具有改变的免疫原性反应的蛋白质及制备和使用该蛋白质的方法

摘要

本发明涉及一种新的蛋白质变体，该变体当与亲代蛋白质相比时显示减少的变应原性。同样包括的是编码新变体的DNA分子、包含DNA的宿主细胞和制备较小变应原性的蛋白质的方法。

说明书

                     发明背景

用于工业、制药和商业应用的蛋白质越来越流行了。暴露于蛋白质的个体变得对该蛋白质致敏，因此随后的暴露可导致变态反应。例如，一些蛋白酶在某些个体中可导致过敏性反应。结果，尽管蛋白酶有在工业中的有用性，如在洗衣店洗涤剂、化妆品、纺织品处理等中，以及在提供改进的蛋白酶的领域中进行了详尽的研究，其中该蛋白酶在去垢性条件下具有如更有效的去污能力；但是蛋白酶在工业中的使用是有问题的。

已经做了许多工作来减轻这些问题。在探索用于减少蛋白酶使用的潜在免疫原性的策略中，已有通过控制并使灰尘颗粒或含有空中的蛋白酶的气溶胶的在工作场所的浓度最小化而减少潜在接触的改进的生产方法、减少从蛋白酶产物中产生的灰尘颗粒或气溶胶的实际量的改进的颗粒形成方法以及用于减少终产物中潜在的变应原性污染水平的改进的回收方法。然而，减少蛋白酶的变应原性的努力本身是相对不成功的。可选择地，已进行了努力以屏蔽被过敏个体中免疫球蛋白E(IgE)识别的蛋白酶的抗原决定部位(PCT Publication No.WO 92/10755)，或者通过将多聚体或肽/蛋白质附着到有问题的蛋白酶上而扩大或改变抗原决定簇的特性。

当适应性免疫反应以过度或不适当的方式发生时，则将经历该反应的个体称为过敏的。过敏性反应是正常有益的免疫反应不适当地作用的结果，并有时可导致炎症反应和组织损害。它们可由许多抗原引起；且过敏性反应的原因将因个体而异。过敏性在第一次与抗原接触时一般不显示，但通常在随后的接触中出现。一种形式的过敏性是在IgE反应针对良性的环境抗原如花粉、尘螨(dust-mites)或动物皮屑时发生的。结果导致的IgE-致敏肥大细胞对药学介质的释放产生了具有如哮喘或鼻炎症状的急性炎症反应。

但是包含修饰IgE位点的策略在防止最初的致敏反应的发生时通常不是成功的。因此，这种策略尽管可能抵消或减少随后过敏性反应的严重性，但不减少实际致敏的人或数目。例如，当已知一个人对某个抗原过敏时，处理这种状况的通常方式是尽可能完全地使过敏的人与抗原分离。事实上，任何其他的反应过程对于过敏个体的健康都可能是有害的。因而，尽管减少一个特定的蛋白质对于过敏个体的危害是重要的，但对于工业目的更有价值的将为减少或消除蛋白质使过敏反应首先起始的能力。

T-淋巴细胞(T-细胞)是在诱导和调节免疫反应中及在实行免疫学效应物功能中的关键参与者。对于传染性介质和肿瘤的特异性免疫已知是依赖于这些细胞的，且据信这些细胞有助于伤害的治愈。另一方面，控制这些反应的失败可导致自身攻击。通常，抗原是以抗原呈递细胞的形式呈递到T-细胞的，该抗原呈递细胞通过多种细胞表面机制，以适合于由T-细胞的抗原识别的方式捕获并展示抗原或部分抗原。在由T-细胞表面的受体(T-细胞受体)识别特定的抗原决定部位之后，T-细胞开始一系列的复杂作用，包括增殖，这导致抗体由B-细胞的生产。尽管T-细胞和B-细胞都是由存在于给定的蛋白质或肽上的抗原决定部位激活的，但是由这些单核细胞识别的实际抗原决定部位通常不是相同的。事实上，激活T-细胞以起始免疫学多样性的抗原决定部位经常与随后在免疫学反应过程中由B-细胞识别的抗原决定部位是不同的。因而，对于过敏性而言，尽管T-细胞和抗原之间特定的抗原相互作用在使对抗原暴露的免疫反应起始中是关键的成分，但该相互作用的细节即识别的抗原决定部位通常与由IgE抗体介导的完全(full blown)变态反应的随后发展是不相关的。

PCT Publication No.WO 96/40791公开了用聚环氧烷作为起始材料来生产具有减少的变应原性的聚环氧烷-蛋白酶缀合物的方法。

PCT Publication No.WO 97/30148公开了具有减少的变应原性的多肽缀合物，该缀合物包含一种具有两个或多个共价偶联的多肽分子的多聚体载体分子。

PCT Publication No.WO 96/17929公开了生产具有减少的变应原性的多肽的方法，该方法包含使1～30个聚分子(polymolecule)与亲代多肽缀合的步骤。

PCT Publication No.WO 92/10755公开了生产在动物中引起减少的免疫原性反应的蛋白质变体的方法。在该申请中，将目标蛋白质、其一系列蛋白酶及变体用于对大鼠的免疫接种。然后将来自大鼠的血清用于测量已经生产的和存在于免疫接种的血清中的多克隆抗体对目标蛋白质及其变体的反应性。从这些结果中看，有可能确定制剂中的抗体是否与蛋白质及其变体具有相对更多或更少的反应，因而允许对蛋白质中何种变化可能抵消或减少Ig结合能力的研究。通过对大鼠的这些检验，得出结论为枯草杆菌蛋白酶309的残基中相应于127、128、129、130、131、151、136、151、152、153、154、161、162、163、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、186、193、194、195、196、197、247、251、261的任何一个的改变将导致免疫学潜力的改变。

