治疗阿尔茨海默氏症的协同前体药物化合物

摘要

本发明涉及阿尔茨海默氏症协同前体药物化合物或其盐及其制备方法，也涉及含有所述化合物或其盐的药物组合物以及所述化合物或其盐在制备治疗阿尔茨海默氏症的药物中的应用。具体来说，所述化合物是由烟酸和美曲膦酯经酯键偶联形成的，即(1－二甲基磷酰基－2，2，2－三氯)－乙基－1－醇烟酸酯(NMF)。本发明化合物或其盐在治疗阿尔茨海默氏症具有良好的效果。

说明书

                     发明领域

本发明涉及阿尔茨海默氏症协同前体药物化合物及其制备方法，也涉及含有所述化合物的药物组合物以及所述化合物在制备治疗阿尔茨海默氏症的药物中的应用。具体来说，所述化合物是由烟酸和美曲膦酯经酯键偶联形成的，即(1-二甲基磷酰基-2，2，2-三氯)-乙基-1-醇烟酸酯(NMF)。

                        发明背景

阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s disease，简称AD)为老年痴呆症的主要类型，是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病，伴随有性格改变及行为障碍。65岁左右老年人中发病率为10％，85岁以上老年人中发病率为50％。我国目前60岁以上的老年人已达1.3亿，AD患者在1300万左右，且数量随老龄化趋势不断上升，而可供临床使用的治疗药物的类别、数量较少，疗效亦不甚理想。随着计划生育政策的逐步贯彻落实，一对中年夫妇家庭将有四个老人需要照顾及赡养；而AD患者较其他老年性疾病更需要别人的看护和照顾，这对家庭和社会的巨大的压力是显而易见的。

由于阿尔茨海默氏症(AD)的病因及病理机制尚不完全清楚且相当复杂，因而可着手研究的角度及治疗方案较多，其中Metrifonate(美曲膦酯)是由Bayer公司开发的一个原本较有前途的AChE抑制剂。该药作为抗血吸虫及钩虫药已有三十多年的历史，副作用轻微、耐受性好，一直被列为WHO的基本药物(essential drug)，其作为阿尔茨海默氏症治疗药申请上市属老药增加新的适应症。该药本已完成III期临床试验，显示其对患者的认知功能和行为障碍均有改善，并已向美国FDA及欧盟EMEAD提交上市申请，但由于在1998年的后续III期临床试验中发现服用本品的3000例患者中有20多例发生肌肉虚弱，虽然Bayer公司随后找到了原因及解决办法，但美国仍未给予批准。

研究表明烟酸缺乏是老年性痴呆临床常见的因素之一。烟酸是维生素B族中最稳定的维生素，在体内迅速转化为烟酰胺，然后成为辅酶I与辅酶II的组成部分，参与体内葡萄糖的酵解、脂类代谢、丙酮酸代谢、戊糖合成以及高能磷酸键的形成等，具有广泛的生理活性，如扩张血管、调节血脂等作用。长期应用烟酸能减少冠心病、心肌梗死及其他心脑血管疾病的发生率或死亡率，但由于烟酸所需要的治疗剂量较大(3-6g/天)，且易产生面部潮红、瘙痒、诱发溃疡病、加重糖尿病及痛风等副作用，限制了其临床应用。

为了增强药物的活性，减少毒副作用，在采用前体药物设计原理和结构拼合原理的基础上，我们合成了(1-二甲基磷酰基-2，2，2-三氯)-乙基-1-醇烟酸酯(NMF)，它包含了两个母体药物美曲膦脂和烟酸的全部化学结构，在体内可被酶水解为两个独立的母体药物，协同发挥药理效应，从而成为一种协同前药(Mutual Prodrug)，发挥双重、协同的药理作用并达到长效、缓释且降低毒性的目的。

                  发明内容

为此，本发明的一个目的是提供一种下式I所示的治疗阿尔茨海默氏症的药物化合物或其盐：

本发明化合物的分子式：C₁₀H₁₀Cl₃NO₅P＝362.5

本发明化合物的理化性质：MP 88.4-88.8℃；不溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、稀酸。

显而易见的是，本发明化合物中存在有手征性碳原子，因此，具有光学异构体。消旋体和光学异构体均包含在本发明的范围之中。本发明的化合物可以是无定型粉末或者是晶体形式。

本发明所述盐是式I化合物的无机酸盐或有机酸盐，例如包括但不限于盐酸盐、硝酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐等。优选为盐酸盐、硫酸盐或柠檬酸盐。

本发明的另一目的是提供所述化合物或其盐的合成方法。本发明的合成方法是多种多样的。一般来说，本领域中能够将羧基和羟基酯化的方法均可用于本发明化合物的合成。具体来说，本发明是通过将烟酸中的羧基与美曲膦酯中的羟基进行酯化而进行的。酯化方法包括但不限于酰氯法、活性酯的方法或者混合酸酐法。合成方案例举如下：

合成方案1：酰氯法

合成方案2、3：活性酯的方法

合成方案4：混合酸酐法

本发明化合物的盐通常是由本发明化合物中的碱性氮与酸发生成盐反应得到的。所述酸通常可以是具有酸性的任何物质。例如包括但不限于无机酸如盐酸、硝酸、硫酸、氢溴酸、磷酸等，有机酸如甲酸、乙酸、苯甲酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸等。

