具有将甾醇转化为雄－4－烯－3,17－二酮/雄－1,4－二烯－3，17－二酮能力的微生物及其制备方法和用途

摘要

公开的是一种具有极好的将甾醇转化为雄－4－烯－3，17－二酮(AD)和雄－1，4－二烯－3，17－二酮(ADD)能力的微生物，和微生物的制备方法及其用途，更具体的说，是偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)ATCC 29472的突变株——偶发分枝杆菌EUG－119，和制备突变株的方法及其在制备AD和ADD中的用途。本发明的突变株与已知微生物相比，具有极好的将甾醇转化为AD和ADD的能力，AD和ADD是类固醇激素前体，因此，对类固醇激素的大量生产非常有用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物——偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortivtum)EUG-119，它具有极好的将甾醇转化为雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-二烯-3，17-二酮的能力，及其制备方法和用途，更具体的说，是一种具有比以前所知的微生物的转化率高4倍甚至更多的微生物，和微生物的制备方法及其在制备雄-4-烯-3，17-二酮和雄-1，4-二烯-3，17-二酮中的用途。

现有技术

甾醇类是一种由肾上腺皮质、睾丸、卵巢、胎盘或黄体释放的分泌性激素，皆由胆固醇合成。根据它们的生理活性大约可分为如下5类：雄性性激素(雄酮，睾酮等)和雌性性激素(雌二醇等)，它们分别在男性和女性的第二性征发育中起关键作用，孕激素(孕酮等)刺激和维持怀孕，糖皮质激素(可的松，氢化可的松等)通过分解蛋白质来刺激糖异生作用和提高肝糖原水平，盐皮质激素(脱氧皮质酮，醛固酮等)在维持体内电解质和水的平衡中发挥重要作用。

随着文明的进步，出现了许多疾病，由于在这些疾病的治疗中广泛使用类固醇激素，人们生活压力的增加和暴露在环境激素之下都导致体内上述激素水平的不平衡。特别是合成雌激素基本上用于人工受精和不育症患者的治疗，以及糖皮质激素在减轻多种炎症，如虹膜炎、关节炎等引起的疼痛中起作用。此外，致命的阿狄森氏症也可通过施用脱氧皮质酮和氢化可的松治疗。

为满足上述增长的需求，已有大批研究者致力于类固醇激素的体外合成，而其中之一涉及用微生物制备类固醇激素前体。Mamoli和Vercellone(Ber.70470和Ber.702079，1937)报道通过酵母发酵将17-酮-类固醇还原成17-β-羟类固醇。还有，Peterson和Murray在美国专利No.2,602,769中公开了一种用根霉属真菌产生孕酮的11-α-羟化方法，以及Kraychy在美国专利No.3,684,657中公开了一种用分枝杆菌属从包含17-烷基的类固醇生成雄-4-烯-二烯-3，17-二酮，雄-1，4-二烯-3，17-二酮和20α-羟甲基孕-1，4-二烯-3-酮的方法。

为了大量生产类固醇激素产物，试图使用甾醇为唯一碳源分离微生物和改变甾醇结构用作发酵的底物，还用能防止甾醇核降解的化学添加剂(如金属、金属吸和金属还原剂)来提高类固醇的收得率，这一努力已获得很大进展(Marsheck等，Applied microbiology.23(1).72-77，1972)。此外，还开展了通过物理和化学手段对从土壤中分离出的微生物进行突变来提高类固醇前体产率的研究，特别是Upjohn公司在美国专利No.4,293,644中描述了一种通过一分枝杆菌(ATCC 29472)的突变株从多种类固醇中得到以高产量的雄-4-烯-3，17-二酮(在下文用AD表示)为主，并有少量雄-1，4-二烯-3，17-二酮(在下文用ADD表示)的产物的方法。

为与类固醇激素药物需求的增长相适应，就需要大量生产上述的激素前体，尤其是AD和ADD，它们是体外合成类固醇的重要前体化合物。然而，以前已知的微生物合成AD和ADD的产率低。从这一点考虑，急需开发具有从甾醇到AD和ADD的高转化率的微生物。

发明的公开

本发明的发明者所进行的许多实验的结果发现，偶发分枝杆菌(ATCC 29472)的突变株偶发分枝杆菌EUG-119具有极好的从甾醇到AD和ADD的转化效率，本发明也是在这一结果的基础上完成的。

因此，本发明的目的是提供一种具有极好的从甾醇到AD和ADD的转化效率的突变微生物。

本发明的另一个目的是提供一种制备具有极好的从甾醇到AD和ADD的转化效率的突变微生物的方法。

提供一种用具有极好的从甾固醇到AD和ADD的转化效率的突变微生物来制备AD和ADD的方法也是本发明的一个目的。

为达到上述目的，本发明提供了一种制备偶发分枝杆菌EUG-119(于2001年4月14日保藏在韩国微生物培养中心(KCCM)，登记号为NO.KCCM-10259)的方法该方法包括以下步骤：

