法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2012-05-16
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12P19/44 授权公告日:20060614 终止日期:20110301 申请日:20040301
专利权的终止
2006-06-14
授权
授权
2005-03-09
实质审查的生效
实质审查的生效
2005-01-05
公开
公开
技术领域
本发明属于生物化工领域,涉及红景天苷的制备方法,具体涉及红景天苷酶法合成及纯化工艺。
红景天苷,或称为红景天甙,是红景天植物中被研究得最多的主要有效成分,具有抗缺氧、抗疲劳、抗微波辐射、兴奋中枢神经等药理作用,因此作为营养保健品和药品,红景天苷有很好的应用前景(环境适应药物)。目前,主要是通过提取的方法从红景天属植物根茎中分离得到红景天苷,一般过程为:根茎浸泡、醇回流提取、有机溶剂萃取、吸附树脂和硅胶柱层析。步骤复杂,一般提取产率在0.4%~0.8%。化学合成红景天苷的过程主要有:用过量的酪醇经过成甙、脱乙酰基合成了红景天苷;以对羟基苯乙酸乙酯为原料经苄基化、还原、甙化和脱苄基等步骤合成了红景天苷;以对溴苯酚为原料经烯丙基化、环氧化、甙化和脱烯丙基等步骤合成了红景天苷;以对羟基苯乙酸为原料,经过苄基化、酯化、还原、甙化等步骤合成红景天苷。总之,化学合成步骤较多,必须经过羟基保护与脱保护步骤。近年来人们开始利用微生物或酶进行天然产物的生物催化合成或修饰。由于生物催化反应过程简单、条件温和、操作方便,环境污染小,能得到单一立体构型的化合物而成为许多科技人员关注的课题。目前,与红景天苷酶促合成直接相关的公开报道很少,只有一篇文献涉及了这方面的技术:Tetrahedron Asymmetry 1999,10:2429-2439公开了一种采用杏仁β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase from almond,Sigma G-0395)催化转葡萄糖苷化反应合成了一系列天然β-葡萄糖苷包括红景天苷的方法。但该方法采用价格昂贵的活性葡萄糖苷(如对硝基苯基葡萄糖苷)作为葡萄糖基供体,且大部分的活性葡萄糖苷发生水解反应,不能回收,合成成本很高,不适合工业化应用。
综上所述,现有的酶促合成红景天苷的技术,采用价格昂贵的商品酶和糖基供体,成本很高,因此限制了这种方法在工业上的推广应用。
本发明需要解决的技术问题是公开一种天然产物红景天苷的有效酶促合成方法,以克服现有技术的上述缺陷。
本发明的构思是这样的:
发明人发现,苹果籽粉作为一种葡萄糖苷酶,在催化性能上与杏仁β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase from almond,Sigma G-0395)相当,而且制备容易、价格低廉,稳定性高(因苹果籽本身实际上充当了固定化材料)。因此以自制苹果籽粉作为酶促糖苷化反应的催化剂可以使生产成本大幅降低。
由于酶的活性受到体系中缓冲溶液种类与pH的影响,因此发明人在反应体系中选择合适的缓冲溶液及pH能提高反应的速度;
由于酶反应的底物(酪醇)为固体,在水中溶解性有限,因此有必要在反应体系中加入一种助溶剂改善底物的分散状况,提高其在反应体系中的溶解度,以加快酶反应的速度;
由于葡萄糖与酪醇缩合成糖苷的反应(又称糖苷逆水解反应)受到热力学平衡的控制,因此发明人通过调节体系中的水含量,使反应在低水含量中进行,并适当提高底物酪醇的浓度,能显著提高红景天苷的平衡产率。
根据以上构思,发明人提出了如下所述的实现本发明的技术方案:
(1)本发明的方法包括如下步骤:
将苹果籽粉、底物葡萄糖和酪醇(对羟基苯乙醇)在含有缓冲溶液的有机溶剂中反应,反应的工艺条件是这样的:
所说的苹果籽粉为采用一般的苹果籽去皮、磨碎后的产物,苹果籽粉的加入量为1~100g/L;