本发明的化合物或其盐还可以与二氢吡啶或其他药物分子或酶底物等通过化学键偶联组成靶向药物，如脑靶向药物。

本发明的再一个目的是一种治疗阿尔茨海默氏症的药物组合物，其中含有治疗有效量的本发明式I化合物或其盐和可药用载体。所述的可药用载体是对本发明化合物或其盐不产生不利影响的在药物领域可以使用的任何赋型剂、稀释剂或添加剂。可以根据所期望的给药途径而制备的具体剂型来选择使用的载体。本发明的化合物或其盐可以通过口服或非胃肠道给药。非胃肠道给药可包括注射、吸入、透皮或直肠给药。所述药物组合物的剂型包括但不限于片剂、胶囊、悬浮剂、溶液剂、脂质体、微球或者栓剂等。所述载体可例举的是黏合剂、崩解剂、润滑剂、等渗剂、表面活性剂、防腐剂、甜味剂、香味剂、着色剂等，例如淀粉、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、环糊精、硬脂酸镁、磷脂、胆固醇、玉米油等。本发明化合物或其盐在组合物中的含量可以在很大的范围内变化，只要能够达到治疗的目的并便于药物制剂的制备和患者的使用。例如，按组合物的重量计算，含有0.1-99.9％的本发明化合物或其盐。优选1-99％。另外，本发明的组合物还可以含有其他可以与本发明化合物或其盐联合给药的其他活性成分，例如有利于阿尔茨海默氏症治疗的活性成分如AChE抑制剂。特别需要指出的是，烟酸和美曲膦酯的物理组合产品实现本发明的目的也是完全可以的，也应当包含在本发明的范围之内。两个组分之间的配比的选择对本领域技术人员来说也是显而易见的，例如，按重量计算，烟酸和美曲膦酯配比为1∶20-20∶1。所述的物理组合产品可以是组合配制在一起的药物制剂或者是分别配制但包装在一起的药盒。

本发明的药物组合物可通过常规方法来制备，例如将组合物的各组分进行混合，或者按照本领域常规方法按一定顺序混合来制备。如在制备片剂时，可以将活性组分与黏合剂混合制粒，加入崩解剂和润滑剂并压制成片。这对于本领域技术人员来说是公知的。

本发明的另外一个目的是提供式I化合物或其盐或者烟酸和美曲膦酯的物理组合产品在制备治疗阿尔茨海默氏症的药物中的应用。正如本说明书中所证实的那样，本发明的化合物或其盐具有良好的治疗阿尔茨海默氏症的作用。给药途径是多种多样的，如口服、注射、吸入等。给药剂量可以在很大的范围内变化，这取决于给药的途径、患者的身体状况、年龄、性别等。一般来说，本发明化合物或其盐的给药剂量为0.1-100mg/天，kg体重，优选1-50mg/天，kg体重，更优选10-30mg/天，kg体重。

体外细胞学实验证实NMF可显著促进原代培养胎鼠皮层神经元活性，增加神经细胞存活数量，且对抗兴奋性氨基酸海人藻酸所致神经损伤。体内动物试验结果表明，NMF能够显著改善东莨菪碱所致记忆认知障碍大、小鼠的认知能力，药效强于美曲膦酯；NMF可明显改善D-半乳糖所致衰老小鼠的若干衰老指标，使之恢复至接近正常水平或不再向衰老方向发展。综上所述，NMF可应用于治疗阿尔茨海默氏症，药效强于美曲膦脂，且毒副作用小。

                      具体实施方案

简写注释：

NMF：(1-二甲基磷酰基-2，2，2-三氯)-乙基-1-醇烟酸酯

DCC：二环己基碳二亚胺

DMF：N，N’-二甲基甲酰胺

TEA：三乙胺

CDI：1，1’-羰基二咪唑

DMAP：4-二甲氨基吡啶

AD：阿尔茨海默氏症

                           实施例1

酰氯法制备(1-二甲基磷酰基-2，2，2-三氯)-乙基-1-醇烟酸酯(NMF)

在干燥无水条件下，装好干燥装置及气体吸收装置，将8mL氯化亚砜加入反应瓶中，用冰水浴冷却到0℃左右，搅拌，向其中加入0.8g(6.5mmol)烟酸，并滴入5-7滴无水DMF，油浴缓慢升温至77℃左右回流，3h后减压蒸除过量氯化亚砜，得烟酰氯盐酸盐(浅黄色固体)。冰盐浴下向干燥的反应瓶中加入适量无水二氯甲烷，强烈搅拌，先后滴加10mL无水TEA和1.7g(6.6mmol)美曲膦酯的20mL二氯甲烷溶液，反应3h，滤过，滤液减压浓缩后加入适量乙酸乙酯，依次用水、0.1N HCl、饱和NaHCO₃、饱和食盐水洗3次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，快速柱层析(硅胶H，洗涤液：石油醚-丙酮)，得(1-二甲基磷酰基-2，2，2-三氯)-乙基-1-醇烟酸酯1.2g(浅黄色固体)，石油醚-丙酮混合溶剂重结晶得无色块状晶体。产率：51.0％。

