蝼蛄脂肪油及其超临界萃取方法

摘要

本发明公开一种蝼蛄脂肪油及其超临界CO

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种动物脂肪油及其提取方法，更具体地说是涉及一种蝼蛄脂肪油及其超临界二氧化碳(CO₂)萃取方法。

背景技术

有关动、植物脂肪油成分的提取方法有：水煮法、水媒分离法、分子蒸馏和减压蒸馏法、金属加合法、萃取结晶法、分盘冷冻压榨法和有机溶剂法等。

采用水煮加热法，因加热时间长、温度高，易使对热不稳定的挥发成分发生变化，如一些不饱和脂肪酸的氧化。水媒分离法，此分离法的明显优点是消除了有机溶剂法造成的高费用和公害，但是这种技术的缺点是得到的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的纯度或级别不如有机溶剂分离法高。分子蒸馏和减压蒸馏法为减少热变性，需用尿素加合物等方法来除去大部分饱和脂肪酸，在得到的产品中必须将其除去；虽然可得到较纯的脂肪酸，但需几步才能达到目标，较费时、费力，增加了生产成本。金属加合法分离需要较低的低温处理，最后还要设法去除金属离子，清除不尽还会造成金属离子污染。萃取结晶法得到脂肪酸纯度较高，在较低的温度下进行，能防止脂肪酸的氧化，但时间较长，不太适用于大规模的工业化生产。分盘冷冻压榨法缺点是，安放盘架和液压机的冷冻室需要数千平方米的面积和庞大的冷却系统，大的设施需要多人操作，劳动强度高，分离速度缓慢，效率低，不能连续操作。有机溶剂法是采用石油醚或乙醚有机溶剂在水浴上加热情况下，进行回流循环提取；由于所采用的有机溶剂如石油醚或乙醚等均为一种低沸点物质，易燃易爆，同时，有机溶剂的使用一方面会污染环境，另一方面有机溶剂有可能在提取物中有残留，会影响提取物在医药上的进一步应用。

药材蝼蛄为蝼蛄科动物蝼蛄(Gryllotalpa africana Palisto et Beauvois)或华北蝼蛄(Gryllotalpa nuispina Saussure)的干燥体，属于动物类药物，安徽毫州药材市场有售。在临床上，蝼蛄主要用于治疗大小便不通、各类水肿；近年来，蝼蛄治疗各种水肿、尿潴溜、肝腹水等症时，均采用以整虫炮制后单方直接使用和配伍用药使用，但是效果不够理想。因此，有关医疗部门迫切希望能够提供一种从蝼蛄体内提取的有效成分直接药用。

目前尚无有关蝼蛄脂肪油成分和制备方法等方面的报道。

发明内容

本发明的目的是公开一种蝼蛄脂肪油及其超临界CO₂萃取方法，以满足医疗领域的需要。

超临界CO₂萃取蝼蛄脂肪油的技术构思是这样的：

一种流体当处在其临界温度和压力状态时，被称为超临界流体。由于超临界流体的密度接近于液体，具有与液体溶剂相当的萃取能力。又具有与气体相当的低粘度，扩散能力比液体要大100倍，因而具有较高的传质性。采用超临界萃取的时候，利用超临界流体的这些性质，使之与待分离的物质相接触穿透基体，从中萃取出目标物质。然后利用降压和/或升温的办法降低其密度，从而降低溶质在其中的溶解度，使被萃取物与溶剂分离。因为不同的物质在相同的萃取条件下溶解度是不同的，因而有可能借助这种差异将它们进一步分开。超临界流体萃取常常选用CO₂等临界温度低且化学惰性的物质为萃取剂，它特别适用于热敏物质和易氧化物质的分离，因此非常适用于对于动物油脂的提取分离。因此，本发明采取该方法，能够制备高纯度的蝼蛄脂肪油。

本发明所说的蝼蛄脂肪油，是这样提取的：把干燥的蝼蛄粗粉放在超临界萃取设备中用CO₂进行萃取，减压后即得蝼蛄脂肪油，室温条件下呈浅黄色透明油状；提取的蝼蛄脂肪油中总脂肪酸的纯度在60～95％，优于其他提取方法；总脂肪酸包括重量百分比为20～45％的油酸、15～30％的亚油酸和5～24％的棕榈酸以及余量的其他组分。

