从绿色巴夫藻制备和纯化二十碳五烯酸甲酯的方法

摘要

一种从绿色巴夫藻制备和纯化二十碳五烯酸甲酯的方法，它是将绿色巴夫藻冻干藻粉加入浓度为5％的氯乙酰－甲醇，充氮气后密闭，于80－100℃下反应0.5～2小时，冷却至室温，分别加入同等体积的重蒸馏水和正己烷，振荡萃取，萃取数次，合并萃取液后，在氮气保护下蒸去正己烷，得到脂肪酸甲酯，然后用涂银硅胶柱进行层析，用丙酮－正己烷溶液梯度洗脱，合并含二十碳五烯酸甲酯纯度高于95％的洗脱液，在氮气保护下，蒸去丙酮和正己烷，即得二十碳五烯酸甲酯，纯度高于95％。本发明的方法简单易行，成本低，二十碳五烯酸甲酯的纯度高

说明书

技术领域

本发明涉及巴夫藻和二十碳五烯酸，具体地说，是涉及从巴夫藻制备二十碳五烯酸甲酯的方法。

背景技术

绿色巴夫藻(Pavlova viridis)是一种黄绿色的微小金藻。藻体呈椭圆形或圆形，无细胞壁。该藻细胞直径约4-6μm，能运动，是一种适温范围广，光照要求低的单细胞海洋微藻。常作为虾类幼体和经济贝类的良好饵料。近年来的研究表明绿色巴夫藻富含二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，下称EPA)等多不饱和脂肪酸，其EPA含量占总脂的12-15％(依培养条件不同而变化)。

EPA等多不饱和脂肪酸存在于藻类细胞糖脂中，要得到二十碳五烯酸甲酯一般首先需从巴夫藻提取总酯，皂化使之成游离酸，然后进行甲酯化，最后分离、纯化得到二十碳五烯酸甲酯。分离、纯化主要有低温冷冻法，尿素包合法，分子蒸馏法，超临界CO₂萃取法等。但这些方法或者EPA的得率及纯度较低，或者成本过高。

发明内容

本发明的目的是提供一种步骤简单、成本低、纯度高、得率高的从绿色巴夫藻制备和纯化二十碳五烯酸甲酯的方法。

本发明的技术方案如下：    

一种从绿色巴夫藻制备和纯化二十碳五烯酸甲酯的方法，它包括下列步骤：

步骤1.将绿色巴夫藻冻干藻粉N克，装入容器中，加入20N～30N毫升5％氯乙酰-甲醇(即1∶20 v/v)，充氮气后密闭，于80-100℃下反应0.5～2小时，冷却至室温，

步骤2.在步骤1所得的反应混合物中分别加入同等体积的重蒸馏水和正己烷，振荡萃取，吸取上层液体后，再加入等量的正己烷重复萃取，至上清液不再发黄，

步骤3.合并萃取液后，用干燥剂干燥，滤去干燥剂，在氮气保护下蒸去正己烷，得到脂肪酸甲酯0.046N～0.07N克，

步骤4.将步骤3得到的脂肪酸甲酯用涂银硅胶柱进行层析，用丙酮-正己烷溶液梯度洗脱，分别收集洗脱液，合并含二十碳五烯酸甲酯纯度高于95％的洗脱液，

步骤5.在氮气保护下，蒸去丙酮和正己烷，即得二十碳五烯酸甲酯0.004N克～0.009N克，纯度高于95％。

上述的制备和纯化方法的步骤4中，丙酮-正己烷溶液梯度洗脱可以分别用丙酮体积百分浓度为0.5％、1％、5％、10％和15％的丙酮-正己烷溶液依次洗脱。

上述的制备和纯化方法的步骤4中，涂银硅胶柱的涂银硅胶可以如下制备：

将一定量层析用硅胶加至两倍体积无水乙醇中，搅拌混合成悬浮液。将硝酸银溶解于适量70％乙醇中，加入上述层析硅胶充分混合均匀。硝酸银与硅胶的重量比为1∶10。然后蒸去乙醇，将所得的涂银硅胶置于烘箱中，于120℃高温活化(12小时以上)，冷却后，于暗处保存。

