用于温度诱导双水相分配的金属螯合亲和配基及其制备方法

摘要

本发明公开了一种用于温度诱导双水相分配的金属螯合亲和配基及其制备方法。将环氧乙烷和环氧丙烷无规共聚物(EOPO)的端羟基活化，结合上亚氨基二乙酸(IDA)后，螯合金属离子(Me)，得到金属螯合亲和配基EOPO－IDA－Me。步骤如下：1)环氧氯丙烷活化EOPO合成氯代EOPO；2)氯代EOPO脱氯化氢生成环氧EOPO；3)碱性环境下，环氧EOPO与IDA反应，生成EOPO－IDA；4)EOPO－IDA与反应液分离，纯化，得到EOPO－IDA；5)EOPO－IDA螯合金属离子，制备金属螯合亲和配基EOPO－IDA－Me。本发明所开发的上述金属螯合亲和配基，性质稳定，其水溶液具有较低的浊点温度，可以用于金属螯合温度诱导双水相亲和分配，有利于亲和配基的回收和循环使用。

说明书

                        技术领域

本发明涉及一种用于温度诱导双水相分配的金属螯合亲和配基及其制备方法，属于生化分离工程领域。

                        背景技术

利用亲和作用的高度特异性形成的各种亲和分离纯化技术已经成为生化分离领域中强有力的工具之一。金属螯合亲和法即是一种高效分离蛋白质的方法，利用过渡金属离子对蛋白质表面的富电子氨基酸残基(如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等)的特异性相互作用可以达到亲和分离的目的。把金属离子亲和作用引入双水相系统，将金属亲和配基共价结合到成相组分上，可以大大加强双水相分配的选择性。双水相亲和分配技术由于分离条件温和、与生物质兼容性好等优势备受国内外学术界的关注，具有广泛的应用前景。

双水相系统有两种类型：聚合物/聚合物或聚合物/无机盐系统，一般把亲和配基结合到一种聚合物上(如聚乙二醇或葡聚糖)，利用成相聚合物的单相富集来实现亲和分配。相对于其它亲和分离方法，双水相亲和分配技术的主要缺憾在于分离成本过高，成相聚合物和亲和配基难以回收和循环使用。近年来，利用温度诱导相分离，实现聚合物的循环利用引起了学术界的高度关注。温度诱导相分离就是当把聚合物溶液加热到一定温度时，会自然分为两相，一相富含聚合物，另一相富含水，这种现象发生时的温度称为聚合物溶液的浊点。10％的聚乙二醇(分子量2000)的浊点为111.7℃，而相同浓度的环氧乙烷与环氧丙烷的无规共聚物EOPO溶液的浊点只有55℃，这对热敏性物质的分离纯化是非常有利的。将双水相分配技术与温度诱导相分离过程相结合，以EOPO为成相组分，利用它们各自的优势，构成温度诱导双水相分配技术，可用于生物活性物质的有效分离，并实现聚合物的回收利用。若EOPO结合有亲和配基，既可利用亲和作用提高双水相分配的选择性，又可通过温度诱导相分离来回收成相聚合物和亲和配基，可降低双水相分配的分离成本，促进双水相分配技术的工业化应用。迄今为止，该思路尚未见文献报导，这也正是本发明的出发点所在。

2000年，林东强等以聚乙二醇为原料，经过环氧氯丙烷活化，结合金属离子螯合剂，然后螯合金属离子，制备出一种用于双水相亲和分配的金属螯合亲和配基(参见Chinese Journal of Chemical Engineering，8(4)：310-314，2000)。在此基础上，文禹撷等进行了合成条件的优化，通过控制环氧氯丙烷与聚乙二醇的摩尔配比，得到了不同金属离子含量的金属螯合双水相亲和分配配基(参见化学工程反应与工艺，19(2)：129-134，2003)。然而，鉴于聚乙二醇溶液的浊点温度过高，无法采用温度诱导相分离实现生物对象的分离和亲和配基的回收利用。为了实现温度诱导双水相分配和金属螯合亲和分离两项技术的结合，必须制备出新型的具有较低浊点温度的金属螯合亲和配基。