超临界CO₂萃取蝼蛄脂肪油的方法包括如下步骤：

(1)将干燥的蝼蛄粉碎至10～30目后，置于超临界萃取釜中，连续地通入超临界状态下的CO₂进行萃取，优选的条件是CO₂流量10～55kg/h·kg原料、压力5～50Mpa、温度15～75℃、时间0.5～6h；进一步优选的条件是CO₂流量45kg/h·kg原料、压力35Mpa、温度50℃、时间1h；

(2)将萃取了蝼蛄脂肪油的CO₂减压至1～12MPa，即可获得在室温条件下呈浅黄色透明油状的蝼蛄脂肪油，蝼蛄脂肪油中总脂肪酸的纯度在60～95％，萃取物的理化性状和脂肪酸纯度都优于其他提取方法。

萃取条件的选择是通过以下办法实现的：首先选定四因素、三水平，根据正交设计方法，按L9(3⁴)正交设计表安排实验(正交实验设计安排参考郭祖超主编的《医学统计学》，人民军医出版社，1999年第一版)。从正交实验结果，分析得到萃取工艺条件。

对超临界CO₂萃取的蝼蛄脂肪油进行脂肪酸甲酯化后，进行气相色谱—质谱分析。

超临界CO₂萃取蝼蛄脂肪油的制备方法不使用有机溶剂等物质，不会污染环境，也不存在有害溶剂残留等问题，而且操作简便、萃取时间短、产品纯度高，使用的CO₂廉价而且可重复循环使用，工业生产成本低廉。

附图说明

图1为采用超临界CO₂萃取方法制备的非洲蝼蛄脂肪油的气相色谱-质谱分析图谱。

具体实施方式

本发明公开蝼蛄脂肪油及其超临界CO₂萃取的制备方法，超临界CO₂萃取的具体操作步骤如下：萃取釜和解析釜均预先加热至15～75℃，将已粉碎好的干燥药材粗粉(10～30目)放在萃取釜中；打开CO₂钢瓶，调节好CO₂流量，预热CO₂气体向萃取釜中送气，并打开高压泵将萃取釜升压至5～50MPa；CO₂气体经加压、加热后进入萃取釜，到达选定压力时关闭气瓶，稳定压力(5～50MPa)、温度(15～75℃)和流量(10～55kg/h)，将溶解了蝼蛄脂肪油的CO₂减压后进入解析釜，释放出溶解在其中的脂肪油，脂肪油可以从解析釜的底部放出，而气态的CO₂经冷凝器冷凝为液体CO₂回到储罐；循环萃取0.5～6h后，按实验设计的因素和水平，逐步收集解析釜中各个因素、水平的萃取物脂肪油，并称重。对蝼蛄脂肪油中总脂肪酸进行多次测定，实验结果表明：蝼蛄脂肪油中总脂肪酸包括重量百分比为20～45％的油酸、15～30％的亚油酸和5～24％的棕榈酸以及余量的其他组分。

下面通过实施例，对本发明作进一步说明。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。

实施例1、蝼蛄脂肪油超临界流体萃取工艺条件的选择方法

选择萃取条件的具体办法如下：选定四因素、三水平，其中四因素分别是A表示流量(计量单位是kg/h)、B表示温度(计量单位是℃)、C表示压力(计量单位是MPa)、D表示时间(计量单位是h)，A的三水平分别是25、35、45kg/h，B的三水平分别是30、40、50℃，C的三水平分别是20、25、35MPa，D的三水平分别是1.0、1.5、2.0h。

根据正交设计方法，按L9(3⁴)正交设计表安排实验，因素、水平安排见表1。

正交实验结果列表于表2，表中的序号为实验序号，共计9次实验，I、II、III为相应水平所得出料量的总和，K₁、K₂、K₃分别为I、II、III的平均值，R离差值。由表2可知，萃取流量、温度、压力和时间的离差值R分别是3.16、4.89、13.77、4.17，表明影响萃取的因素中，各个因素的影响顺序为：压力＞温度＞时间＞流量。其中，萃取压力对蝼蛄脂肪油萃取率的影响最大。因此，优化的萃取条件是压力5～50MPa(千帕)、温度15～75℃(度)、时间0.5～6h(小时)；最优化的萃取工艺条件为A₃B₃C₃D₁，即压力35MPa、温度50℃、时间1h、流量45kg/h。

