一种乳源ACE抑制肽的制备方法

摘要

本发明涉及一种乳源ACE抑制肽的制备方法，它以牛乳酪蛋白为原料，采用蛋白酶进行水解，将水解液加热使蛋白酶失活，离心分离得到上清液，经离子交换树脂脱盐处理，然后冷冻干燥，从而制备出高活性可食用的ACE抑制肽产品。采用本发明制备工艺可以直接制得可食用的ACE抑制肽产品，也可以将其制品作为功能因子制成各类食品添加剂，或直接作为食品辅料添加到各类食品中。

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种乳源ACE抑制肽的制备方法。

【背景技术】

血管紧张素转换酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)是一种含锌的二肽羧基肽酶，存在于各种组织的血管内皮细胞或上皮细胞及血浆、尿等体液中，该酶具有肽键专一性，需要阴离子催化，其中氯离子是最有效的激活剂。ACE在人体肾素-血管紧张素系统(Reninangiotensin system，RAS)和激肽释放酶-激肽系统(Kallikrein-kininsystem，KKS)中，对血压调节着重要的作用，ACE虽然有较宽的底物，但最重要的天然底物是血管紧张素I和舒缓激肽，ACE对它们的作用都产生血管收缩活性，易引起血压升高，对人类健康产生极大危害，目前高血压已成为危害人类健康的多发常见疾病。

ACE抑制肽指的是一类具有ACE抑制活性的多肽物质，这些多肽的氨基酸序列和肽链长度各有不同，但都具有类似的功能。ACE具有两个活性的作用位置，分别名为N-区、C-区，这两个活性区域具有几乎相同的功能，只是对不同底物的亲和力有所不同。ACE抑制肽对ACE的亲合度比血管紧张素I或舒张激肽还要强，而且也较不易从ACE结合区释放，从而阻碍ACE催化血管紧张素I水解成为血管紧张素II，以及催化舒缓激肽水解成为失活片段的两种生化反应过程，从而起到降血压作用。

目前对于高血压的治疗，由于药物治法存在副作用，因此天然食物中的降血压功能因子的摄入今后将成为高血压非药物治疗的重要组成部分。牛乳中的酪蛋白含有人体生长发育所必需的氨基酸，是营养丰富的蛋白质，除具有营养功能之外，还具有非常重要的生理功能，是生物活性肽的重要来源；其中酪蛋白源ACE抑制肽以安全性高、无副作用等优点在高血压的防治中具有十分重要作用，已成为国内外科学家们研究的热点。但是有关以酪蛋白为原料进行乳源ACE抑制肽工业化生产并且可以保证其高活性和可食用性的制备技术尚未见报道，因此急需开发出一种可以用于工业化生产高活性可食用乳源ACE抑制肽的制备方法。

【发明内容】

所要解决的技术问题

本发明的目的在于克服上述现有技术缺陷，提供一种可以用于工业化生产高活性可食用乳源ACE抑制肽的制备方法。

技术方案

本发明的目的是这样实现的：以牛乳酪蛋白为原料，采用蛋白酶进行水解，确定水解的最佳工艺参数，并对水解液进行了脱盐精制工艺的研究，建立了ACE抑制肽的工业化生产工艺，即：原料酪蛋白→蛋白酶水解→水解液加热使蛋白酶失活→离心分离得到上清液→离子交换树脂脱盐处理→冷冻干燥→ACE抑制肽产品，从而制备出高活性可食用的ACE抑制肽产品。

本发明一种乳源ACE抑制肽的制备方法如下：

(1)原料酪蛋白制备：选用新鲜牛乳，去除乳脂肪后向乳液中加入浓度为1mol/L的盐酸，将乳液pH值调节至4.6后，离心分离，取沉淀饼用蒸馏水洗涤离心，将沉淀饼冷冻干燥，即得到原料酪蛋白；

(2)蛋白质水解：取上述制备好的酪蛋白，用盐溶液将其溶解至浓度为6～9％，置于恒温水浴中，待达到水解温度45℃时，调节pH值至7±0.05，然后加入酶进行水解，酶用量([E]/[S])为3.5～6％，水解时间为5～7小时，然后在95℃下保温18～25分钟使蛋白酶失活，将水解物离心分离，取上清液备用；

(3)脱盐处理：将上述上清液流经离子交换树脂进行脱盐；

(4)干燥：将脱盐后的液体冷冻干燥即制得ACE抑制肽。

本发明制备乳源ACE抑制肽的具体实施方案如下：

(1)原料酪蛋白的制备：选用新鲜牛乳，去除乳脂肪后向乳液中加入浓度为1mol/L的盐酸，将乳液pH值调节至4.6后，离心分离20～40分钟，优选的离心时间为30分钟，离心分离的转速为3000～5000转/分钟，优选的转速为4000转/分钟，取沉淀饼按上述离心条件用蒸馏水洗涤离心3-6次，优选离心分离5次，将沉淀冷冻干燥，即得到本发明原料酪蛋白。