EOPO和亚氨基二乙酸都是易得的工业原料，迄今为止，还未见将两者结合起来开发用于温度诱导双水相分配的金属螯合亲和配基的报道。

                          发明内容

本发明的目的是提供一种用于温度诱导双水相分配的金属螯合亲和配基及其制备方法。

用于温度诱导双水相分配的金属螯合亲和配基是由聚合物、螯合剂和金属离子共同组成，其结构式为：

[-(CH₂)₂-O-]_m[-(CH₂)₃-O-]_n-(CH₂)₃-O-N-(CH₂COO)₂-金属离子

聚合物主体为环氧乙烷和环氧丙烷无规共聚物(EOPO)，金属离子螯合剂为亚氨基二乙酸(IDA)，螯合的金属离子为Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺过渡金属离子，其水溶液的浊点温度范围为20～70℃。

制备方法的步骤如下：

1)EOPO活化

液态EOPO中滴加环氧氯丙烷0.02～0.04mL/g EOPO，滴加含三氟化硼质量浓度为50％的三氟化硼乙醚溶液0.02～0.08mL/g EOPO，冰浴，维持搅拌15～24小时，环氧氯丙烷的环氧键开环，与EOPO上的羟基反应，制得氯代EOPO；

2)EOPO环氧化

在冰浴和良好搅拌下，滴加质量浓度为40％的NaOH溶液，NaOH溶液用量为0.1～0.3mL/g EOPO，反应3～7小时，氯代EOPO在氢氧化钠作用下脱氯化氢生成环氧EOPO，反应液离心，取上清液，50～60℃真空干燥，得到环氧EOPO；

3)结合螯合剂

环氧EOPO溶解于质量浓度为0.8％的NaOH溶液，NaOH溶液量为6～10mL/g EOPO，混合均匀，添加IDA，IDA用量为0.033～0.1g/g EOPO，，控制pH值为9～12，温度为40～50℃，维持搅拌，反应18～24小时，生成EOPO-IDA；

4)纯化EOPO-IDA

上述反应液中加入硫酸钠，硫酸钠用量为0.5～1.0g/g EOPO，混合均匀，静置分相，形成双水相系统，分离出富含聚合物的上相，升高温度到60～70℃，分相，取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，分相，分离出下相，即纯化的EOPO-IDA；

5)螯合金属离子

EOPO-IDA溶解于pH4.0浓度为50mol/L的醋酸钠缓冲液，加入硫酸铜、硫酸锌或硫酸镍，其用量为0.3～0.5g/g EOPO，室温下，保持搅拌1～10小时，用2倍体积的氯仿萃取2次，合并氯仿相，蒸干氯仿，加水溶解，水用量为10g/gEOPO，升高温度到60～70℃，分相，取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相，分离出下相，50～60℃烘干，得到金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Me。

本发明先将EOPO端羟基活化成环氧基，结合上IDA后，螯合金属离子，得到金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Me。制备过程中保持了EOPO的主体聚合物的结构、聚合物的聚合度、环氧乙烷和环氧丙烷的配比及无规分布不发生变化，EOPO的浊点温度基本保持不变。因此，所开发的金属螯合亲和配基可以用于温度诱导双水相亲和分离。本发明的优点在于：1)制备的金属螯合亲和配基性质稳定，可用于金属螯合双水相亲和分配；2)可以螯合不同的过渡金属离子，以适应不同分离对象的需要；3)浊点温度范围为20～70℃，可以在较低的温度下实现温度诱导相分离；4)实现温度诱导双水相分配和金属螯合亲和分离两项技术的结合；5)制备工艺简单，易于控制和放大；6)成本低廉，所使用的原料可以回收再利用，环境污染小。