                        实施例2

               DCC/DMAP法(活性酯的方法)制备NMF

2.46g(0.02mol)烟酸和5.15g(0.02mol)美曲膦酯室温下溶于干燥的120mL DMF中，加入0.30g(0.002mol)DMAP，搅拌均匀。于0-5℃滴加6.19g(0.03mol)DCC的50mL DMF溶液，室温搅拌过夜，过滤，减压浓缩，加入适量乙酸乙酯，过滤，依次用水、0.1N HCl、饱和NaHCO₃、饱和食盐水洗3次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，快速柱层析(硅胶H，洗涤液：石油醚-丙酮)，得(1-二甲基磷酰基-2，2，2-三氯)-乙基-1-醇烟酸酯4.70g(浅黄色固体)，石油醚-丙酮混合溶剂重结晶得无色块状晶体。产率：65.0％。

                           实施例3

              CDI/DMAP法(活性酯的方法)制备NMF

0.62g(5mmol)烟酸溶于干燥的25mL DMF溶液中，快速加入0.81g(0.002mol)CDI和0.08g(0.5mmol)DMAP，于0-5℃搅拌反应1h。滴加1.29g(5mmol)美曲膦酯的25mL DMF溶液，室温搅拌过夜，减压浓缩，加入适量乙酸乙酯，过滤，依次用水、0.1N HCl、饱和NaHCO₃、饱和食盐水洗3次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，快速柱层析(硅胶H，洗涤液：石油醚-丙酮)，得(1-二甲基磷酰基-2，2，2-三氯)-乙基-1-醇烟酸酯1.26g(浅黄色固体)，石油醚-丙酮混合溶剂重结晶得无色块状晶体。产率：70.0％。

                         实施例4

                    混合酸酐法制备NMF

冰盐浴下将1.0g(8.12mmol)烟酸、适量二氯甲烷和TEA依次加入反应瓶，缓慢滴加1.1mL(8.59mmol)无水苯磺酰氯，保持0℃搅拌反应1h。缓慢滴加2.50g(9.71mmol)美曲膦酯溶于适量二氯甲烷和TEA的混合溶液，室温搅拌反应3h，减压浓缩，加入适量乙酸乙酯，过滤，依次用水、0.1N HCl、饱和NaHCO₃、饱和食盐水洗3次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，快速柱层析(硅胶H，洗涤液：石油醚-丙酮)，得(1-二甲基磷酰基-2，2，2-三氯)乙基-1-醇烟酸酯2.2g(浅黄色固体)，石油醚-丙酮混合溶剂重结晶得无色块状晶体。产率：74.4％。IR(KBr，v)：3081，1745，1267，1049；¹HNMR(CDCl₃，δ)：9.31(s，1H，PyC₂-H)，8.84(d，1H，PyC₆-H)，8.38(d，1H，PyC₄-H)，7.46(t，1H，PyC₅-H)，6.12(d，1H，CH)，3.85(q，6H，OCH₃)；EI-MS(m/z)：362(M⁺).纯度：99.0％(HPLC测定)。

                            实施例5

     NMF对体外培养正常胎鼠皮层神经元活性的影响

取怀孕15天的正常昆明小鼠，引颈脱臼处死，以碘酒和75％酒精消毒，在无菌条件下分层解剖，取出胚胎小鼠，置于冰浴的解离液D₁-SGH(D₁为无钙离子的PUCK液，SGH为蔗糖-葡萄糖溶液和HEPES缓冲液)。体视显微镜下解剖分离出胎鼠大脑皮层，剔除血管和被膜，粗略剪成1mm³碎块，用80mg/L Dnasel作用10min，然后用火焰刨光的细口径滴管轻柔吹打组织团块，使其充分分散，静置后吸取上层细胞悬液。离心后用含血清培养基(含10％胎牛血清的DF₁₂)将细胞密度调至为1.0×10⁶个/mL，接种于预先包被PLL的96孔板中，每孔100μL，于37℃，5％的CO₂孵育箱中培养。神经细胞接种后的第3天，每孔加入50μL不同浓度的NMF的DF₁₂液(终浓度依次为10μmol L^-1，1μmol L^-1，0.1μmol L^-1，10nmol L^-1，1nmol L^-1，0.1nmol L^-1)，对照组加入等体积的DF₁₂。继续培养3天，每孔加入MTT(Sigma)15μL(1.5g L^-1)，37℃孵育4h，镜下观察紫色针状结晶，小心弃去上清，每孔加入DMSO 100μL，室温下放置10min，待镜下紫色结晶全部溶解后，以Dynatech MR400EL ISA读数仪测定MTT光吸收值，检测波长570nm，参考波长630nm。同法NMF分别与母体药物烟酸、美曲膦酯对比。结果均经SPSS 10.0软件One-wayANOVA(单因素方差分析)检验。与对照组相比，各剂量组的NMF均能显著促进正常胎鼠皮层神经元活性，其中1μmol L^-1，0.1μmol L^-1，10nmol L^-1的NMF促进活性增殖率分别高达34.7％、37.4％、36.7％(见表1)。相反，美曲膦酯抑制正常小鼠皮层神经元活性(见表2)，而烟酸则对正常胎鼠皮层神经元活性无影响(见表3)。以上结果提示NMF能显著促进正常是皮层神经元活性。

表1  NMF对正常胎鼠皮层神经元活性的影响(n＝10，x±s)