(2)蛋白质水解：取上述制备好的酪蛋白，用盐溶液将其溶解至浓度为6～9％，优选浓度为7.5％，置于恒温水浴中待达到水解温度45℃时，调节pH值至7±0.05，然后加入酶进行水解，酶用量([E]/[S])为3.5～6％，优选用量为5％，水解过程中不断进行搅拌，水解时间为5～7小时，优选为6小时，然后在95℃下保温18～25分钟使蛋白酶失活，优选酶的失活保温时间为20分钟，将水解物以转速3000～5000转/分钟离心25～35分钟，优选转速4000转/分钟离心30分钟，取上清液备用。

其中所述的盐溶液可以是磷酸盐缓冲液，优选为pH7.4的磷酸盐缓冲液；所述的酶可以是蛋白酶，优选为AS1.398中性蛋白酶。

(3)脱盐处理：上述上清液流经离子交换树脂进行脱盐，水解上清液的流速8～11倍柱体积/小时，优选流速为10倍柱体积/小时。

其中所述的阴阳离子交换树脂可以是强碱性阴离子树脂或弱碱性阴离子树脂和强酸性阳离子树脂或弱酸性阳离子树脂中的任意两种，优选为强酸性阳离子树脂--001*7(732#)强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂和强碱性阴离子树脂--201×7(717#)强碱性I型阴离子交换树脂。

(4)干燥：将脱盐后的液体冷冻干燥即制得ACE抑制肽。

采用本发明方法制备的ACE抑制肽产品为乳白色粉状物，主要是由六肽至十一肽组成，其比例可达到80％以上。这些肽包含混合的短链肽，即平均分子量小于1500的短肽。本发明制备的产品蛋白质含量在90～99％，盐分含量在0～1.6％之间。

通过上述制备工艺可以直接制得可食用的ACE抑制肽产品，也可以将其制品作为功能因子制成各类食品添加剂，或直接作为食品辅料添加到各类食品中。

有益效果

本发明提供了一种可以用于工业化生产高活性可食用乳源ACE抑制肽的制备方法，它是通过食用级酶在温和条件下制备，因而其产品安全性高，无副作用，可以直接食用。经测定其蛋白质含量大于97％，灰分含量为1％左右。采用凝胶过滤色谱测定产品的平均分子量小于1500。从成分分析结果可知，产品的蛋白质含量高，灰分含量较低，说明产品中肽类成分含量高，并且在生产中由于采用离子交换树脂进行脱盐处理，氮损失率较小，脱盐率高，盐分含量能够达到可食用的要求，不会造成ACE抑制活性损失，制得的产品经检测蛋白质含量为97％以上，具有较高的抗血压高活性。以下实验数据可以进一步说明本发明方法生产ACE抑制肽其脱盐率高、活性大(见表1)。

                表1脱盐处理前后ACE抑制活性变化

抑制活性(％)  3kDa超滤液  10kDa超滤液    水解液  脱盐处理前  64.16±1.50^c  56.08±1.56^b  54.49±0.89^a  脱盐处理后  66.74±1.70^c  55.71±1.93^b  55.71±1.19^a

注：a，b，c为在同一列字母中，相同则表示差异不显著，不同则表示差异显著(P＜0.01)

由表1结果可知，3kDa超滤液、10kDa超滤液和水解液进行脱盐处理前后抑制活性差异不显著(P＜0.01)，这表明脱盐处理没有对样品造成抑制活性损失。在ACE抑制肽的工业生产中，利用离子交换树脂进行脱盐，氮损失率较小、脱盐率高，并且不会造成ACE抑制活性损失，是一种可行的产品精制方法。

【具体实施方式】

实施例1：ACE抑制肽的制备

将新鲜牛乳去除乳脂肪后，加入浓度为1mol/L的盐酸，调节乳液pH值为4.6后离心分离，转速为4000转/分钟，离心30分钟后取沉淀用蒸馏水洗涤并按上述条件离心，反复洗涤离心分离5次，将沉淀冷冻干燥后，用pH为7.4的磷酸盐缓冲液将其溶解至浓度为7.5％，然后置于恒温水浴中待达到水解温度45℃时，调节pH值到7±0.05，然后加入AS1.398中性蛋白酶进行水解，酶用量([E]/[S])为5％，同时在水解过程中不断进行搅拌，水解时间6个小时，然后在95℃下保温20分钟使蛋白酶失活，将水解物以转速4000转/分钟离心30分钟，取上清液使其流经离子交换树脂进行脱盐，水解上清液的流速为10倍柱体积/小时，将脱盐后的液体冷冻干燥即制得ACE抑制肽，经测定其蛋白质含量在90％以上，盐分在1.6％以下。