烷基硫酸钠的去离子水溶液。

所述碳链大于5个的2-酮基酸优选2-酮基己酸。

按重量百分比计，所述底物A中β-NADH含量为0.05～0.5％，所述底物B中2-酮基己酸含量为0.5～5％。

按重量百分比计，所述底物A中β-NADH含量为0.05～0.5％，所述底物B中2-酮基己酸含量为0.5～5％，所述终止液中十二烷基硫酸钠含量为3～10％。

精液乳酸脱氢酶X同工酶(LDH-X)活性定量检测试剂盒，包括底物A和底物B，所述底物A是β-NADH含量为0.05～0.5％的Tris-EDTA-Na₂缓冲液或缓冲液冻干粉0.375～3.75mg；所述底物B是碳链大于5个的2-酮基酸含量为0.5～5％的Tris-EDTA-Na₂缓冲液或缓冲液冻干粉3.75～37.5mg，碳链大于5个的2-酮基酸优选2-酮基己酸。根据需要，还可包括终止液，终止液是十二烷基硫酸钠含量为3～10％的去离子水溶液0.75～2.5mg。

采用上述技术方案，结合下面将要详述的实施例，本发明突出的技术效果在于：

1、反应时，由于β-NADH提供氢离子给碳链大于5个的2-酮基酸(优选2-酮基己酸)，通过检测β-NADH的消耗量，可知LDH-X的活性。2、采用LDH-X，检测范围广，能检测正常、异常的病理范围。3、采用金属离子络合剂EDTA-Na₂，能避免金属离子对同工酶检测的干扰。4、采用β-NADH，对底物的稳定性有帮助，试剂稳定性更好，贮存期长，4-8℃保存可稳定一年以上，完全适合于做为试剂盒使用。5、可同时满足自动化/手工操作需要：a、采用速率法反应原理，可在生化分析仪上自动检测，结果准确可靠；b、通过配备终止液，加入终止液可停止反应，保持吸光度不变，再利用两点法的反应原理，可在分光光度计上人工准确读数。

具体实施方式

实施例一、一种精液乳酸脱氢酶X同工酶(LDH-X)活性定量检测试剂，包括：(1)底物A(冻干粉)：β-NADH含量为0.05～0.5％的Tris-EDTA-Na₂缓冲液或缓冲液冻干粉；(2)底物B(冻干粉)：碳链大于5个的2-酮基酸含量为0.5～5％的Tris-EDTA-Na₂缓冲液或缓冲液冻干粉，碳链大于5个的2-酮基酸优选2-酮基己酸；(3)终止液：含十二烷基硫酸钠(SDS)3～10％的去离子水溶液。

当检测的精液乳酸脱氢酶X同工酶活性低时，选择β-NADH含量浓度低的底物A和碳链大于5个的2-酮基酸含量浓度低的底物B为宜，底物A和底物B的用量相应减少。当检测的精液乳酸脱氢酶X同工酶活性高时，选择β-NADH含量浓度高的底物A和碳链大于5个的2-酮基酸含量浓度高的底物B为宜，底物A和底物B的用量相应增加。

上述精液LDH-X活性定量检测试剂的制作工艺方法：

A、Tris-EDTA-Na₂缓冲液的制作工艺方法

1)、称取Tris 30.0～40.0克，EDTA-Na₂ 5.0～15.0g，置于烧杯。加去离子水900ml，在37℃水浴搅拌溶解。

2)、pH计下用1mol/L HCl调节至pH8.0～9.0，移入容量瓶中，用去离子水定容至1000毫升。置4℃贮存；

B、底物A的制作工艺方法

3)、称取β-NADH 0.5～5.0g，加适量Tris-EDTA-Na₂缓冲液溶解后定容至1000ml。分装冻干，置4℃贮存；

C、底物B的制作工艺方法

4)、称取2-酮基己酸5～50g，加适量Tris-EDTA-Na₂缓冲液溶解后定容至1000ml。分装冻干，置4℃贮存；

D、终止液的制作工艺方法

5)、称取SDS 3～10g，加入80ml去离子水，置40℃水浴搅拌溶解，定容至100ml。置4～30℃贮存。

根据需要，可将上述精液LDH-X活性定量检测试剂制作成试剂盒，其中：底物A 0.375～3.75mg，底物B 3.75～37.5mg，终止液0.75～2.5mg。