                    表1、因素、水平表

水平    A            B            C           D

     流量(kg/h)    温度(℃)    压力(MPa)    时间(h)

1       25           30           20          1.0

2       35           40           25          1.5

3       45           50           35          2.0

                   表2、正交实验结果

序号   A       B       C       D       X(％)

1      1       1       1       1       12.5

2      1       2       2       2       15.1

3      1       3       3       3       24.3

4      2       1       2       3       19.5

5      2       2       3       1       21.6

6      2       3       1       2       18.7

7      3       1       3       2       23.6

8      3       2       1       3       16.1

9      3       3       2       1       22.4

I      51.9    55.6    47.3    69.0

II     59.8    52.8    57.0    57.4

III    62.1    65.4    69.5    59.9

K1     17.3    18.5    15.8    23.0

K2     19.9    17.6    19.0    19.1

K3     20.7    21.8    23.2    20.0

R      3.16    4.89    13.77   4.17

实施例2、非洲蝼蛄脂肪油的超临界CO₂萃取制备方法

取购于安徽毫州药材市场的非洲蝼蛄500克，干燥后用粉碎机粉碎成20目的粗粉。采用HA-230-50-03型超临界萃取装置(南通华安超临界实业公司生产，包括CO₂钢瓶、冷冻系统、加热系统、高压泵、2.5L萃取釜和解析釜等)。萃取釜和解析釜均预先加热至50℃时，将药材粗粉投入萃取釜中，打开CO₂钢瓶，调节CO₂流量至45kg/h，向萃取釜中送气，并打开高压泵将萃取釜升压至35MPa，CO₂气体经加热、加压后进入萃取釜；稳定压力、温度和流量，循环萃取1.0h后，收集解析釜中的萃取物，称重为125.59g，萃取率[萃取率X的计算公式：萃取率X(％)＝萃取物重量(g)/原料重量(g)×100％]为25.11％，蝼蛄脂肪油在室温条件下呈浅黄色透明油状，测定蝼蛄脂肪油中总脂肪酸的含量为83.29％(测定方法见下)。

测定非洲蝼蛄脂肪油中总脂肪酸含量的具体方法如下：称取5.0克的非洲蝼蛄脂肪油样品置于300ml锥形烧瓶中，加入50ml中性异丙醇，回流15分钟，取下锥形烧瓶，加入1％酚酞乙醇液2～3滴，以0.1mol/L氢氧化钾(KOH)滴定至微红色、且30秒不褪色为终点，共消耗5.498毫升。

非洲蝼蛄脂肪油中总脂肪酸含量的计算公式是：非洲蝼蛄脂肪油中总脂肪酸含量％＝M×V×(56.1/2)×G，式中M是KOH的摩尔浓度(mol/L)；V是滴定所消耗的KOH毫升数(ml)，G是非洲蝼蛄脂肪油的样品重量(克)。实际测定的计KOH的摩尔浓度M是0.10801mol/L，计算结果非洲蝼蛄脂肪油中总脂肪酸的纯度为83.29％。

对脂肪油样品进行甲酯化：取适量脂肪油与20％的氢氧化钾乙醇溶液适量，混匀，于水浴回流约3h，至完全皂化，加适量水，以石油醚除去不皂化物，再以浓盐酸中和至中性pH，进行分离，并将分离物以水洗至中性，干燥，以甲醇、盐酸制备脂肪酸甲酯为供试样品，用气相色谱—质谱联用仪进行分析。

采用气相色谱—质谱联用仪对非洲蝼蛄脂肪油中的总脂肪酸进行成分分析，具体内容如下：检测仪器是美国Finnigan(公司)Voyager气相色谱-质谱联用仪，检测条件是色谱柱用DB-5石英毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)；柱温150℃(保持2min)～300℃(保持5min)，其升温速度是10℃/min；汽化温度是250℃；进样量0.5μl；载气(流量)He(1.0ml/min)；分流比100/1；质谱检测器采用EI源，电子能量70Ev，源温200℃；质谱标准库采用NIST库(质谱化合物标准库)；计算方法是面积规一化法。气相色谱-质谱分析图谱结果见图1。