PCT Publication No.WO 94/10191公开了包含亲代单体蛋白质的寡聚形式的低变应原蛋白质，其中该寡聚体基本保持了其活性。

PCT Publication No.WO 99/49056公开了许多在限定的抗原决定部位区域具有氨基酸替代的枯草杆菌蛋白酶变体。然而，由于公开的变体的大的数目，本领域的技术人员面临着关于鉴定具有降低的免疫原性作用的最适蛋白酶产物的问题，该最适蛋白酶用于个人护理或其他人体应用。

PCT Publication No.WO 01/07578公开了许多在限定的抗原决定部位区域具有氨基酸替代的枯草杆菌蛋白酶变体。然而，由于公开的变体的大的数目，本领域的技术人员面临着关于鉴定具有降低的免疫原性作用的最适蛋白酶产物的问题，该最适蛋白酶用于个人护理或其他人体应用。

尽管一些研究已提供了减少某些蛋白质的变应原性和鉴定在某些个体中导致变态反应的抗原决定部位的方法，但用于鉴定这些抗原决定部位的测定通常包含对在先前暴露于抗原的血清中IgE和IgG抗体的测量。然而一旦Ig反应起始，致敏作用已经出现。因此，需要鉴定产生增强的免疫学反应的蛋白质，同时需要生产可产生减少的免疫学反应的蛋白质。本发明满足了这些和其他的需要。

                    发明概述

此处提供的方法和组合物在形成低变应原性组合物中是有用的。如在此处所用的，“低变应原性”指组合物比本发明的蛋白质前体的相同组合物产生了更低的免疫原性反应。如在此处所用的，“超变应原性”指组合物比本发明的蛋白质前体的相同组合物产生了更高的免疫原性反应。

可将本发明的组合物应用于如清洁组合物、肽水解产物、化妆品制剂、皮肤、头发和口腔护理制剂、药物如血凝块去除产品、研究产品如酶和治疗剂包括疫苗。

在本发明的一个方面，在这里选择并提供了目标蛋白酶。该目标蛋白酶优选地是一种具有T-细胞抗原决定部位的，并然后如下所述进行改变。然而，目标蛋白酶也可基于天然存在的性质进行选择而不进行改变。

在本发明的一个方面中，此处提供的是包含T-细胞抗原决定部位的目标蛋白酶的变体。该变体与目标蛋白酶区别在于具有改变的T-细胞抗原决定部位，从而该变体和该目标蛋白酶在人中产生不同的(如增加的、减少的或消除的)免疫原性反应。

蛋白酶可为任何目标蛋白酶。在一个方面，该蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。在优选的实施方案中，目标蛋白酶和这些目标蛋白酶的变体各自包含至少一些相同的活性。例如，如果提供了蛋白酶的变体，该变体将产生改变的免疫原性反应，但将保持可探测的且优选地可比较的蛋白酶活性和稳定性。

其中提供了目标蛋白酶的变体，T-细胞抗原决定部位可以以许多途径进行改变，该途径包括氨基酸替代、缺失、加入及其组合。优选地，T-细胞抗原决定部位是通过进行氨基酸替代而改变的。在此处的一个实施方案中，对相应于目标蛋白酶同系物的氨基酸进行氨基酸替代，其中该同系物在相应的位置不包含与目标蛋白酶相同的T-细胞抗原决定部位。在一个方面中，包含至少一个T-细胞抗原决定部位的目标蛋白酶的末端部分是用目标蛋白酶同系物的相应末端部分替代的，其中该替代产生了该不同的免疫原性反应。

在此处提供的另一个实施方案中，提供了编码产生想要的免疫原性反应的蛋白酶的核酸。此外，本发明包括包含在此处提供的核酸的表达载体和宿主细胞。一旦鉴定了本发明的蛋白酶及其变体，则可在此处鉴定并提供与蛋白酶及变体基本同源的或那些与其可进行杂交的序列。同源性进一步在下面进行定义，且可指相似性或一致性，而一致性是优选的。优选地，同源序列为氨基酸序列或编码肽的核酸，该肽具有在此处提供的蛋白酶和变体的活性。

在本发明的另外一个方面中提供了具有改变的免疫原性反应的蛋白酶。在一个实施方案中，目标蛋白酶或变体包含由如下方法确定的抗原决定部位，该方法包含(a)从单个血液来源获得树突细胞溶液和未实验过的CD4+和/或CD8+T-细胞溶液；(b)促进该树突细胞溶液中的分化；(c)使该蛋白质与该分化的树突细胞溶液和该未实验过的CD4+和/或CD8+T-细胞溶液组合；和(d)测量在该步骤(c)中T-细胞的增殖。