                        具体实施方式

用于温度诱导双水相分配的金属螯合亲和配基的制备方法的步骤如下：

1)EOPO活化

环氧氯丙烷活化EOPO合成氯代EOPO

2)EOPO环氧化

氯代EOPO脱氯化氢生成环氧EOPO

3)结合螯合剂

碱性环境下环氧EOPO与IDA反应，生成EOPO-IDA。

4)纯化EOPO-IDA

EOPO-IDA与反应液分离，纯化，得到EOPO-IDA。

5)螯合金属离子

EOPO-IDA螯合金属离子，制备金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Me。

上述所用EOPO分子量为4000，聚合物分子中的环氧乙烷和环氧丙烷的比例为0.5～1.2。

以下通过实施例对本发明作进一步的描述：

实施例1

于125毫升三角瓶中加入10g EOPO，分子量为4000，环氧乙烷和环氧丙烷的比例为1.0，磁力搅拌，滴加环氧氯丙烷0.2毫升，搅拌混合均匀，滴加含三氟化硼质量浓度为50％的三氟化硼乙醚溶液0.4毫升，密封，冰浴，维持搅拌15小时。在冰浴和良好搅拌下，滴加质量浓度为40％的NaOH溶液2毫升，反应6小时。反应液离心，取上清液，50～60℃真空干燥，得到环氧EOPO 9.5克。环氧EOPO溶解于60毫升质量浓度为0.8％的NaOH溶液中，混合均匀，加入IDA 0.67克，控制pH值为9～12，控制温度为40℃，维持搅拌，反应20小时。上述反应液加入硫酸钠5g，混合均匀，静置分相。分离出富含聚合物的上相，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，分相，分离出下相，得到EOPO-IDA 6.4克。EOPO-IDA溶解于pH4.0浓度为50mM的醋酸钠缓冲液20毫升，加入硫酸铜3g，室温，保持搅拌5小时。用2倍体积的氯仿萃取2次，合并氯仿相，蒸干氯仿。加水100g溶解，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相。分离出下相，50～60℃烘干，得到金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Cu(II)5.1克。铜离子含量达到0.62mol/mol EOPO。

实施例2

于125毫升三角瓶中加入10g EOPO，分子量为4000，环氧乙烷和环氧丙烷的比例为1.0，磁力搅拌，滴加环氧氯丙烷0.3毫升，搅拌混合均匀，滴加含三氟化硼质量浓度为50％的三氟化硼乙醚溶液0.6毫升，密封，冰浴，维持搅拌18小时。在冰浴和良好搅拌下，滴加质量浓度为40％的NaOH溶液2.0毫升，反应6小时。反应液离心，取上清液，50～60℃真空干燥，得到环氧EOPO 9.8克。环氧EOPO溶解于100毫升质量浓度为0.8％的NaOH溶液中，混合均匀，加入IDA 0.67克，控制pH值为9～12，控制温度为45℃，维持搅拌，反应20小时。上述反应液加入硫酸钠10g，混合均匀，静置分相。分离出富含聚合物的上相，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，分相，分离出下相，得到EOPO-IDA 6.6克。EOPO-IDA溶解于pH4.0浓度为50mM的醋酸钠缓冲液20毫升，加入硫酸铜3g，室温，保持搅拌5小时。用2倍体积的氯仿萃取2次，合并氯仿相，蒸干氯仿。加水100g溶解，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相。分离出下相，50～60℃烘干，得到金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Cu(II)5.6克。铜离子含量达到0.70mol/mol EOPO。

实施例3

于125毫升三角瓶中加入10g EOPO，分子量为4000，环氧乙烷和环氧丙烷的比例为1.0，磁力搅拌，滴加环氧氯丙烷0.4毫升，搅拌混合均匀，滴加含三氟化硼质量浓度为50％的三氟化硼乙醚溶液0.8毫升，密封，冰浴，维持搅拌24小时。在冰浴和良好搅拌下，滴加质量浓度为40％的NaOH溶液2.0毫升，反应6小时。反应液离心，取上清液，50～60℃真空干燥，得到环氧EOPO 9.9克。环氧EOPO溶解于100毫升质量浓度为0.8％的NaOH溶液中，混合均匀，加入IDA 0.67克，控制pH值为9～12，控制温度为50℃，维持搅拌，反应20小时。上述反应液加入硫酸钠10g，混合均匀，静置分相。分离出富含聚合物的上相，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，分相，分离出下相，得到EOPO-IDA 6.7克。EOPO-IDA溶解于pH4.0浓度为50mM的醋酸钠缓冲液20毫升，加入硫酸铜3g，室温，保持搅拌5小时。用2倍体积的氯仿萃取2次，合并氯仿相，蒸干氯仿。加水100g溶解，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相。分离出下相，50～60℃烘干，得到金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Cu(II)5.8克。铜离子含量达到0.68mol/mol EOPO。