组别吸光度(OD)活性增加率(％)10μmol·L^-10.176±0.006^***19.71μmol·L^-10.198±0.017^***34.70.1μmol·L^-10.202±0.014^***37.410n mol·L^-10.201±0.014^***36.71n mol·L^-10.167±0.013^***13.60.1n mol·L^-10.159±0.009^*8.210p mol·L^-10.165±0.007^**12.2对照(DF₁₂)0.147±0.0080

^*P＜0.05 vs对照，^**P＜0.01 vs对照，^***P＜0.001vs对照

表2  美曲膦酯对正常胎鼠皮层神经元活性的影响(n＝6，x±s)

组别吸光度(OD)10μmol·L^-10.083±0.005^***1μmol·L^-10.087±0.006^***0.1μmol·L^-10.089±0.010^***10n mol·L^-10.101±0.006对照(DF₁₂)0.109±0.017

^***P＜0.001vs对照

表3  烟酸对正常胎鼠皮层神经元活性的影响(n＝10，x±s)

组别吸光度(OD)10μmol·L^-10.119±0.0251μmol·L^-10.115±0.0170.1μmol·L^-10.092±0.025^*10n mol·L^-10.106±0.025对照(DF₁₂)0.112±0.013

^*P＜0.05vs对照

                 实施例6

NMF对体外培养正常胎鼠皮层神经元存活率的影响

正常胎鼠皮层神经元培养方法同实施例5，含血清培养基(含10％胎牛血清的DF₁₂)将细胞密度调至为4.0×10⁴/cm²，接种于预先包被PLL的24板中，每孔0.5mL，于37℃，5％的CO₂孵育箱中培养。神经细胞接种后的第2天，每孔加入阿糖胞苷的DF₁₂液(终浓度为10μmol L^-1)作用24h，以抑制非神经元的过度增殖。第3天每孔加入50μL不同浓度的NMF的DF₁₂液(终浓度依次为0.1μmol L^-1、10nmol L^-1、1n mol L^-1)，对照组加入等体积的DF₁₂。每天换液1次，药物作用浓度同上。培养至第7天，吸出各孔的培养液，加入台盼兰，相差显微镜下进行存活神经元计数，每孔计5个视野，共计6孔。结果均经SPSS 10.0软件One-way ANOVA(单因素方差分析)检验。NMF能显著促进正常胎鼠皮层神经元存活，与对照组相比，10n mol L^-1、1n mol L^-1的NMF对皮层神经元的存活率分别提高39.3％、73.5％(见表4)。以上结果提示NMF能著促进正常胎鼠皮层神经元存活，明显降低细胞死亡率。

表4  NMF对正常胎鼠皮层神经元存活率的影响(n＝6，x±s)

组别存活率(％)存活增加率(％)0.1μmol·L^-125.56±5.48010n mol·L^-134.27±4.53^***39.31n mol·L^-142.69±2.48^***73.5对照(DF₁₂)24.61±3.860

^***P＜0.001vs对照

                   实施例7

NMF对海人藻酸所致神经毒性的皮层神经元的保护作用

正常胎鼠皮层神经元培养方法和NMF加药方法同实施例6，皮层神经元培养至第7天，吸出各孔的培养液，用D₁-SGH液洗2次，加入海人藻酸的D₁-SGH液(终浓度为50μmol L^-1)。处理30min后用无海人藻酸的D₁-SGH液洗3次，再用DF₁₂培养液洗1次，于每孔加入DF₁₂培养液0.5mL。正常对照组除不加海人藻酸外，处理条件完全同实验组。经18-24h，加入台盼兰染色，相差显微镜下进行存活神经元计数，每孔计5个视野，共计6孔。结果均经SPSS 10.0软件One-way ANOVA(单因素方差分析)检验。相差显微镜下观察，与正常对照组相比，海人藻酸组的细胞折光度下降，颗粒增加，陆续出现漂浮的呈折光性的死细胞，交织成网状的神经细胞其突起渐渐成断线状，死亡率也明显升高，表明50μmol L^-1海人藻酸对培养的神经元有较强的神经毒性。NMF能显著对抗海人藻酸所致的神经损伤，与海人藻酸组相比，0.1μmol L^-1、10n mol L^-1、1n mol L^-1的NMF对损伤皮层神经元的保护率分别为77.30％、80.10％、84.15％(见表5)。

表5  NMF对正常胎鼠皮层神经元存活率的影响(n＝6，x±s)

组别存活率(％)保护率(％)NMF(0.1μmol·L^-1)51.56±1.91^***77.30NMF(10n mol·L^-1)52.37±1.51^***80.10NMF(1n mol·L^-1)53.55±0.88^***84.15海人藻酸(50μmol L^-1)29.08±0.34^###0正常对照组(DF₁₂)40.00±1.35