本发明者已发现那些通常已知为枯草杆菌蛋白酶的丝氨酸蛋白酶(包括枯草杆菌蛋白酶BPN’)在相应于BPN’的氨基酸位置70-84具有显著的抗原决定部位，即第一个抗原决定部位区域，以及在109-123为第二个抗原决定部位区域。本发明者在此处对这种枯草杆菌蛋白酶进行了基因重设计以进行改变如减轻归结于这些抗原决定部位区域的免疫学性质。在这样做时，本发明者已发现引起降低的免疫学反应而仍然维持其作为有效的蛋白酶的活性的枯草杆菌蛋白酶。此外，本发明者已发现引起这种降低的免疫学反应的并是热和pH稳定的枯草杆菌蛋白酶。因此，本蛋白酶适用于几个类型的组合物，该组合物包括但不局限于用于药物、洗衣店、皿、硬表面、皮肤护理、头发护理、美容护理、口腔护理和隐形眼镜的组合物。

本发明者已发现那些通常已知为枯草杆菌蛋白酶的丝氨酸蛋白酶(包括枯草杆菌蛋白酶BPN’)在相应于BPN’的氨基酸位置70-84具有显著的抗原决定部位，即第一个抗原决定部位区域，以及在109-123为第二个抗原决定部位区域。本发明者在此处对这种枯草杆菌蛋白酶进行了基因的重设计以进行改变如减轻归结于这些抗原决定部位区域的免疫原性性质。在这样做时，本发明者已发现引起降低的免疫原性反应而仍然维持其作为有效的蛋白酶的活性的枯草杆菌蛋白酶。此外，本发明者已发现引起这种降低的免疫原性反应的并是热和pH稳定的枯草杆菌蛋白酶。因此，本蛋白酶适用于几种类型的组合物，该组合物包括但不局限于用于药物、洗衣店、皿、硬表面、皮肤护理、头发护理、美容护理、口腔护理和隐形眼镜的组合物。

在一个实施方案中，本发明者已发现了目标蛋白酶的变体，其中该变体与目标蛋白酶区别在于具有改变的T-细胞抗原决定部位，从而该变体和目标蛋白酶在人中产生不同的免疫原性反应。目标T-细胞抗原决定部位包括选自相应于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)枯草杆菌蛋白酶的76、79和122的残基位置的氨基酸残基替代。在另一个实施方案中，目标T-细胞包括选自76和122的氨基酸位置。在另一个实施方案中，目标T-细胞包括位于位置122的替代和位置76和79之一或两者的氨基酸残基位置替代。在一个实施方案中，由变体产生的免疫原性反应比由目标蛋白酶产生的免疫原性反应低。在另一个实施方案中，由变体产生的免疫原性反应比由目标蛋白酶产生的免疫原性反应高。也可包括在位置3、31、40、41、111、147、218、206和/或217中的一个或多个的额外替代。也可包括在位置216、181、101、215、216、217、247、46、154、128、182、107、250、254、258、50、47、48、182、183、185、248和/或262中的一个或多个的额外替代。也已经发现了包括上述残基的多种排列的特定替代组。也已经发现了包括上述残基的多种排列的特定替代组。

在另一个实施方案中，本发明者已发现一种减少蛋白酶的免疫原性反应的方法，该方法包含获得前体蛋白酶；及获得该前体蛋白酶的变体，该变体具有至少一个前体蛋白酶的T-细胞抗原决定部位，其中该变体显示与前体蛋白酶的免疫原性反应不同的改变的免疫原性反应。

在另一个实施方案中，本发明者已发现编码在此处申请专利的变体蛋白酶的核酸、表达载体、用表达载体转化的宿主细胞、清洁组合物、口腔清洁组合物、药物组合物和皮肤护理组合物(包括化妆可接受的载体、皮肤护理活性物、湿润剂、润肤剂、乳化剂、多聚增稠剂(polymeric thickening agent)和硅油)。

本发明的其他方面将通过下面的描述而被技术人员理解。

                  附图简述

图1A、B1、B2和B3图解说明解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(BPN’)的DNA(SEQ ID：NO 1)和氨基酸(SEQ ID：NO 2)序列及该基因的部分限制性切割图。

图2图解了来自解淀粉芽孢杆菌(SEQ ID：NO 3)和迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)(野生型)(SEQ ID：NO 4)的枯草杆菌蛋白酶中的保守氨基酸残基。

图3A和3B图解了来自解淀粉芽孢杆菌(BPN’)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(SEQ ID：NO 5)和迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶类型的蛋白酶的氨基酸序列比对。符号*表示与枯草杆菌蛋白酶BPN’相比特定的氨基酸残基的缺失。

图4a图解了前体蛋白酶P1的氨基酸序列。

图4b图解了与变体LAP2(BPN’-Y217L/I79A/I122A)、LAP3(BPN’-Y217L/N76D/I122A)和LAP4(BPN’-Y217L/N76D/I79A/I122A)相比，对枯草杆菌蛋白酶P1(BPN’-Y217L)的体外反应。

图4b图解了对于70-84 BPN’肽和多种变体的反应百分数(n＝20)。

图5图解了P1(BPN’-Y217L)109-123残基位点效应器的刺激指数(SI)。

图6图解了在从残基109到123的抗原决定部位中具有不同的丙氨酸替代的13个肽序列，该替代用于确定人被试者对被试者肽的改变的免疫原性反应。

图7图解了当暴露于图6的合成的丙氨酸肽时5个人被试者的刺激指数(SI)。

图7a图解了当暴露于图6的肽序列时几个人被试者的SI。

图7b图解了雌性HLA-DR3/DQ2 P1在明矾中的反应。

图7c图解了雄性HLA-DR3/DQ2 P1在明矾中的反应。

图8图解了5mg/ml二甲基酪蛋白底物溶液在pH 5.5时的水解，其由不同浓度的枯草杆菌蛋白酶变体水解，并通过底物吸收中的变化所显示(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。