所说的有机助溶剂,经过优选可采用二氧六环、叔丁醇、乙腈、丙酮、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺中的一种;
反应温度为20~70℃,最佳温度为50~60℃;
反应时间为1~5天,具体可根据反应的实际进程而定;
缓冲溶液的pH为4~8,最佳pH为5.5~6.5;
葡萄糖浓度:0.01~0.50M,最佳浓度为0.2~0.3M;
葡萄糖与酪醇的摩尔比为:葡萄糖∶酪醇=1∶(1~15),最佳比例1∶(5-10);
体系中有机溶剂的体积含量为0~100%(v/v),最佳含量为80~99%(v/v)。
(2)采用常规的分离方法,如萃取和柱层析等,能从反应液中收集本发明所提到的产品--红景天苷和未反应的酪醇。
采用本发明所公开的酶促工艺,不仅能简单方便地获得高纯度的红景天苷,而且生产成本比现有的技术低得多,是一种具有广泛应用前景的生产方法,可以满足迅速发展的医药工业的需要,以下将通过实施例对本发明的技术内容作进一步的描述。
具体实施方式
实施例1
苹果籽粉的制备:将苹果籽去皮、磨碎,先用乙酸乙酯洗3次,再用丙酮洗2次除脂除水,置于真空干燥箱干燥。从28kg苹果总计能得到8g苹果籽粉,可置4℃冰箱冷藏待用。
实施例2
在50ml磨口三角瓶中依次加入250mg苹果籽粉,0.272g(1.37mmol)葡萄糖,0.5ml磷酸缓冲液(0.07M Na2HPO4-KH2PO4,pH 6.0),2.28g酪醇(16.5mmol),5.0ml二氧六环,塞紧磨口瓶塞,并用生料带封口,在50℃、160r/min的旋转式摇床上振荡反应120h。
反应结束后加入甲醇10ml过滤除去酶,滤出的酶再用甲醇洗涤(20ml×3),在滤液中加入无水硫酸钠干燥,旋转蒸发除去溶剂,快速柱层析(乙酸乙酯/甲醇=13/1),得红景天苷固体66mg,产率15.8%。
实施例3
250ml磨口三角瓶中加入2.16g(10mmol)葡萄糖、4ml缓冲液(0.07MNa2HPO4-KH2PO4,pH 6.0)和16.7g(0.11mol)对羟基苯乙醇,再加2g苹果籽粉和40ml二氧六环,塞紧磨口瓶塞,并用生料带封口,置50℃、160r/min旋转式摇床上反应5天。反应过程中用HPLC法测定产物红景天苷的浓度:取反应样品液0.04ml,加入0.10ml对硝基苯酚(0.5mM)的甲醇溶液与0.86ml甲醇混合均匀,然后用反相HPLC柱,分析产物红景天的浓度。色谱柱用YWS C-18(Merck,200×5.0mm,10μ);流动相为甲醇/水(40/60,v/v,0.8ml/min);紫外检测器波长275nm。糖苷、内标和底物的出峰时间分别为4.0、5.7和17.6min。
反应结束后加入甲醇20ml过滤除去酶,滤出的酶再用甲醇洗涤三遍(20ml×3),滤液旋转蒸发除去溶剂。剩下的固体加入200ml乙酸乙酯与100ml去离子水溶解,倒入分液漏斗振荡,静置分层,乙酸乙酯相再用100ml去离子水反萃一遍。合并水相,并用100ml乙酸乙酯萃取一次,合并乙酸乙酯相,旋转蒸发除去溶剂即得到未反应的大部分底物酪醇。将水相旋转蒸发除去水,干燥后进行快速柱层析(乙酸乙酯/甲醇=12/1),得红景天苷固体0.51g,产率15.5%。
实施例4
采用实施例2相同的方法,并采用5.0ml叔丁醇为有机溶剂,结果得红景天苷固体58mg,产率13.9%。
实施例5
采用实施例2相同的方法,但是不加有机溶剂,结果得到红景天苷18mg,产率4.3%。
机译: 一种信息存储酶的酶促合成方法
机译: 非天然存在的β-糖苷酶变体,重组多核苷酸,载体,宿主细胞,产生至少一种非天然存在的β-糖苷酶变体以将糖基-受体底物转化为β-糖基化产物并用于底物的转糖基化的方法,以及,组成。
机译: 编码多肽的核酸片段显示出腈加氢酶的活性,重组质粒DNA的质溶性DNA PPCL 4编码多肽的乙状芽胞杆菌菌株的乳酸化,是一种酶促酶解的产物