对图1进行分析的结果见表3，可以看到主要成分有油酸甲酯、十六烷酸甲酯、9，12-十八碳二烯酸甲酯、油酸乙酯、9-十六碳烯酸甲酯等，其中不饱和脂肪酸约占脂肪酸总量的69.92％；且油酸所占比重较大，占42.16％；即非洲蝼蛄脂肪油中总脂肪酸的组成中具有较高含量的油酸、亚油酸和棕榈酸，共占78.86％，其三个主要组分的含量分别是42.16％、16.52％、20.16％。

萃取所得的脂肪油样品，虽然可以直接应用气相色谱—质谱联用仪进行总脂肪酸的测定，但是很多的组分由于结构类似，相差一个或者几个双键或者是1～2个甲基，在气相色谱—质谱图谱上很难分辨出来，往往形成混合峰，导致可以观察到的成分种类减少，掩盖了实验的真实性。采用脂肪油酯化如甲酯化的方法，可以将成分之间的差异性放大，使保留时间表现出较大的差别性，将所含有的组分充分显示出来。所以，本实施例采用酯化的办法，改进脂肪油的测定方法。

               表3、非洲蝼蛄脂肪油进行甲酯化后的组成分析

  峰号                      化合物  保留时间    (min)  相对含量    (％)    1 十二烷酸甲酯Dodecanoic acid，methylester    4.951    0.39    2 十二烷酸乙酯Dodecanoic acid ethylester    5.693    0.17    3 十四烷酸甲酯Tetradecanoic acid，methyl este    7.11    1.27    4 十四烷酸乙酯Tetradecanoic acid，ethylester    7.835    0.44    5 9-十六碳烯酸甲酯9-Hexadecenoic acid，methylester    9.010    7.77    6 十六烷酸甲酯Hexadecenoic acid，methylester    9.218    14.19    7 9-乙基十六碳烯酸9-Hexadecenoate，Ethyl    9.685    2.87    8 十六烷酸乙酯Hexadecenoic acid，ethylester    9.877    5.97    9 9，12-十八碳二烯酸甲酯8，11-Octadecadienoic acid， methylester    10.855    11.99    10 油酸甲酯9-Octadecenoic acid，methylester    10.952    30.40    11 十八烷酸甲酯Octadecanoic acid，methylesterr    11.144    5.30    12 9，12-十八碳酯二烯酸乙酯9，12-Octadecadienoic acid， ethylester    11.494    4.53    13 油酸乙酯9-Octadecenoic acid，ethylester    11.544    11.75    14 十八烷酸乙酯Octadecanoic acid，ethylester    11.752    2.34    15 5，8，11，14-四烯二十碳烯酸甲酯5，8，11，14-Eicosatetraenoic acid，methylester    12.386    0.21    16 9-二十三烯9-Tricosene    12.919    0.39

与传统的其他动物脂肪油提取溶剂萃取相比，超临界CO₂萃取方法特别适用于挥发油、极性比较低等热敏性成分的提取，具有以下一些特殊的技术优点：

①超临界CO₂萃取的萃取分离能力的大小取决于流体的密度，而后者很容易通过调节温度和压力来加以控制，被萃取物也是通过降压或升温的办法与萃取剂分离，因此操作非常简便。

②超临界CO₂萃取通常使用CO₂作为萃取剂，CO₂价廉、易得、无毒、安全，并且可以循环使用，可以大大降低成本。

③一般不需要在高温下操作，而且与空气、光隔离，特别适合于分离不耐热、易氧化，对光不稳定的物质，比如说动物油脂中的多不饱和脂肪酸。

④一般不使用有毒的有机溶剂，因此可以知道，所得产物中没有有毒的有机溶剂的残留，这个对于医药和食品工业具有特殊的优越性。并且，在萃取过程中没有废物排放不会造成环境污染。

⑤占地面积小，萃取效率高，节省能源。

⑥本发明通过正交设计和9次实验(见实施例1)，对超临界CO₂萃取的萃取参数进行了筛选，计算和推导出优化的萃取条件范围和最优化的萃取条件，从而建立了蝼蛄脂肪油超临界CO₂萃取的新方法。