图9图解了5mg/ml二甲基酪蛋白底物溶液在pH 6.5时的水解，其由不同浓度的枯草杆菌蛋白酶变体水解，并通过底物吸收中的变化所显示(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。

图10图解了5mg/ml二甲基酪蛋白底物溶液在pH 7.5时的水解，其由不同浓度的枯草杆菌蛋白酶变体水解，并通过底物吸收中的变化所显示(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。

图11通过底物吸收中的变化图解了5mg/ml二甲基酪蛋白底物溶液在pH 8.5时被不同浓度的枯草杆菌蛋白酶变体水解(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。

图12通过底物吸收中的变化图解了5mg/ml牛胶原蛋白底物溶液被不同枯草杆菌蛋白酶变体在各种pH(5.5-8.5)水解(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。

图13通过底物吸收中的变化图解了5mg/ml牛弹性蛋白底物溶液被不同枯草杆菌蛋白酶变体在各种pH(5.5-8.5)水解(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。

图14通过底物吸收中的变化图解了5mg/ml牛角蛋白底物溶液被不同枯草杆菌蛋白酶变体在各种pH(5.5-8.5)水解(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。

图15图解了在温度范围42-56℃的酶半衰期的变化，其作为多种蛋白酶变体在50mM PIPES(pH 6.5)中稳定性的测量指标(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。

图16图解了在温度范围42-56℃的酶半衰期的变化，其作为多种蛋白酶变体在50mM TES(pH 7.5)中稳定性的测量指标(P1-◇-；-□-LAP2；-△-LAP3和-x-LAP4)。

                      发明详述

在本发明的一个方面，目的是获得与前体蛋白酶或目标蛋白酶相比具有改变的免疫原性反应和变应原潜力的变体蛋白酶，这是因为减少这种潜力使得能够更安全地使用酶。尽管目前的发明对于改变免疫原性反应潜力是有用的，但在此处详细说明的突变可以与本领域公知的突变结合以实现与前体相比改变的热稳定性和/或改变的底物特异性、修饰的活性、增加的特定活性、改变的碱稳定性或改变的B-细胞抗原决定部位。

根据本发明，提供了具有改变的免疫原性反应的蛋白酶变体，该变体包含T-细胞抗原决定部位，其中目标肽的变体与前体肽或目标肽区别在于具有改变的T-细胞抗原决定部位，从而目标变体肽在人中产生了不同的免疫原性反应。本发明者预期改变的免疫原性反应包括改变的变应原性，这包括增加的或降低的免疫原性反应。T-细胞抗原决定部位可包括选自那些鉴定的抗原决定部位中的残基的氨基酸替代。包括这种减少的免疫原性反应替代的本发明的变体蛋白酶特征在于与前体蛋白酶、不产生免疫原性反应的点突变变体或杂交蛋白酶变体的可比较的活性。

本发明也包括改变如增加或降低蛋白酶的免疫原性反应的方法，该方法包含：获得前体蛋白酶；及修饰前体蛋白酶以获得该前体蛋白酶的变体或衍生物，该变体具有前体蛋白酶的至少一个改变的T-细胞抗原决定部位。此外，该变体特征在于显示与前体蛋白酶的免疫原性反应不同的改变的免疫原性反应。如在本申请其他地方描述的，在枯草杆菌蛋白酶中有至少两个T-细胞抗原决定部位，即相应于解淀粉芽孢杆菌的残基70-84的第一个和相应于解淀粉芽孢杆菌的残基109～123的第二个抗原决定部位。该方法可进一步包括确定增加或降低这种免疫原性反应的残基。这些残基可通过在本发明其他地方描述的肽筛选技术来确定。在一个实施方案中，变体蛋白酶包含在一组相应于解淀粉芽孢杆菌氨基酸位置76、79和122的位置的氨基酸替代，该替代位于至少一个该抗原决定部位中。结果所得的变体显示与前体蛋白酶相比改变的免疫原性反应。

应理解的是术语蛋白质、多肽和肽有时在此处是互换使用的。其中肽是蛋白质的一部分，技术人员可通过该术语使用的环境而理解这一点。

在一个实施方案中，具有改变的免疫原性反应(如增加的免疫原性或降低的免疫原性反应)的肽源自目标蛋白酶。该目标蛋白酶可为野生型的、突变的变体、缀合的变体、在目标抗原决定部位中具有氨基酸缺失、替代或插入的杂交变体，该目标蛋白酶可导致个体中或个体取样中的致敏。该抗原决定部位可通过如下鉴定抗原决定部位和非抗原决定部位的测定来鉴定：使分化的树突细胞与未实验过的人CD4+和/或CD8+T-细胞及与目标肽组合。更特定地，可提供减少的免疫原性反应的目标蛋白酶，其中T-细胞抗原决定部位的识别包含步骤(a)从单个血液来源获得树突细胞溶液和未实验过的CD4+和/或CD8+T-细胞溶液；(b)促进该树突细胞溶液中的分化；(c)使目标肽与该分化的树突细胞溶液和该未实验过的CD4+和/或CD8+T-细胞组合；和(d)测量在该步骤(c)中T-细胞的增殖。

