重组人内皮抑素在大肠杆菌中的高效表达技术

摘要

本发明属于重组人内皮抑素在大肠杆菌中高效表达的技术领域。将人内皮抑素基因其插入原核表达载体pET28b中构建重组表达质粒pBendo，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选出阳性重组菌E.coli BL21－Endo，在含卡那霉素的LB培养液中振荡培养，使菌液OD

说明书

技术领域

本发明属于重组人内皮抑素在大肠杆菌中高效表达的技术。

背景技术

内皮抑素是哈佛大学O′Reilly MS在1997年的Cell杂志第88卷第2期277～285页的文章中提出发现的一种新的血管生成抑制因子，与传统抗肿瘤药物相比较，内皮抑素通过抑制肿瘤相关的新血管的生成来阻断肿瘤组织的血液供应，从而发挥抑制肿瘤生长与转移作用。内皮抑素抑制的靶细胞是血管内皮细胞而不是肿瘤细胞本身，所以有广泛的抗癌谱，且反复用药不会引起耐药性的产生。目前内皮抑素的原核表达主要采用大肠杆菌表达系统，曲建在上海大学学报(自然科学版)2000年第六卷第四期338-342页的文章中提出，利用pSQE载体转化大肠杆菌BL21(DE3)进行内皮抑素的表达，重组蛋白的表达量达菌体总蛋白的30％。

应用内皮抑素治疗肿瘤，疗程长且用量大。对于现在采用的内皮抑素蛋白原核表达体系，重组蛋白的表达效率还有待提高，最多不超过菌体总蛋白的30％，难以满足临床应用的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组人内皮抑素在大肠杆菌中的高效表达技术。

本发明通过建立合适的诱导表达条件在较短的周期里表达出大量的重组蛋白质，提高内皮抑素的产量，以利于降低生产成本及产品价格，促进内皮抑素在临床的普遍应用。

本发明选择IPTG诱导表达技术实现人内皮抑素基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达。从胚肝组织中提取肝细胞总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术获得人内皮抑素基因，将其插入原核表达载体pET28b中构建重组表达质粒pBendo，然后转化表达型大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选出阳性重组菌E.coli BL21-Endo，采用新的诱导表达条件进行重组蛋白的表达。

本发明将重组质粒pBendo转化表达型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，筛选出阳性重组菌E.coli BL21-Endo，接种于2mL、含60～90μg/mL卡那霉素(Kan)的LB培养液中，LB培养液的组分是1％胰化蛋白胨、0.5％酵母提取物和1％NaCl。在细菌培养箱中，35～38℃，180～220rpm振荡培养12～16h，然后将菌液接种于200mL、含60～90μg/mL Kan的LB培养液中，36～38℃，200～250rpm振荡培养2～3h，使菌液OD_600nm在0.4～0.6，向菌液中加入终浓度为0.8～1.0m mol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，在36～37℃下，180～200rpm继续振荡培养3～5h诱导内皮抑素的表达，表达量达到菌体总蛋白的38％。

采用新的大肠杆菌表达条件，实现重组蛋白表达量达到菌体总蛋白的38％，高于已报道的方法。

具体实施方式

实施例1：将重组质粒pBendo转化表达型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，筛选出阳性重组菌E.coli BL21-Endo，接种于2mL、含90μg/mL Kan的LB培养液中，在细菌培养箱中，38℃，220rpm振荡培养14h，然后将菌液接种于200mL、含90μg/mL Kan的LB培养液中，38℃，250rpm振荡培养2.5h，使菌液OD_600nm在0.6。向菌液中加入终浓度为1.0m mol/L的IPTG，在37℃下，200rpm继续振荡培养5h诱导内皮抑素的表达。

实施例2；将重组质粒pBendo转化表达型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，筛选出阳性重组菌E.coli BL21-Endo，接种于2mL、含60μg/mL Kan的LB培养液中，在细菌培养箱中，35℃，180rpm振荡培养16h，然后将菌液接种于200mL、含60μg/mL Kan的LB培养液中，36℃，200rpm振荡培养2h，使菌液OD_600nm在0.4。向菌液中加入终浓度为0.8m mol/L的IPTG，在36℃下，180rpm继续振荡培养3h诱导内皮抑素的表达。

实施例3：将重组质粒pBendo转化表达型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，筛选出阳性重组菌E.coli BL21-Endo，接种于2mL、含70μg/mL Kan的LB培养液中，在细菌培养箱中，37℃，200rpm振荡培养12h，然后将菌液接种于200mL、含70μg/mL Kan的LB培养液中，37℃，220rpm振荡培养2.5h，使菌液OD_600nm在0.5。向菌液中加入终浓度为0.9m mol/L的IPTG，在36.5℃下，190rpm继续振荡培养4h诱导内皮抑素的表达。

实施例4：将重组质粒pBendo转化表达型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，筛选出阳性重组菌E.coli BL21-Endo，接种于2mL、含70μg/mL Kan的LB培养液中，在细菌培养箱中，37℃，220rpm振荡培养14h，然后将菌液接种于200mL、含70μg/mL Kan的LB培养液中，36℃，250rpm振荡培养3h，使菌液OD_600nm在0.6。向菌液中加入终浓度为0.8m mol/L的IPTG，在37℃下，200rpm继续振荡培养4h诱导内皮抑素的表达。

实施例5：将重组质粒pBendo转化表达型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，筛选出阳性重组菌E.coli BL21-Endo，接种于2mL、含80μg/mL Kan的LB培养液中，在细菌培养箱中，38℃，180rpm振荡培养12h，然后将菌液接种于200mL、含80μg/mL Kan的LB培养液中，37℃，220rpm振荡培养3h，使菌液OD_600nm在0.6。向菌液中加入终浓度为1.0m mol/L的IPTG，在36℃下，190rpm继续振荡培养5h诱导内皮抑素的表达。

实施例6：将重组质粒pBendo转化表达型宿主菌E.coliBL21(DE3)中，筛选出阳性重组菌E.coli BL21-Endo，接种于2mL、含70μg/mL Kan的LB培养液中，在细菌培养箱中，37℃，200rpm振荡培养16h，然后将菌液接种于200mL、含70μg/mL Kan的LB培养液中，38℃，200rpm振荡培养2.5h，使菌液OD_600nm在0.5。向菌液中加入终浓度为0.9m mol/L的IPTG，在37℃下，200rpm继续振荡培养3h诱导内皮抑素表达。