实施例4

于125毫升三角瓶中加入10g EOPO，分子量为4000，环氧乙烷和环氧丙烷的比例为1.0，磁力搅拌，滴加环氧氯丙烷0.3毫升，搅拌混合均匀，滴加含三氟化硼质量浓度为50％的三氟化硼乙醚溶液0.6毫升，密封，冰浴，维持搅拌18小时。在冰浴和良好搅拌下，滴加质量浓度为40％的NaOH溶液1.0毫升，反应7小时。反应液离心，取上清液，50～60℃真空干燥，得到环氧EOPO 9.7克。环氧EOPO溶解于100毫升质量浓度为0.8％的NaOH溶液中，混合均匀，加入IDA 0.67克，控制pH值为9～12，控制温度为45℃，维持搅拌，反应20小时。上述反应液加入硫酸钠10g，混合均匀，静置分相。分离出富含聚合物的上相，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，分相，分离出下相，得到EOPO-IDA 5.9克。EOPO-IDA溶解于pH4.0浓度为50mM的醋酸钠缓冲液20毫升，加入硫酸铜3g，室温，保持搅拌10小时。用2倍体积的氯仿萃取2次，合并氯仿相，蒸干氯仿。加水100g溶解，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相。分离出下相，50～60℃烘干，得到金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Cu(II)4.8克。铜离子含量达到0.55mol/mol EOPO。

实施例5

于125毫升三角瓶中加入10g EOPO，分子量为4000，环氧乙烷和环氧丙烷的比例为1.0，磁力搅拌，滴加环氧氯丙烷0.3毫升，搅拌混合均匀，滴加含三氟化硼质量浓度为50％的三氟化硼乙醚溶液0.6毫升，密封，冰浴，维持搅拌18小时。在冰浴和良好搅拌下，滴加质量浓度为40％的NaOH溶液3.0毫升，反应3小时。反应液离心，取上清液，50～60℃真空干燥，得到环氧EOPO 9.5克。环氧EOPO溶解于80毫升质量浓度为0.8％的NaOH溶液中，混合均匀，加入IDA 0.67克，控制pH值为9～12，控制温度为45℃，维持搅拌，反应20小时。上述反应液加入硫酸钠10g，混合均匀，静置分相。分离出富含聚合物的上相，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，分相，分离出下相，得到EOPO-IDA 5.6克。EOPO-IDA溶解于pH4.0浓度为50mM的醋酸钠缓冲液20毫升，加入硫酸铜3g，室温，保持搅拌5小时。用2倍体积的氯仿萃取2次，合并氯仿相，蒸干氯仿。加水100g溶解，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相。分离出下相，50～60℃烘干，得到金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Cu(II)4.7克。铜离子含量达到0.50mol/mol EOPO。

实施例6

于125毫升三角瓶中加入10g EOPO，分子量为4000，环氧乙烷和环氧丙烷的比例为1.0，磁力搅拌，滴加环氧氯丙烷0.3毫升，搅拌混合均匀，滴加含三氟化硼质量浓度为50％的三氟化硼乙醚溶液0.2毫升，密封，冰浴，维持搅拌18小时。在冰浴和良好搅拌下，滴加质量浓度为40％的NaOH溶液1.0毫升，反应6小时。反应液离心，取上清液，50～60℃真空干燥，得到环氧EOPO 9.6克。环氧EOPO溶解于100毫升质量浓度为0.8％的NaOH溶液中，混合均匀，加入IDA 0.67克，控制pH值为9～12，控制温度为45℃，维持搅拌，反应20小时。上述反应液加入硫酸钠7.5g，混合均匀，静置分相。分离出富含聚合物的上相，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，分相，分离出下相，得到EOPO-IDA 5.7克。EOPO-IDA溶解于pH4.0浓度为50mM的醋酸钠缓冲液20毫升，加入硫酸铜3g，室温，保持搅拌1小时。用2倍体积的氯仿萃取2次，合并氯仿相，蒸干氯仿。加水100g溶解，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相。分离出下相，50～60℃烘干，得到金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Cu(II)4.6克。铜离子含量达到0.46mol/mol EOPO。