在本发明的一个实施方案中，制备了一系列相应于所有或部分目标蛋白酶的肽寡聚体。例如，生产了覆盖蛋白质的有关部分或全部的肽文库。在一个实施方案中，生产肽的方式是在肽文库中引入重叠，例如生产相应于被试者蛋白质的氨基酸序列1-10的第一个肽、相应于被试者蛋白质的氨基酸序列4-14的第二个肽、相应于被试者蛋白质的氨基酸序列7-17的第三个肽、相应于被试者蛋白质的氨基酸序列10-20的第四个肽等，直到形成了相应于整个分子的代表肽为止。通过在此处提供的测定中单独分析每一个肽，可能的是精确地鉴定由T-细胞识别的抗原决定部位的位置。在上面的例子中，一个特定的肽比其邻近肽更强的反应将促进将抗原决定部位锚定区域鉴定到3个氨基酸。在确定了这些抗原决定部位的位置之后，可能的是改变每一个抗原决定部位中的氨基酸直到肽产生了与最初的蛋白质不同的T-细胞反应。此外，可在此处对具有想要的低的T-细胞抗原决定部位潜能的蛋白质进行鉴定，该蛋白质可以以其天然存在的形式使用。

如在此处所用的“抗原呈递细胞”指免疫系统的一种细胞，该细胞在其表面呈递可由T-细胞表面的受体识别的抗原。抗原呈递细胞的例子为树突细胞、交错突细胞、活化的B-细胞和巨噬细胞。

如在此处所用的“T-细胞增殖”指在有抗原或无抗原时T-细胞与抗原呈递细胞的温育过程中生产的T-细胞的数目。

如在此处所用的“基础(baseline)T-细胞增殖”指在不存在肽或蛋白质抗原时并且暴露于抗原呈递细胞时，个体中通常可见的T-细胞增殖。对于此处的目的，基础T-细胞增殖水平如同在不存在抗原时响应于抗原呈递细胞的T-细胞增殖一样，是在对每个个体的每个样品的基础上进行确定的。

“T-细胞抗原决定部位”指在对包含该抗原的肽的免疫学反应的起始时由T-细胞受体识别的肽或蛋白质的性质。通常认为T-细胞抗原决定部位由T-细胞的识别是经由下面机制实现的，其中T-细胞识别结合到在抗原呈递细胞表面表达的类型I或类型II主要组织相容性(MHC)分子的抗原的肽片段(参见如Moeller，G.ed.，“MHC-限制的反应活化的抗原需求(Antigenic Requirements forActivation of MHC-restricted Responses)”，ImmunologicalReview，Vol.98，p.187(Copenhagen；Munksgaard)(1987)。

如在此处所用的“样品”包含未实验过的单核细胞，即没有对正被讨论的抗原致敏的。

如在此处所用的“同系物”指具有与目标蛋白质相似的催化作用、结构和/或用途的蛋白质或酶。对于本发明的目的，同系物和目标蛋白质不必是进化上相关的，如来自不同物种的相同功能的蛋白质。想要的是找到具有与目标蛋白质相似的三级和/或一级结构的同系物，这是因为将目标蛋白质中的抗原决定部位用来自同系物的相似区段替代将减少变化的破坏性。因而，紧密同源的酶将提供抗原决定部位替代的最想要的来源。可选择地，如果可能，有利的是寻找给定蛋白质的人同系物。例如，用来自枯草杆菌蛋白酶的人同系物(即人枯草杆菌蛋白酶)的序列对细菌枯草杆菌蛋白酶中特定的抗原决定部位的替代应该导致细菌蛋白质中减少的免疫原性反应。

“相似的”序列可通过确保替代的氨基酸显示与位于或邻近抗原决定部位的目标蛋白质中的氨基酸相似的功能、三级结构和/或保守残基。因而，在抗原决定部位区域含有如α-螺旋或β-折叠结构时，替代的氨基酸应该维持特定的结构。

然后可将确定或鉴定的抗原决定部位修饰以进行改变，如增加或减少目标蛋白质的免疫学潜力。在一个实施方案中，要修饰的抗原决定部位产生了比样品中基础T-细胞增殖的3倍高的T-细胞增殖水平。当修饰时，抗原决定部位产生的比基础增殖的3倍低，优选地比基础增殖的2倍低，及最优选地低于或基本等于样品中的基础增殖。在另一个实施方案中，要修饰的抗原决定部位产生了比样品中基础T-细胞增殖的3倍低的T-细胞增殖水平。当修饰时，抗原决定部位产生的比基础增殖的3倍高，优选地比基础增殖的2倍高，及最优选地高于或基本等于样品中的基础增殖。

抗原决定部位可通过多种途径进行修饰，例如：(a)抗原决定部位的氨基酸序列可用来自目标蛋白质的人同系物的相似序列进行替代；(b)抗原决定部位的氨基酸序列可用来自目标蛋白质的非人的同系物的相似序列进行替代，该相似序列由于T-细胞抗原决定部位的识别产生了比目标蛋白质的低的免疫原性反应，如变应原性；(c)抗原决定部位的氨基酸序列可用基本模拟抗原决定部位的主要三级结构特征的序列替代，但该序列由于T-细胞抗原决定部位的识别产生了比目标蛋白质的低的免疫原性反应，如变应原性；或(d)用任何由于T-细胞抗原决定部位的识别产生了比目标蛋白质的低的免疫原性反应(如变应原性)的序列替代。

