微流控生物催化技术酶促合成天然产物的增效机理研究

摘要

微反应器由于具有传质传热快、反应得率高、操作安全、易于放大等特点，可实现高效快速地酶促反应，在生物催化领域开始崭露头角。然而，利用微反应器进行微流控生物催化技术合成天然药物的研究一直未见报道。因此，本文以酶促合成异槲皮苷和咖啡酸苯乙酯这两种珍稀的天然药物为研究对象，研究在微反应器中连续流和分段流模式的微型生物催化技术及其过程机制，对于高效制备高附加值天然药物具有重要意义。主要研究结果如下：
　　构建了连续流微通道式反应器内橙皮苷酶选择性催化水解芦丁合成异槲皮苷的新方法。研究微通道长度、酶浓度、底物浓度及温度等因素对酶促反应的影响。当芦丁浓度1 g/L、酶浓度0.1 g/mL、温度40℃、流速2μL/min时，异槲皮苷最大得率为98.6％，最大产率为3.23μM/min，酶的表观活化能Ea为4.61 kJ/mol。与间歇式反应器相比，反应时间由10 h骤减至40min，速率提高了16.1倍。
　　基于新颖的“缓冲液-离子液体/溶剂”反应-分离耦合新体系，构建了分段流多通道式微反应器内橙皮苷酶选择性催化水解芦丁合成异槲皮苷的新方法。采用单因素法获得酶促合成异槲皮苷的最优工艺条件：当流速4μL/min、底物浓度2 g/L、酶浓度1 g/L、温度30℃时，异槲皮苷的得率高达100%。与间歇式反应器相比，反应时间由1 h缩短至20 min，速率提高了3倍。这是由于互不相溶的“缓冲液-[Bmim][BF4]/三乙酸甘油酯”两相在微管道内形成塞流，引起传质加剧。与单通道微反应器相比，应用多通道微反应器的单位时间产量由0.076 g/min提高到0.439 g/min，提高了5.7倍。
　　基于转酯化策略，构建了连续流微槽式反应器内脂肪酶催化咖啡酸烷基酯与苯乙醇合成咖啡酸苯乙酯的新方法。在常规间歇式反应器中，筛选出最佳底物和催化剂分别为咖啡酸甲酯和Novozym435；将其应用于微槽式反应器中，探索了酶促合成咖啡酸苯乙酯的工艺条件，进而采用响应曲面法优化获得最适条件：当酯醇摩尔比1:20、温度60℃、流速2μL/min、保留时间2.5 h、咖啡酸甲酯浓度3 mg/mL时，咖啡酸苯乙酯的得率高达93.21%。与传统的间歇式反应器（24 h，66.4%）相比，反应时间缩短至原先的1/10，得率提高了26.8%。
　　利用密度泛函理论（DFT）和反应动力学模型对酶促合成咖啡酸苯乙酯的过程机制进行了初步探索。结果表明，咖啡酸甲酯相对于其他咖啡酸烷基酯而言，具有更长的键长和能量而成为最适的转酯化合成底物；在连续流微槽式反应器内酶促转酯化合成咖啡酸苯乙酯的反应动力学符合Lilly–Hornby模型，当流速为2μL/min时动力学常数km’为14.04 mM；而在间歇式反应器中，酶促酯化和转酯化合成咖啡酸苯乙酯的反应过程均符合醇抑制的乒乓模型。
　　因此，利用微流控生物催化技术酶促合成珍稀天然药物具有常规反应器所无法比拟的过程强化优势，大大提高了产物的时空合成效率，并可通过并行放大来提高产量，对于今后高附加值天然药物的高效酶促合成具有潜在的应用前景。

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第1章 绪论

1. 1微反应器的概述

1. 2 微反应器在生物催化中的应用

1. 3 异槲皮苷的酶促合成

1. 4 咖啡酸苯乙酯的酶促合成

1. 5 研究目的与主要内容

第2章 连续流微通道式反应器内高效酶促合成异槲皮苷

2. 1 引言

2. 2 实验材料与仪器

2. 3 实验方法

2. 4 结果与分析

2. 5 本章小结

第3章 分段流多通道式微反应器内高效酶促合成异槲皮苷

3. 1 引言

3. 2 实验材料与仪器

3. 3 实验方法

3. 4 结果与分析

3. 5 本章小结

第4章 连续流微槽式反应器内高效酶促合成咖啡酸苯乙酯

4. 1 引言

4. 2 实验材料与仪器

4. 3 实验方法

4. 4 结果与分析

4. 5 本章小结

第5章 微流控生物催化技术高效合成咖啡酸苯乙酯的过程机制

5. 1 引言

5. 2 实验材料与仪器

5. 3 实验方法

5. 4 结果与分析

5. 5 讨论

5. 6 本章小结

结论

参考文献

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