(a)在含甾醇培养基中培养偶发分枝杆菌ATCC 29472株；

(b)用亚硝基鸟胍(NTG)处理培养的偶发分枝杆菌；

(c)使经亚硝基胍处理的细菌在补充甾醇或者AD和ADD(浓度为0.1-0.2g/L)的培养基中生长，借此可筛选出在加甾醇培养基中生长迅速而在加AD和ADD的培养基中生长缓慢的突变株。

制备本发明AD和ADD的方法包括在含甾醇的液体培养基中培养突变微生物偶发分枝杆菌EUG-119和从培养基中回收AD和AD的步骤。

附图简述

图1是在偶发分枝杆菌EUG-119的培养基中AD和ADD的高效液相色谱图。

实施本发明的最佳方案

根据本发明，使用偶发分枝杆菌(ATCC 29472)，它能通过发酵从胆固醇转化为类固醇。

为制备本发明的偶发分枝杆菌EUG-119，首先使偶发分枝杆菌(ATCC 29472)生长至O.D.0.6到0.8，然后用能杀死99.95生物的量的亚硝基胍(NTG)处理。NTG是一种常用于产生微生物突变株的化合物，它通过将鸟嘌呤的C6位甲基化在DNA复制时通过AT对替换GC对来诱导突变。NTG的量是每5ml培养基300至400μg，优选的量为每5ml 330μg。此外，突变还可由紫外线照射、INH(异烟肼)或其它的致突变化合物完成。

从经NTG处理过的菌株中选出在加甾醇固体培养基中生长迅速而在加AD和ADD的固体培养基中生长缓慢的突变株，最后通过烧瓶培养得到具有最高转化率的突变株偶发分枝杆菌EUG-119。

任选地，在筛选菌株时所用的甾醇或AD和ADD以0.1到0.2g/L，优选0.4到0.6g/L的量加入培养基中。甾醇可选自谷固醇、胆固醇、豆固醇和菜油固醇，优选的是胆固醇。

通过上述方法制备的偶发分枝杆菌EUG-119于2001年4月14日保藏在韩国微生物培养中心(KCCM)，登记号为NO.KCCM-10259。

在本发明的一个实施方案中，培养了最终选出的突变株偶发分枝杆菌EUG-119，并分析它从胆固醇到AD和ADD的转化率，在小规模培养时，该突变株的转化率比野生型菌株高约2.3倍，而在大规模培养时则约高4.2倍。从经一般分离和纯化操作的2L突变菌株培养基中回收到纯化率约为80％的AD和ADD。发现培养2天后，突变株产生了比野生株浓度高的AD和ADD。

因此，本发明的偶发分枝杆菌EUG-119可用于大量生产AD和ADD。这种方法包括在含甾醇的液体培养基中培养偶发分枝杆菌EUG-119和从培养基中回收AD和ADD的步骤。

当本发明的偶发分枝杆菌EUG-119用于制备用作类固醇激素合成的前体的AD和ADD时，可获得高产量的AD和ADD。

将通过引用以下实施例并结合附图更详细的解释本发明。然而举以下实施例仅为说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1

突变株的制备

为诱导突变，将分枝杆菌(ATCC 29472)接种到YNG培养基中，并培养至O.D.0.6到0.8，然后离5ml培养液，得到一个细胞团。用含0.5％Tween 80的0.1M无菌柠檬酸钠缓冲液(pH5.6)洗涤细胞团两次，并重悬于5ml缓冲液中，然后将浓度为330μg/ml的NTG加入细胞悬浮液中。将经NTG处理的细胞悬浮液于37℃振荡培养90分钟，然后离心，得到一细胞团，细胞团用0.1M无菌磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤三次，并重悬于该缓冲液中。将最终的细胞悬浮液加到SM1固体培养基上，于37℃培养3-4天以形成克隆。

实施例2

突变株的筛选

将实施例1所得的克隆接种到MS1，MS1+胆固醇，MS1+ADD(或AD)和YNG固体培养基中，于30℃培养3天以选出在含胆固醇培养基(MS1+胆固醇培养基)中生长迅速而在含ADD(或AD)的培养基中生长缓慢的菌株，所选出的菌株称为偶发分枝杆菌EUG-119。MS1培养基是极限无机培养基，用作对照，表1列出了培养基的组成。

                                 表1

  成分                    培养基(％)    YNG    SM1    MS1   SM4(发酵培养基)  酵母提取物    0.1    -    -   0.5  营养肉汤    0.8    -    -   -  甘油    0.5    1    -   -  Tween80    0.1    -    -   0.01  NaCl    _    -    0.0005   -  K₂HPO₄    -    0.05    0.02   0.04  KH₂PO₄    -    -    -   0.08  NH₄Cl    -    0.1    -   -  MgSO₄₇H₂O    -    0.05    0.25   0.2  FeCl₂₆H₂O    -    0.005    -   -  NH₄NO₃    -    -    0.1   -  FeSO₄₇H₂O    -    -    0.0001   0.0005  乙酸铵    -    -    -   0.15  ZnSO₄₇H₂O    -    -    -   0.0002  MnCl₄₄H₂O    -    -    -   0.00005  葡萄糖    -    -    -   1  琼脂    -    1.5    1.5   -  PH    7.0    -    -   7.5