^***P＜0.001vs海人藻酸；###P＜0.001vs正常对照组。

                     实施例8

NMF对东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的改善作用

昆明种小鼠雌雄各半，每天训练前20min，除正常组腹腔注射生理盐水和模型组腹腔注射3mg kg^-1氢溴酸东莨菪碱以外，其余各组小鼠腹腔注射3mg kg^-1氢溴酸东莨菪碱的同时，腹腔分别注射NMF(2.8mg kg^-1、14.1mg·kg^-1、70.3mg kg^-1)及美曲膦酯50mg kg^-1。每只小鼠每天使用MORRIS水迷宫自动记录仪(由北京杰日欧科技有限公司提供)进行定位航行训练两次，连续6天，第7天进行空间探索测试。第8天断头取脑，称重后按照乙酰胆碱酶试剂盒的说明书测定乙酰胆碱酶活性，蛋白定量以考马斯亮蓝比色法进行。结果均经SPSS10.0软件General linear model的Repeated measure进行重复测量的多因素方差分析，其中小鼠6天训练总平均成绩用One-way ANOVA(单因素方差分析)检验。

如表6所示，与正常组比较，3mg kg^-1东莨菪碱模型组具有延长小鼠定位航行潜伏期的趋势，且游泳轨迹以盲目的随机螺旋状为主，说明东莨菪碱导致小鼠空间学习记忆障碍。与模型组比较，70.3mg kg^-1NMF能显著缩短东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠的平均潜伏期，且寻找策略目的性明显增强，趋向式和直线式比例增加；而等摩尔浓度的美曲膦酯则效果不明显，说明NMF能显著改善东莨菪碱所致小鼠定位航行障碍，且效能高于美曲膦酯。

表6 NMF对东莨菪碱所致小鼠定位航行潜伏期的影响(n＝10，x±s)

组别第一天(s)第二天(s)第三天(s)第四天(s) 第五天 (s) 第六天 (s) 六天总平 均成绩(s)正常组60±045.6±12.450.8±14.242.9±18.9 41.0±19.6 32.5±19.3 45.4±7.0模型组60±055.7±7.557.8±7.142.8±13.8 50.2±13.5 36.6±20.2 50.5±5.3NMF 2.8mg·kg^-160±057.0±6.950.3±9.643.5±20.8 45.4±11.6 28.3±14.1 47.4±5.4NMF 14.1mg·kg^-160±051.3±12.246.8±11.4^*37.3±15.9 32.3±14.1^* 39.3±19.2 44.5±7.0NMF 70.3mg·kg^-160±043.8±19.643.8±12.7^*41.5±19.2 37.0±17.0 22.1±9.9 41.3±9.6^**美曲膦酯50mg·kg^-160±053.4±51.147.9±14.943.9±16.7 35.8±16.2^* 38.3±20.1 46.5±8.2

^*P＜0.05vs模型组，^**P＜0.001vs模型组

如表7所示，与正常组比较，3mg kg^-1东莨菪碱模型组的记忆频度具有下降趋势，说明东莨菪碱导致小鼠空间探索能力障碍。与模型组相比，70.3mg kg^-1NMF能显著提高东莨菪碱所致记忆障碍小鼠的记忆频度，而等摩尔浓度的美曲膦酯则效果不明显，此外，NMF对小鼠记忆得分率无明显影响。以上结果提示说明NMF能显著改善东莨菪碱所致小鼠定位探索障碍，且效能高于美曲膦酯。

表7  NMF对东莨菪碱所致小鼠空间探索记忆频度和记忆得分率的影响(n＝10，x±s)

组别平均记忆频度(％)平均记忆得分率(％)正常组19.1±5.6 11.8±4.5模型组16.0±6.0 9.9±3.9NMF 2.8mg·kg^-115.9±5.0 8.1±3.9NMF 14.1mg·kg^-115.5±5.6 8.7±3.1NMF 70.3mg·kg^-122.2±4.3^* 8.4±3.4美曲膦酯50mg·kg^-116.3±7.0 10.0±4.7

^*P＜0.05vs模型组

如表8所示，与正常组比较，3mg kg^-1东莨菪碱模型组能够显著引起大脑萎缩。与模型组比较，70.3mg kg^-1NMF组能够显著增加脑系数；而等摩尔浓度的美曲膦酯则效果不明显，说明NMF能显著对抗东莨菪碱所致小鼠大脑萎缩，且效能高于美曲膦酯。与正常组比较，3mg kg^-1东莨菪碱模型组能够显著增加乙酰胆碱酯酶的活性，引起记忆障碍。与模型组比较，70.3mg kg^-1NMF组能够抑制乙酰胆碱酯酶的活性，较等摩尔浓度的美曲膦酯抑制乙酰胆碱酯酶的程度大，对改善记忆是有益的

表8  NMF对东莨菪碱所致小鼠脑系数的影响(n＝10，x±s)

组别脑系数(g/g)乙酰胆碱酯酶(μmol·mg^-1)正常组0.0165±0.0010^*2.52±1.13^***模型组0.0151±0.00135.49±2.80NMF 2.8mg·kg^-10.0156±0.00175.00±2.29NMF 14.1mg·kg^-10.0163±0.00172.22±0.79^***NMF 70.3mg·kg^-10.0170±0.0023^*2.11±1.17^***美曲膦酯50mg·kg^-10.0156±0.00143.14±1.00^**