本发明的从绿色巴夫藻制备和纯化二十碳五烯酸甲酯的方法步骤简单，消耗少，成本低，得率高，得率可达理论值的65～72％，纯度高，纯度可达95％以上。

附图说明

图1为实施例2中涂银硅胶柱层析—梯度浓度洗脱液，15％丙酮-正己烷第一管洗脱液的气相色谱图，其中个峰的保留时间和峰面积如下：

Peak RetTime Type Width     Area      Height      Area

  #   [min]       [min]     [pA*s]    [pA]         ％

----|-------|----|-------|----------|----------|--------|

   1  14.148 PB   0.0681    4.08046   7.91750e-1 0.42113

   2  15.930 PP   0.0667    7.70089   1.64221    0.79478

   3  18.151 PB   0.0636    923.32898 187.03178  95.29351

   4  18.589 PB   0.0624    3.55124   6.86098e-1 0.36651

   5  19.541 BB   0.0718    10.97733  1.88797    1.13293

   6  21.027 BB   0.0713    14.81180  2.86513    1.52867

   7  21.685 PV   0.0640    2.02365   3.86956e-1 0.20885

   8  22.399 PV   0.0702    2.45727   4.26771e-1 0.25361

Totals：                    968.93161 195.71867

图2为实施例2中涂银硅胶柱层析—梯度浓度洗脱液，15％丙酮-正己烷第二管洗脱液的气相色谱图，其中个峰的保留时间和峰面积如下：

Peak RetTime Type  Width    Area      Height      Area

  #   [min]        [min]    [pA*s]    [pA]        ％

----|-------|----|-------|----------|----------|--------|

   1  14.155 PB   0.0659   2.07125   3.90620e-1 0.38716

   2  15.945 BB   0.0682   4.44554   9.56831e-1 0.83097

   3  18.143 PB   0.0714   517.56049 105.23692  96.74304

   4  19.557 BP   0.0857   6.76244   1.01491    1.26404

   5  21.044 PB   0.0622   1.90134   3.80979e-1 0.35540

   6  22.405 BB   0.0742   2.24367   3.67851e-1 0.41939

Totals：                   534.98472 108.34811

Results obtained with enhanced integrator！

图3为实施例2中涂银硅胶柱层析—梯度浓度洗脱液，15％丙酮-正己烷第三管洗脱液的气相色谱图，其中个峰的保留时间和峰面积如下：

Peak  RetTime Type  Width    Area      Height      Area

 #     [min]        [min]    [pA*s]    [pA]         ％

----|-------|----|-------|----------|----------|--------|

   1  15.952  BP    0.0648  2.47534    5.27118e-1 0.86594

   2  18.134  BB    0.0774  278.85254  55.68338   97.54986

   3  19.563  BB    0.0858  4.52853    6.54070e-1 1.58420

Totals：                    285.85641  56.86457

Results obtained with enhanced integrator！

图4为实施例2中涂银硅胶柱层析—梯度浓度洗脱液，15％丙酮-正己烷第四和第五管洗脱液的气相色谱图，其中个峰的保留时间和峰面积如下：

Peak RetTime Type  Width    Area      Height      Area

  #   [min]        [min]    [pA*s]    [pA]        ％

----|-------|----|-------|----------|----------|--------|

   1  18.129 PB    0.0772  136.59071  27.39506   97.74114

   2  19.570 BP    0.1351  3.15670    2.83150e-1 2.25886

Totals：                   139.74741  27.67821

Results obtained with enhanced integrator！

具体实施方式

实施例1.藻类培养与收获

单细胞海洋微藻绿色巴夫藻购自青岛中科院海洋研究所，经本实验室复壮培养，保存于21-27℃。培养条件如下：6000-9000lux，12：12L/D，通气培养。指数生长末期收获，4000-8000g离心8-15分钟收集藻体，蒸馏水洗涤以除去盐类及其他杂质，冷冻干燥，低温冷冻保存。