实施例3

偶发分枝杆菌EUG-119k从胆固醇到AD和ADD转化率的研究

将实施例2中选出的突变株偶发分枝杆菌EUG-119在5ml YNG培养液中预培养，然后于30℃，200rpm培养120小时，培养基为：100ml含1g葡萄糖，0.5g酵母提取物，0.01g Tween80和各种无机盐的SM4发酵培养基(见表1)。由于胆固醇在培养基中不能很好的溶解，而溶于丙酮，因此将丙酮溶中的胆固醇悬液以每100ml0.1g胆固醇的量加入培养基中。培养后，用乙醚和石油醚抽提培养液，并用2-丙醇溶解提取物，然后用HPLC分析该溶液中由偶发分枝杆菌EUG-119从胆固醇产生AD和ADD的量。从胆固醇到AD和ADD的转化率由AD和ADD的摩尔浓度与加入的胆固醇的摩尔浓度的比值计算的产率来表示。还研究了野生菌株偶发分枝杆菌(ATCC 29472)的AD和ADD的产量及转化率。结果列于表2中。

                            表2

    野生菌株 偶发分枝杆菌EUG-119 产率(摩尔百分数)    27 64 AD和ADD的产量(mg/L)    199 472

注：产率＝产生的AD和ADD的摩尔浓度/加入的胆固醇的摩尔浓度

如表2所示，突变株偶发分枝杆菌EUG-119显示比野生菌株偶发分枝杆菌(ATCC 29472)高2.3倍的从胆固醇到AD和ADD的转化率。

实施例4

将用实施例3相同的方法制备的、在100ml培养液中预培养的突变株接种到含有2.5L无菌培养基(pH8.0)的5L发酵罐，并于1vvm(通气流量)，30℃，600rpm振荡培养120小时。以5g/L的量加入丙酮中溶解的胆固醇。用与实施例3相同的方法分析AD和ADD的产量及从胆固醇到AD和ADD的转化率，结果列于表3中。

                            表3

    野生菌株偶发分枝杆菌EUG-119 产率(摩尔百分数)    14    59 AD和ADD的产量(mg/L)    510    2,177

如表3所示，突变株偶发分枝杆菌EUG-119显示比野生菌株高4.2倍的转化率。

实施例5

从实施例4制备的培养液中纯化AD和ADD。将2.5L培养液调至pH3.0，并于4℃下以5000rpm离心10分钟。通过悬浮于70％丙酮提取所得的生物量团，并过滤丙酮蒸发后，保持在5-10℃，使激素沉淀。所得沉淀物经过滤并于55℃干燥，将干燥的测定物加入己烷中以除去残余胆固醇，然后再过滤和干燥，回收所得的粗激素中间物。激素中间物的回收率列于表4中。 

                         表4

  生物量的重量(g)    回收率(％)    培养液    5.2    100    用丙酮抽提后    4.6    88    粗激素    4.2    81

如表4所示，突变株偶发分枝杆菌EUG-119的2.5L培养液中得到的激素中间物的纯化率约为80％。

实施例6

用HPLC测量由野生型偶发分枝杆菌和突变株偶发分枝杆菌EUG-119产生的激素中间物浓度。含野生型或突变型偶发分枝杆菌的培养液用四倍体积的按1∶l的双乙醚和石油醚的混合液抽提2次，然后将溶剂蒸发。提取的激素悬浮于异丙基乙醇，并借助HPLC以Pegasil ODS(4.6×250，5μm，120，Senshu Pak，Japan)作为层析柱，在流速1.0ml/min，2,700psi和250nm的条件下作定量分析，流动相用50％的THF(见图1)分析。

结果表明，培养2天后，突变株偶发分枝杆菌EUG-119产生AD和ADD的水平高于野生菌株偶发分枝杆菌ATCC 29472。

实施例7

用已知方法研究突变株偶发分枝杆菌EUG-119的真菌学特性，结果如下。

偶发分枝杆菌EUG-119可在30-35℃下利用糖包括葡萄糖、多糖、甘油、脂肪酸等作为碳源。同时，偶发分枝杆菌EUG-119作为革兰氏阳性菌株，其细胞壁中含有大量脂肪并生长形成黄色克隆。

总之，本发明的偶发分枝杆菌EUG-119显示与已知偶发分枝杆菌ATCC 29472类似的形态学和物理特性，但具有极好的通过发酵作用将甾醇转化成AD和ADD的能力。

工业应用

如上所述，本发明的偶发分枝杆菌EUG-119与以前已知的微生物，特别是偶发分枝杆菌ATCC 29472相比，具有极好的从甾醇到AD和ADD的转化率。因此，本发明的偶发分枝杆菌EUG-119对类固醇激素的大量生产是很有用的。