应理解的是技术人员易于认识到抗原决定部位可依赖于想要的结果而通过其他途径进行修饰。例如，如果改变对自身抗原的自身免疫是想要的，预期的是抗原决定部位的氨基酸序列可用降低或导致炎症或其他免疫反应改变的氨基酸进行替代。

本发明涉及所有想要对其免疫原性进行调节的蛋白质。本领域的技术人员易于认识到本发明的蛋白质和肽不必是天然的蛋白质和肽。事实上，在本发明的一个实施方案中，涉及了具有改变的免疫原性反应的改组的基因。对于基因改组及这种基因表达的描述，参见Stemmer，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 91：10747(1994)；Patten等人，Current Opinion in Biotechnol.8：724(1997)；Kuehner & Arnold，Trends Biotechnol.15：523(1997)；Moore等人，J.Mol.Biol.272：336(1997)；Zhao等人，NatureBiotechnol.16：258(1998)；Giver等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：12809(1998)；Harayama，Trends Biotechnol.16：76(1998)；Lin等人，Biotechnol.，Prog.15：467(1999)；和Sun，J.Comput.Biol.6：77(1999)。可将蛋白质进行改变以调节对该蛋白质的免疫原性反应。

优选地，根据本发明的蛋白酶是分离的或纯化的。纯化或分离指通过将蛋白酶从与其天然联合的一些或所有天然存在的成分分离而使蛋白酶从其天然状态发生改变。这可通过本领域公认的分离技术来实现，如离子交换层析、亲和层析、疏水分离、透析、蛋白酶处理、硫酸铵沉淀或其他蛋白质盐沉淀、离心、大小排阻层析、过滤、微量过滤、凝胶电泳或梯度分离以去除整个细胞、细胞残渣、杂质、外源蛋白质或最终组合物中不想要的酶。然后进一步可能的是向含有蛋白酶的组合物中添加具有额外益处的成分，例如激活剂、抗抑制剂、想要的离子、控制pH的化合物或其他酶如纤维素酶。

除上述蛋白质和肽之外，本发明包括蛋白质或提供了展示改变的免疫原性反应如增加的或减少的免疫原性反应的变体蛋白质。蛋白质如蛋白酶在当它们引起的T-细胞反应比由亲代(前体)蛋白质引起的强时展示增加的免疫原性反应。该较高的反应的净结果是对抗变体蛋白质的抗体的增加。蛋白质在当它们引起的T-细胞反应比由亲代蛋白质引起的弱时展示减少的免疫原性反应。该较低的反应的净结果是对抗变体蛋白质的抗体的缺乏。

用于确定变体蛋白质减少的免疫原性反应的示范性测定包括但不局限于体内测定(HLA-DR3/DQ2小鼠T细胞反应)和体外测定(人外周血单核细胞(PBMC)对蛋白酶1(P1是BPN’-Y217L蛋白酶)及其变体)。用于确定减少的免疫原性反应的体内测定包括但不局限于转基因小鼠的使用，例如大鼠(Taurog等人，Immunol.Rev.，169：209-223(1999))、兔子或猪。用于在体内检验修饰的目标蛋白质及变体并确定减少的免疫原性反应的优选的转基因小鼠模型为HLA-DR3/DQ2小鼠模型。该小鼠模型表达一般的人群体中常见的单倍型。它在次级免疫器官中的B细胞和巨噬细胞上表达HLA-DR3。它可以以与人T细胞相似的方式上调活化的T细胞上HLA-DR的表达。它以比HLA-DR低的水平表达HLA-DQ2，再次与人中HLA分子的表达模式一致。通过细胞表面结合分析显示目标蛋白酶抗原决定部位结合HLA-DQ2。

本发明者知道该小鼠模型和在文献中描述的HLA转基因小鼠模型之间的差别。由本发明者使用的HLA小鼠以与在人中看到的相似的方式表达HLA-DR和-DQ，即HLA-DQ的表达是相当低的，且不能由LPS-介导的B细胞的活化来上调。这与选择来表达高水平的单个HLA转基因的其他转基因动物完全相反。已使该小鼠与鼠的I-Ab-缺陷小鼠进行杂交，该缺陷小鼠消除了相应于人DQ的内源I-Aab异源二聚体的表达，参见Grusby等人，Proc.Natl Acad.Sci.，90：3913-3917(1993)。这些小鼠仍然表达小鼠MHC类型III-Eβ链。该分子可与HLA-DRα链配对以形成混合二聚体，该混合二聚体可能以高水平表达于抗原呈递细胞上。其他的HLA转基因小鼠已有报道并可以以相似的方式用于估计对那些类型II单倍型的潜在免疫反应，例如参见Herman等人，J.Immunol.163：6275-6282；Sonderstrup等人，Immunological Reviews 172：335-343(1999)；Taneja和David，Immunological Reviews 169：67-79(1999)。

除了进行改变(如增加或减少)动物(如人)中天然存在的氨基酸序列的免疫原性反应之外，本发明包含减少突变的蛋白质的免疫原性反应，该突变的蛋白质如已进行改变以使蛋白质的功能活性发生改变的蛋白质或蛋白酶。在许多情况下，蛋白质突变如增加活性、增加热稳定性、增加碱稳定性和/或氧化活性导致突变的蛋白质中新的T-细胞抗原决定部位的整合。本发明确定了新的T-细胞抗原决定部位的存在并确定了会改变突变的蛋白质的免疫原性反应的替代氨基酸。