实施例2.涂银硅胶柱的制备：

将一定量层析用硅胶加至两倍体积无水乙醇中，搅拌混合成悬浮液。将硝酸银溶解于适量70％乙醇中，加入上述层析硅胶充分混合均匀。硝酸银与硅胶的重量比为1∶10。然后蒸去乙醇，将所得的涂银硅胶置于烘箱中，于120℃高温活化(12h以上)，冷却后，于暗处保存。

实施例3.从绿色巴夫藻制备和纯化二十碳五烯酸甲酯

从绿色巴夫藻制备和纯化二十碳五烯酸甲酯，它包括下列步骤：

步骤1.将绿色巴夫藻冻干藻粉1.0克，装入螺口试管中，加入20毫升5％氯乙酰—甲醇(即1∶20v/v)，充氮气后密闭，于80℃下反应2小时，冷却至室温，

步骤2.在步骤1所得的反应混合物中分别加入同等体积的重蒸馏水和正己烷，振荡萃取，吸取上层液体后，再加入等量的正己烷重复萃取，至上清液不再发黄，

步骤3.合并萃取液后，用干燥剂干燥，滤去干燥剂，在氮气保护下蒸去正己烷，得到脂肪酸甲酯0.046克，

步骤4.将步骤3得到的脂肪酸甲酯用涂银硅胶柱进行层析，分别用丙酮浓度为0.5％，1％，5％，10％，15％(v/v)的丙酮-正己烷溶液各25ml按浓度由低到高依次洗脱，流速控制在1.3～2.0ml/min，每5ml收集一管，分别收集各个不同浓度梯度的流出液做GC分析。发现当丙酮-正己烷洗脱液的丙酮浓度低于10％时，可将一些饱和和不饱和度低的脂肪酸甲酯及其他杂质基本完全洗脱下来，在10％丙酮-正己烷的最后一管时EPA开始洗脱出来，当洗脱液丙酮浓度达到15％(v/v)时，依次得到纯度为95.29％，96.74％、97.55％、97.74％(合并的第4和第5管洗脱液)的EPA甲酯(见气相色谱图，图1-4)。合并15％丙酮-正己烷的洗脱液，可得到纯度大于95％的EPA甲酯，得率约为60％。

步骤5.在氮气保护下，蒸去丙酮和正己烷，即得二十碳五烯酸甲酯0.004克，纯度高于95％。

实施例4.从绿色巴夫藻制备和纯化二十碳五烯酸甲酯

从绿色巴夫藻制备和纯化二十碳五烯酸甲酯，它包括下列步骤：

步骤1.将绿色巴夫藻冻干藻粉1.0克，装入螺口试管中，加入30毫升5％氯乙酰—甲醇(即1∶20v/v)，充氮气后密闭，于100℃下反应0.5小时，冷却至室温，

步骤2.在步骤1所得的反应混合物中分别加入同等体积的重蒸馏水和正己烷，振荡萃取，吸取上层液体后，再加入等量的正己烷重复萃取，至上清液不再发黄，

步骤3.合并萃取液后，用干燥剂干燥，滤去干燥剂，在氮气保护下蒸去正己烷，得到脂肪酸甲酯0.07克，

步骤4.将步骤3得到的脂肪酸甲酯用涂银硅胶柱进行层析，同实施例用丙酮-正己烷溶液梯度洗脱，分别收集洗脱液，合并含二十碳五烯酸甲酯纯度高于95％的洗脱液，

步骤5.在氮气保护下，蒸去丙酮和正己烷，即得二十碳五烯酸甲酯0.009克，纯度高于95％。