上述试剂盒的优选方案是：底物A优选0.6～1.5mg、底物B优选6～15mg。

进一步地，上述试剂盒的优选方案是：底物A是0.855mg、底物B是8.415mg，终止液1.25mg。

实施例二、一种精液LDH-X活性定量检测试剂，包括：(1)底物A(冻干粉)：β-NADH含量为0.114％的Tris-EDTA-Na₂缓冲液或缓冲液冻干粉；(2)底物B(冻干粉)：2-酮基己酸含量为1.122％的Tris-EDTA-Na₂缓冲液或缓冲液冻干粉；(3)终止液：含十二烷基硫酸钠(SDS)5％的去离子水溶液。其制备工艺方法，包括如下步骤：

A、Tris-EDTA-Na₂缓冲液的制作工艺方法

1)、称取Tris 34.0克，EDTA-Na₂ 10.4g，置于烧杯。加去离子水900ml，在37℃水浴搅拌溶解。

2)、pH计下用1mol/L HCl调节至pH8.4，移入容量瓶中，用去离子水定容至1000毫升。置4℃贮存。

B、底物A的制作工艺方法

3)、称取β-NADH 1.140g，加适量Tris-EDTA-Na₂缓冲液溶解后定容至1000ml。分装冻干，置4℃贮存。

C、底物B的制作工艺方法

4)、称取2-酮基己酸11.220g，加适量Tris-EDTA-Na₂缓冲液溶解后定容至1000ml。分装冻干，置4℃贮存。

D、终止液的制作工艺方法

5)、称取SDS 5.0g，加入80ml去离子水，置40℃水浴搅拌溶解，定容至100ml。置室温贮存。

将上述精液LDH-X活性定量检测试剂制作成试剂盒，其中：底物A 0.375～3.75mg、底物B 3.75～37.5mg，终止液0.75～2.5mg。

上述试剂盒的优选方案是：底物A优选0.6～1.5mg、底物B优选6～15mg。

进一步地，上述试剂盒的优选方案是：底物A是0.855mg、底物B是8.415mg，终止液1.25mg。

实验例、用LDH-X定量检测试剂检测人精液LDH-X的具体步骤：

一、试剂准备

底物A冻干粉、底物B冻干粉均以16ml蒸馏水复溶。

二、样本准备

1、精浆：新鲜精液液化后，迅速将标本充分混匀，取部分精液3000g离心15～20min，留取精浆待检。

2、精液：新鲜精液液化后，迅速将标本充分混匀，计数此份标本精子浓度(M×10⁶/ml)。置于-20℃冻融一次后3000g离心15～20min，留取精浆待检。

三、速率法

1、加样：同一反应管内加底物A溶液750ul和底物B溶液750ul。37℃预温5分钟，再加精浆或全精液10ul，迅速混匀，上机测定。

2、生化分析仪测试参数：

方法：速率法      延迟时间：20秒     吸入量：500ul

波长：340nm       测定时间：30秒     换算因子：24276

温度：37℃        反应方向：向下     非线性范围：5％

单位：U/L         试剂空白：无

检测结果生化分析仪自动输出。

四、两点法

1、操作方法如下表所示

                       对照管               测定管

底物A(ul)              750                  750

底物B(ul)              750                  750

终止液(ul)             25                   ----    

                       37℃水浴5分钟

标本(ul)               5                    5

                       37℃精确水浴3分钟

终止液(ul)             ----                 25

光径1.0cm，蒸馏水调零，340nm波长比色.加终止液后60min内完成比色

2、计算

酶活力(U/L)＝ΔA/min×49196

其中ΔA＝(A对照-A测定)÷3

注：可根椐实验条件选择速率法或两点法检测。

五、结果处理

全精子LDH-X(U/L)＝全精液LDH-X-精浆LDH-X

精子LDH-X(mU/10⁶精子)＝全精子LDH-X/精子浓度(M)

精浆/全精子LDH-X比值＝精浆LDH-X/全精子LDH

六、正常参考值

精浆LDH-X：248～1376U/L

精子LDH-X：10.96～32.36mU/10⁶精子

精浆/全精子LDH-X比值：0.21～0.56

七、临床适用性

1、测定精液LDH-X并结合激素水平测定，可作为评价生精上皮状态指标。

2、LDH-X可评价精子膜的完整程度。