实施例7

于125毫升三角瓶中加入10g EOPO，分子量为4000，环氧乙烷和环氧丙烷的比例为1.0，磁力搅拌，滴加环氧氯丙烷0.3毫升，搅拌混合均匀，滴加含三氟化硼质量浓度为50％的三氟化硼乙醚溶液0.6毫升，密封，冰浴，维持搅拌18小时。在冰浴和良好搅拌下，滴加质量浓度为40％的NaOH溶液1.5毫升，反应6小时。反应液离心，取上清液，50～60℃真空干燥，得到环氧EOPO 9.8克。环氧EOPO溶解于100毫升质量浓度为0.8％的NaOH溶液中，混合均匀，加入IDA 0.33克，控制pH值为9～12，控制温度为45℃，维持搅拌，反应18小时。上述反应液加入硫酸钠10g，混合均匀，静置分相。分离出富含聚合物的上相，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，分相，分离出下相，得到EOPO-IDA 6.0克。EOPO-IDA溶解于pH4.0浓度为50mM的醋酸钠缓冲液20毫升，加入硫酸铜3g，室温，保持搅拌5小时。用2倍体积的氯仿萃取2次，合并氯仿相，蒸干氯仿。加水100g溶解，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相。分离出下相，50～60℃烘干，得到金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Cu(II)5.2克。铜离子含量达到0.72mol/mol EOPO。

实施例8

于125毫升三角瓶中加入10g EOPO，分子量为4000，环氧乙烷和环氧丙烷的比例为1.0，磁力搅拌，滴加环氧氯丙烷0.3毫升，搅拌混合均匀，滴加含三氟化硼质量浓度为50％的三氟化硼乙醚溶液0.6毫升，密封，冰浴，维持搅拌18小时。在冰浴和良好搅拌下，滴加质量浓度为40％的NaOH溶液1.5毫升，反应6小时。反应液离心，取上清液，50～60℃真空干燥，得到环氧EOPO 9.8克。环氧EOPO溶解于100毫升质量浓度为0.8％的NaOH溶液中，混合均匀，加入IDA 1.0克，控制pH值为9～12，控制温度为45℃，维持搅拌，反应24小时。上述反应液加入硫酸钠10g，混合均匀，静置分相。分离出富含聚合物的上相，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，分相，分离出下相，得到EOPO-IDA6.0克。EOPO-IDA溶解于pH4.0浓度为50mM的醋酸钠缓冲液20毫升，加入硫酸铜3g，室温，保持搅拌5小时。用2倍体积的氯仿萃取2次，合并氯仿相，蒸干氯仿。加水100g溶解，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相。分离出下相，50～60℃烘干，得到金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Cu(II)5.2克。铜离子含量达到0.72mol/mol EOPO。

实施例9

于125毫升三角瓶中加入10g EOPO，分子量为4000，环氧乙烷和环氧丙烷的比例为1.0，磁力搅拌，滴加环氧氯丙烷0.3毫升，搅拌混合均匀，滴加含三氟化硼质量浓度为50％的三氟化硼乙醚溶液0.6毫升，密封，冰浴，维持搅拌18小时。在冰浴和良好搅拌下，滴加质量浓度为40％的NaOH溶液1.5毫升，反应6小时。反应液离心，取上清液，50～60℃真空干燥，得到环氧EOPO 9.8克。环氧EOPO溶解于100毫升质量浓度为0.8％的NaOH溶液，混合均匀，加入IDA 1.0克，控制pH值为9～12，控制温度为45℃，维持搅拌，反应20小时。上述反应液加入硫酸钠10g，混合均匀，静置分相。分离出富含聚合物的上相，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，分相，分离出下相，得到EOPO-IDA 6.0克。EOPO-IDA溶解于pH4.0浓度为50mM的醋酸钠缓冲液20毫升，加入硫酸镍5g，室温，保持搅拌5小时。用2倍体积的氯仿萃取2次，合并氯仿相，蒸干氯仿。加水100g溶解，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相。分离出下相，50～60℃烘干，得到金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Ni(II)5.8克。镍离子含量达到0.45moL/mol EOPO。