尽管本发明包含上述蛋白质及许多其他的，但为了简单，下面将描述本发明特别优选的实施方案，该实施方案包含蛋白酶的修饰。蛋白酶是通常切割蛋白质或肽的肽键的羰基水解酶。如在此处所用的，“蛋白酶“指天然存在的蛋白酶或重组蛋白酶。天然存在的蛋白酶包括如a-氨酰肽水解酶、肽基氨基酸水解酶、酰基氨基水解酶、丝氨酸羧肽酶、金属羧肽酶、巯基蛋白酶、羧基蛋白酶和金属蛋白酶。包括丝氨酸、金属、巯基和酸性蛋白酶及内切和外切蛋白酶。

枯草杆菌蛋白酶是通常切割蛋白质或肽的肽键的细菌或真菌蛋白酶。如在此处所用的，“枯草杆菌蛋白酶”指天然存在的枯草杆菌蛋白酶或重组的枯草杆菌蛋白酶。已知一系列天然存在的枯草杆菌蛋白酶是通常由多种微生物物种生产并分泌的。该系列的成员的氨基酸序列不完全是同源的。然而，该系列中的枯草杆菌蛋白酶显示相同或相似类型的蛋白水解活性。该类丝氨酸蛋白酶具有限定催化三联体的共同氨基酸序列，该序列将它们与丝氨酸的胰凝乳蛋白酶相关的类型区别开来。枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶均具有包含天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸的催化三联体。在枯草杆菌蛋白酶相关的蛋白酶中，这些氨基酸的相对顺序从氨基到羧基末端为天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸。然而在胰凝乳蛋白酶相关的蛋白酶中，相对顺序为组氨酸-天冬氨酸-丝氨酸。因而，枯草杆菌蛋白酶此处指具有枯草杆菌蛋白酶相关的蛋白酶的催化三联体的丝氨酸蛋白酶。例子包括但不局限于在此处图3中鉴定的枯草杆菌蛋白酶。通常且对于本发明的目的，蛋白酶中氨基酸的编号方式相应于在图1中提供的成熟解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶序列的号码。

“重组体”、“重组枯草杆菌蛋白酶”或“重组蛋白酶”指枯草杆菌蛋白酶或蛋白酶，其中对编码枯草杆菌蛋白酶或蛋白酶的DNA序列进行了修饰以产生变体(或突变的)DNA序列，该序列编码天然存在的氨基酸序列中一个或多个氨基酸的替代、缺失或插入。产生这些修饰的适当方法并可与那些在此处公开的组合的方法包括那些公开于美国专利4,760,025(US RE 34,606)、美国专利5,204,015和美国专利5,185,258中的。

“非人的枯草杆菌蛋白酶”和编码它的DNA可从许多原核和真核生物中获得。原核生物的适当例子包括革兰氏阴性生物如大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌属(Pseudomonas)和革兰氏阳性细菌如微球菌属(Micrococcus)或芽孢杆菌属(Bacillus)。从其中可获得枯草杆菌蛋白酶及其基因的真核生物的例子包括酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、真菌如曲霉属物种(Aspergillussp.)。

“人枯草杆菌蛋白酶”指具有枯草杆菌蛋白酶类型的催化活性的人来源的蛋白质，如源自人的蛋白酶的kexin家族。此外，在此处提供的蛋白质的衍生物或同系物与目标蛋白酶具有至少50％的、至少65％的和优选地至少80％的、更优选地至少90％的，及有时多达95％、97％或甚至99％的同源性，其中该衍生物或同系物包括那些来自非人的来源如小鼠或兔子的，它们保留了肽的基本活性如水解肽键的能力并展示如在本发明其他地方描述的改变的免疫原性反应等。该同系物的基本活性包括在人中产生不同的免疫原性反应。在一个实施方案中，目标蛋白酶在图4a中显示。

此处所用的氨基酸位置号码指那些分配给在图1中提供的成熟解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶序列的。然而，本发明不局限于该特定枯草杆菌蛋白酶的突变，而是延伸到在“相当于”解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中特别鉴定的残基的位置含有氨基酸残基的前体蛋白酶。例如，当前体蛋白酶是迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶时，替代、缺失和/或插入可在相应于那些上面所列的迟缓芽孢杆菌中的相当的氨基酸残基上进行。

如果前体蛋白酶的残基(氨基酸)与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的特定残基或该残基的部分是同源的(即在一级或三级结构的位置中是相应的)或相似的，那么该残基相当于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的残基(即具有相同或相似的结合、反应或化学相互作用的功能能力)。如在此处所用的“相应的”通常指肽上的相似位置。

为了确立一级结构的同源性，将前体蛋白酶的氨基酸序列直接与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的一级序列进行比较，并具体而言地与其序列已知的枯草杆菌蛋白酶中已知不变的一套残基进行比较。例如，此处图2表示在解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶和迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶之间保守的残基。在将保守的残基进行比对之后，并为了维持比对而允许必要的插入和缺失(即避免通过任意的缺失和插入而消除保守的残基)，限定了与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶一级序列中特定的氨基酸相当的残基。保守的残基的比对优选地应保存100％的这种残基。然而大于75％的或低至50％的保守残基的比对也足以限定相当的残基。催化三联体Asp32/His64/Ser221的保守性应该得到维持。

例如，将来自解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(carlsbergensis)和迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列进行比对以提供氨基酸序列间最大量的同源性。这些序列之间的比较显示在每一序列中含有一些保守残基。在BPN’和迟缓芽孢杆菌之间的保守残基在图2中进行鉴定。