^*P＜0.05vs模型组

                      实施例9

NMF(腹腔注射)对东莨菪碱所致SD大鼠学习记忆障碍的改善作用

SD大鼠雌雄各半，实验方法和给药剂量、方法同实施例8。由表9所示，与正常组比较，3mg kg^-1东莨菪碱模型组显著延长大鼠定位航行潜伏期，且游泳轨迹以盲目的随机边缘式为主，说明东莨菪碱损伤了大鼠空间学习记忆能力。与模型组比较，2.8mg kg^-1NMF能显著缩短东莨菪碱所致学习记忆障碍大鼠的平均潜伏期，且寻找策略目的性明显增强，趋向式和直线式比例增加；而等摩尔浓度的美曲膦酯则效果不明显，说明NMF能显著改善东莨菪碱所致大鼠定位航行障碍，且效能大大高于美曲膦酯。

表9  NMF对东莨菪碱所致大鼠定位航行潜伏期的影响(n＝10，x±s)

组别第一天(s) 第二天 (s) 第三天 (s) 第四天 (s)第五天(s) 五天总平均成 绩(s)正常组79.5±30.9 48.0±35.6 31.6±21.1 29.7±17.4^** 20.4±13.1^*** 41.8±12.2^***模型组95.8±41.3 79.9±38.2 61.3±49.0 70.7±44.7 70.8±38.4 75.7±31.7NMF 2.8mg·kg^-187.5±35.6 69.3±45.8 42.9±40.2 31.8±16.1^** 29.3±22.3^** 52.1±21.4^*NMF 14.1mg·kg^-1102.8±19.4 57.1±49.4^* 52.2±44.4 48.7±34.5 39.9±22.8^* 60.2±24.5NMF 70.3mg·kg^-1114.1±12.9 89.2±40.2^* 57.3±25.6 29.4±21.4^** 52.8±41.3 68.5±19.8美曲膦酯50mg·kg^-1120.0±0 112.8±22.9 87.0±35.7 61.7±44.7 65.7±41.1 89.4±20.6

^*P＜0.05vs模型组，^***P＜0.001vs模型组

如表10所示，与正常组比较，3mg kg^-1东莨菪碱模型组的记忆分率具有下降趋势，说明东莨菪碱对小鼠空间探索能力形成了损伤。与模型组相比，14.1mg kg^-1NMF能够显著提高大鼠的记忆得分率，说明烟美曲能显著改善东莨菪碱所致大鼠定位探索障碍，且效能大大高于美曲膦酯。

表10 NMF对东莨菪碱所致大鼠空间探索记忆得分率的影响(n＝10，x±s)

组别平均记忆得分率(％)正常组16.8±8.5^***模型组4.1±4.3NMF 2.8mg·kg^-15.0±4.3NMF 14.1mg·kg^-111.2±3.8^*NMF 70.3mg·kg^-18.4±4.5美曲膦酯50mg·kg^-17.7±6.1

^*P＜0.01vs模型组，^***P＜0.001vs模型组

                     实施例10

NMF(灌胃)对东莨菪碱所致SD雌性大鼠学习记忆障碍的改善作用

实验方法和给药剂量同实施例8。给药方法为灌胃。由表11所示，与模型组比较，14.1、70.3mg kg^-1NMF均能显著缩短东莨菪碱所致学习记忆障碍SD雌性大鼠的平均潜伏期，寻找策略目的性明显增强，趋向式和直线式比例增加；而等摩尔浓度的美曲膦酯则效果不明显，说明NMF能显著改善东莨菪碱所致SD雌雄大鼠定位航行障碍，且效能大大高于美曲膦酯。

表11 NMF对东莨菪碱所致SD雌性大鼠定位航行潜伏期的影响(n＝10，x±s)

组别第一天(s)第二天(s)第三天(s)第四天(s) 第五天 (s)第六天(s) 六天总平均成 绩(s)正常组76.2±20.4 45.8±19.6^* 39.6±24.0^*25.3±13.5^* 19.7±9.1^***18.0±11.4 45.4±7.0模型组120.0±0.0 87.9±32.2 84.4±36.885.2±36.5 103±31.780.0±38.4 50.5±5.3NMF 2.8mg·kg^-1105.4±29.4 90.3±32.9 65.7±33.867.3±38.1 65.8±36.8^*49.2±30.1 47.4±5.4NMF 14.1mg·kg^-1105.9±22.7 85.2±41.3 72.3±27.158.9±43.5^*51.6±37.3^***45.1±39.1^* 44.5±7.0^**NMF 70.3mg·kg^-1109.7±18.2 61.4±29.4 78.3±44.554.6±46.4^*42.7±35.3^*59.3±40.4 41.3±9.6^*美曲膦酯50mg·kg^-1104.3±34.2 87.3±45.7 114.4±12.077.4±44.449.0±48.1^**50.2±46.5 46.5±8.2

^*P＜0.05vs模型组，^**P＜0.01vs模型组，^***P＜0.001vs模型组

如表12所示，与模型组相比，NMF有提高SD雌性大鼠记忆得分率的趋势，但没有统计学意义，效能高于美曲膦酯。

表12 NMF对东莨菪碱所致SD雌性大鼠空间探索记忆得分率的影响(n＝8，x±s)

组别平均记忆得分率(％)正常组13.5±3.8^*模型组8.0±5.4NMF 2.8mg·kg^-18.4±5.0NMF 14.1mg·kg^-18.7±3.6NMF 70.3mg·kg^-18.9±4.5美曲膦酯50mg·kg^-17.5±6.1