实施例10

于125毫升三角瓶中加入10g EOPO，分子量为4000，环氧乙烷和环氧丙烷的比例为1.0，磁力搅拌，滴加环氧氯丙烷0.3毫升，搅拌混合均匀，滴加含三氟化硼质量浓度为50％的三氟化硼乙醚溶液0.6毫升，密封，冰浴，维持搅拌18小时。在冰浴和良好搅拌下，滴加质量浓度为40％的NaOH溶液1.5毫升，反应6小时。反应液离心，取上清液，50～60℃真空干燥，得到环氧EOPO 9.8克。环氧EOPO溶解于100毫升质量浓度为0.8％的NaOH溶液，混合均匀，加入IDA 1.0克，控制pH值为9～12，控制温度为45℃，维持搅拌，反应20小时。上述反应液加入硫酸钠10g，混合均匀，静置分相。分离出富含聚合物的上相，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相，分离出下相，得到EOPO-IDA6.0克。EOPO-IDA溶解于pH4.0浓度为50mM的醋酸钠缓冲液20毫升，加入硫酸锌4g，室温，保持搅拌5小时。用2倍体积的氯仿萃取2次，合并氯仿相，蒸干氯仿。加水100g溶解，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相。分离出下相，50～60℃烘干，得到金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Zn(II)5.0克。锌离子含量达到0.65mol/mol EOPO。

实施例11

于250毫升三角瓶中加入50g EOPO，分子量为4000，环氧乙烷和环氧丙烷的比例为1.0，磁力搅拌，滴加环氧氯丙烷1.5毫升，搅拌混合均匀，滴加含三氟化硼质量浓度为50％的三氟化硼乙醚溶液3毫升，密封，冰浴，维持搅拌18小时。在冰浴和良好搅拌下，滴加质量浓度为40％的NaOH溶液10毫升，反应6小时。反应液离心，取上清液，50～60℃真空干燥，得到环氧EOPO 49.2克。环氧EOPO溶解于500毫升质量浓度为0.8％的NaOH溶液中，混合均匀，加入IDA 3.5克，控制pH值为9～12，控制温度为45℃，维持搅拌，反应20小时。上述反应液加入硫酸钠50g，混合均匀，静置分相。分离出富含聚合物的上相，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相，分离出下相，得到EOPO-IDA 35.5克。EOPO-IDA溶解于pH4.0浓度为50mM的醋酸钠缓冲液100毫升，加入硫酸铜15g，室温，保持搅拌5小时。用2倍体积的氯仿萃取2次，合并氯仿相，蒸干氯仿。加水500g溶解，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相。分离出下相，50～60℃烘干，得到金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Cu(II)28.2克。铜离子含量达到0.74mol/mol EOPO。

实施例12

于250毫升三角瓶中加入50g EOPO，分子量为4000，环氧乙烷和环氧丙烷的比例为0.5，磁力搅拌，滴加环氧氯丙烷1.5毫升，搅拌混合均匀，滴加含三氟化硼质量浓度为50％的三氟化硼乙醚溶液3毫升，密封，冰浴，维持搅拌18小时。在冰浴和良好搅拌下，滴加质量浓度为40％的NaOH溶液10毫升，反应6小时。反应液离心，取上清液，50～60℃真空干燥，得到环氧EOPO 47.5克。环氧EOPO溶解于500毫升质量浓度为0.8％的NaOH溶液中，混合均匀，加入IDA 3.5克，控制pH值为9～12，控制温度为45℃，维持搅拌，反应20小时。上述反应液加入硫酸钠50g，混合均匀，静置分相。分离出富含聚合物的上相，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相，分离出下相，得到EOPO-IDA 34.2克。EOPO-IDA溶解于pH4.0浓度为50mM的醋酸钠缓冲液100毫升，加入硫酸铜15g，室温，保持搅拌5小时。用2倍体积的氯仿萃取2次，合并氯仿相，蒸干氯仿。加水500g溶解，升高温度到60～70℃，分相。取富含聚合物的下相，添加相同体积的水，升高温度到60～70℃，再分相。分离出下相，50～60℃烘干，得到金属螯合亲和配基EOPO-IDA-Cu(II)27.1克。铜离子含量达到0.65mol/mol EOPO。