^*P＜0.01vs模型组

                    实施例11

NMF(灌胃)对东莨菪碱所致SD雄性大鼠学习记忆障碍的改善作用

除模型组和给药组腹腔注射7mg kg^-1氢溴酸东莨菪碱以外，其余实验方法和给药剂量同实施例8。给药方法为灌胃。由表13所示，与模型组比较，70.3mg kg^-1NMF能显著缩短东莨菪碱所致学习记忆障碍SD雄性大鼠的平均潜伏期，寻找策略目的性明显增强，趋向式和直线式比例增加；而等摩尔浓度的美曲膦酯则效果不明显，说明NMF能显著改善东莨菪碱所致SD雄性大鼠定位航行障碍，且效能大大高于美曲膦酯。

表13 NMF对东莨菪碱所致SD雄性大鼠定位航行潜伏期的影响(n＝10，x±s)

组别第一天(s)第二天(s)第三天(s)第四天(s)第五天(s)第六天(s)六天总平均成绩(s)正常组86.8±25.0^***44.7±32.2^***28.7±17.9^***35.0±26.6^***21.5±11.4^***17.0±11.6^***38.9±9.5^***模型组115.2±15.3101.2±22.178.4±47.684.9±39.774.1±38.782.2±44.489.3±29.5NMF 2.8mg·kg^-1120±0111.0±20.098.6±36.986.9±27.074.6±36.154.0±32.690.8±15.0NMF 14.1mg·kg^-1120±088.1±44.6103.1±20.690.5±37.790.8±40.588.3±40.896.8±22.3NMF 70.3mg·kg^-197.1±19.0^**93.8±36.867.7±40.655.0±36.146.2±37.122.1±9.966.8±22.0^*美曲膦酯50mg·kg^-1120±0103.8±26.3102.2±23.8102.5±34.984.8±43.4^*38.3±20.199.7±15.0

^*P＜0.05vs模型组，^***P＜0.001vs模型组

如表14所示，与模型组相比，70.3mg·kg^-1NMF有提高SD雄性大鼠记忆得分率的趋势，但无统计学意义，效能高于美曲膦酯。

表14 NMF对东莨菪碱所致SD雄性大鼠空间探索记忆得分率的影响(n＝8，x±s)

组别平均记忆得分率(％)正常组35.1±12.2^*模型组18.7±19.6NMF 2.8mg·kg^-116.1±10.6NMF 14.1mg·kg^-110.0±13.0NMF 70.3mg·kg^-120.0±17.0美曲膦酯50mg·kg^-110.4±11.6

^*P＜0.01vs模型组

                 实施例12

NMF对D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠衰老指标的影响

昆明种小鼠，雌雄各半，每天分别灌胃NMF(2.8mg kg^-1、14.1mg kg^-1、70.3mg kg^-1)，舒血宁100mg kg^-1，同时各鼠每天腹腔注射D-半乳糖80mg kg^-1。连续给药造模42天后，分别检测相关衰老指标。结果采用SPSS 10.0软件General linear model的Repeated measure进行重复测量的多因素方差分析和One-way ANOVA(单因素方差分析)统计处理。

如表15所示，NMF有显著缩短D-半乳糖所致衰老小鼠达岸潜伏期的趋势(表15)，与舒血宁相似。

表15 NMF对D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠定位航行潜伏期的影响(n＝10，x±s)

组别第一天(s)第二天(s)第三天(s) 第四天 (s)第五天(s)五天总平均成绩(s)正常组60.0±042.7±14.636.9±21.8 37.3±16.7 32.6±10.8 41.9±12.8D-半乳糖60±052.8±15.648.6±10.7 47.3±18.0 41.6±17.9 50.1±12.4NMF2.8mg·kg^-160±050.6±10.547.6±15.0 47.3±14.1 38.3±21.0 48.8±12.1  NMF  14.1mg·kg^-1  60±0  46.9±18.5  45.5±14.7  42.8±19.5  36.2±11.6  46.3±12.9  NMF  70.3mg·kg^-1  60±0  46.8±18.5  43.8±12.7  31.9±15.2  31.9±15.4  42.9±12.4  舒血宁  100mg·kg^-1  60±0  46.4±14.9  42.3±18.3  42.8±19.5  35.0±16.5  45.3±13.8

如表16所示，与正常生理盐水组比较，模型组衰老小鼠的体重明显较轻，且毛稀疏，色泽暗淡。表明D-半乳糖抑制衰老模型小鼠的体重增长。NMF促进衰老小鼠的体重增长，毛色光泽发亮，其中给药28天作用最为明显。

表16 NMF对D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠体重的影响(n＝10，x±s)

组别  第7天  (s)第14天(s) 第21天  (s)  第28天  (s)第35天(s)第42天(s)正常组  31.0±5.732.0±4.3  34.8±3.3  35.6±4.437.1±4.837.5±3.6模型组  26.5±4.7#25.1±5.0##  30.6±3.2#  29.5±3.2##32.1±4.6#33.0±4.9#NMF2.8mg·kg^-1  26.9±3.929.4±3.8^*  31.1±2.6  33.2±3.3^*35.4±3.334.9±4.0NMF14.1mg·kg^-1  31.3±3.7^*33.6±4.5^**  34.6±4.7^*  36.5±5.5^**37.9±5.5^*36.9±5.4NMF70.3mg·kg^-1  29.2±4.930.2±3.9^*  32.9±4.9  34.7±6.2^*35.7±5.634.8±5.1舒血宁100mg·kg^-1  30.6±3.1^*32.9±3.3  35.5±3.7^**  36.3±3.9^***38.3±5.1^*37.8±4.7^*

##P＜0.01，#P＜0.05vs正常组

^***P＜0.001，^**P＜0.01，^*P＜0.05vs模型组

如表17所示，与正常生理盐水组比较，模型组衰老小鼠的胸腺系数及脾系数均有明显减少，表明D-半乳糖衰老模型小鼠的免疫脏器出现萎缩。NMF可显著提高衰老小鼠的胸腺小鼠和脾小鼠，表现出良好的免疫增强作用。NMF对脑、肝、肾小鼠无明显影响。

表17 NMF对D-半乳糖所致亚急性小鼠脏器系数的影响(n＝10，x±s)

组别脑(mg·g^-1) 肝 (mg·g^-1) 肾 (mg·g^-1) 胸腺 (mg·g^-1)脾(mg·g^-1)正常组11.8±2.3 53.4±14.2 12.8±3.0 2.8±0.9##4.0±1.4#模型组12.6±1.9 50.9±7.5 12.1±1.8 1.4±1.23.5±0.5NMF2.8mg·kg^-111.9±1.2 43.6±3.4 12.0±2.2 2.2±2.43.5±2.2NMF14.1mg·kg^-112.0±2.0 46.8±3.0 12.7±3.0 2.4±0.4^*4.5±1.0^**NMF70.3mg·kg^-112.2±1.8 48.2±2.5 13.8±1.8 2.4±0.7^*4.1±0.5^*舒血宁100mg·kg^-111.3±2.0 53.6±3.4 13.9±2.8 2.8±0.8^**4.3±0.8^*

##P＜0.01，#P＜0.05vs正常组

^***P＜0.001，^**P＜0.01，*P＜0.05vs模型组

如表18所示，与正常生理盐水组比较，模型衰老小鼠的MDA的含量、MAO活性和脂褐质水平明显升高，SOD水平、肝GSH的含量明显降低。NMF可显著降低血清丙二醛(MDA)含量、脑组织MAO活性和脂褐质水平，并提高血清超氧化物歧化酶(SOD)水平，对GSH水平有提高趋势，表现出良好的抗氧化作用。

表18 NMF对D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠生化指标的影响(n＝10，x±s)

组别SOD(NU·mL^-1)MDA(nmol·mL^-1)GSH(mg·mgprot^-1)MAO(U·h^-1·mgprot^-1)脂褐质(μg·g^-1)正常组305.0±102.0#28.3±19.1#49.2±2.6#6.1±3.9#0.5±0.4#模型组169.4±102.347.2±21.837.7±4.510.3±4.32.4±1.8NMF2.8mg·kg^-1218.3±55.737.2±11.338.4±3.28.3±5.82.0±2.0NMF14.1mg·kg^-1311.8±110.0^*24.7±11.4^**38.3±4.19.57±5.40.5±0.7^*NMF70.3mg·kg^-1290.3±128.616.4±5.26^***40.3±17.15.4±3.3^*0.3±0.3^*舒血宁100mg·kg^-1335.2±137.5^*25.9±19.4^*38.0±7.21.8±0.7^*0.4±0.4^*

#P＜0.05vs正常组，^*P＜0.05vs模型组

小鼠长期注射D-半乳糖，引起全身代谢混紊乱，产生各器官功能衰退，表现为记忆力减退，各免疫器官退化，由于自由基堆积，细胞膜受损，MDA、MAO及脂褐质水平增高，SOD、GSH水平降低，这些变化与老龄小鼠相似，我们实验亦证实了D-半乳糖所致亚急性衰老模型小鼠的上述病理改变。实验结果表明，NMF能显著改善D-半乳糖所致衰老小鼠的若干衰老指标，使之恢复至接近正常水平或不再衰老方向发展，提示NMF在改善机体物质代谢紊乱及延缓机体衰老等方面具有一定的作用。

                    实施例13

片剂(万片量)

组分重量NMF100g淀粉700g淀粉浆(10％)10g硬脂酸镁8g总量818g

制备方法：将NMF粉碎并过100目筛，称重后，与已过100目筛的淀粉混合均匀，加入10％淀粉浆制成软材，以16目尼龙筛制粒，湿粒于60℃干燥，干颗粒与硬脂酸镁混合均匀，再经16目筛整粒，经含量测定后，计算出片重，选择6mm浅凹或平冲模压片即得。

              实施例14

胶囊(万粒量)

组分重量NMF100g淀粉700g淀粉浆(10％)10g总量810g

制备方法：将NMF粉碎并过100目筛，称重后，与已过100目筛的淀粉混合均匀，加入10％淀粉浆制成软材，以16目尼龙筛制粒，湿粒于60℃干燥，干颗粒再经16目筛整粒，分装于3号硬胶囊壳，盖上节，压平，打光即可。

                      实施例15

注射剂

组分量NMF的盐酸盐0.5g氯化钠8.5g注射用水加至1000mL

制备方法：分别称取NMF的盐酸盐、氯化钠，溶于适量注射用水中，添加注射用水至全量，搅匀，过滤，滤液灌装于安瓿中，熔封，于100℃流通蒸汽灭菌30min即得。