因而，这些保守的残基可用于限定其他枯草杆菌蛋白酶中解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的相应的相当氨基酸残基，如来自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶(于1989年7月13日发表的PCTPublication No.WO 89/06279)、此处优选的蛋白酶前体酶或称为PB92的枯草杆菌蛋白酶(EP 0 328 299)，后者与优选的迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶高度同源。将这些枯草杆菌蛋白酶的某些的氨基酸序列与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的序列在图3A和3B中进行比对以产生保守残基的最大同源性。如可看到的，与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶相比在迟缓芽孢杆菌的序列中有一些缺失。因而，例如解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中Val165在其他枯草杆菌蛋白酶中的相当氨基酸对于迟缓芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌为异亮氨酸。

因而，例如在位置+170的氨基酸在解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶中为赖氨酸(K)，而在洒维奈斯(Savinase)中为精氨酸(R)。然而，在本发明的蛋白酶变体的一个实施方案中，与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中+170相当的氨基酸是用天冬氨酸(D)替代的。本发明中所有氨基酸的缩写和单字母密码与PatentIn User Manual(GenBank，Mountain View，CA)1990，p.101一致。

同源序列也可用“序列比较算法”进行确定。对于要比较的序列的最适比对可通过以下算法进行，如Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、Needleman &Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、Pearson & Lipman，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性搜索方法、这些算法的计算机执行(WisconsinGenetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者肉眼观察。

适合于确定序列相似性的算法的例子为BLAST算法，该算法描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)。进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information)(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公共地获得。该算法包含通过鉴定查询序列中长度W的短字串来首先鉴定高得分序列对(HSPs)，该短字串当与数据库中相同长度的字串进行比对时匹配或者满足一些正值的阈分数T。这些最初的邻近字串命中值(hit)充当起始点以找到含有它们的更长的HSPs。将该字串命中值在两个方向上延着进行比较的两个序列的每一个延伸，前提是累积的比对值增加。字串命中值的延伸在下面情况时停止：累积比对分数从最大值以量X降低；累积分数达到0或更低；或者到达了任一个序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X确定比对的灵敏度和速度。BLAST算法缺省使用的字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 89：10915(1989))比对(B)为50、期望(E)为10、M’5、N’-4和对两条链的比较。

BLAST算法然后进行了两个序列间相似性的统计分析(参见如Karlin & Altschul，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种对相似性的测量是最小总和概率(smallest sum probability)(P(N))，这提供了两个核苷酸或氨基酸序列间可偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在对检验的氨基酸序列与蛋白质如蛋白酶氨基酸序列之间的比较的最小总和概率小于约0.1，更优选地小于约0.01且最优选地小于约0.001，那么则认为该氨基酸序列与蛋白质如蛋白酶相似。

“相当的残基”也可通过确定前体蛋白质的三级结构水平的同源性来定义，该前体蛋白质的三级结构已由X-射线晶体学进行确定。相当的残基定义为那些前体蛋白质(如蛋白酶和解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶)的特定的氨基酸残基的一个或多个主链原子的原子坐标(N在N上、CA在CA上、C在C上和O在O上)在比对后在0.13nm内且优选地在0.1nm内。比对是在对最好的模型进行定向及定位以给出蛋白质(如被讨论的蛋白酶)与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的非氢蛋白质原子的原子坐标的最大重叠之后实现的。最好的模型是晶体学模型，该模型在可获得的最高分辨率上给出了实验衍射数据的最低的R因子。

将与解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的特定残基功能上相似的相当的残基定义为那些前体蛋白质(如蛋白酶)的氨基酸，该蛋白质可采用一种构象，从而它们可以以限定的方式改变、修饰或有助于蛋白质的结构、底物结合或催化，及有助于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的特定残基。进一步地，它们为那些前体蛋白质的残基，例如以这样的程度占据相似位置的蛋白酶(已通过x-射线晶体学获得了该蛋白酶的三级结构)，即尽管给定残基的主链原子不满足在占据同源位置基础上的等值标准，残基的至少两个侧链原子的原子坐标位于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的相应侧链原子的0.13nm内。解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的三维结构的坐标在EPO Publication No.0 251 446(相当于美国专利5,182,204，将其公开内容在此处引用作为参考)中提出，并可如上面所描述的用于确定三级结构水平上的相当残基。

“衍生物”指通过以下方式源自前体蛋白质(如天然蛋白质)的蛋白质：在C-和N-末端中的一个或两者添加一个或多个氨基酸、在氨基酸序列的一个或多个不同位点进行一个或多个氨基酸的替代、在蛋白质末端的一个或两者或者在氨基酸序列的一个或多个位点缺失一个或多个氨基酸、或者在氨基酸序列的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸。蛋白酶衍生物的制备优选地是通过修饰编码天然蛋白质的DNA序列、将该DNA序列转化入适当的宿主及使修饰的DNA序列表达以形成衍生物蛋白酶而实现的。

本发明的衍生物包括与前体氨基酸序列(如野生型和天然状态的蛋白酶)相比包含改变的氨基酸序列的肽，该肽保留了前体蛋白酶的特征性的蛋白酶特性，但在一些特定的方面具有改变的性质。例如，蛋白酶衍生物可具有增加的pH最适值或增加的温度或氧化稳定性，但将保留其特征性的底物活性。相似地，根据本发明的衍生物包括钙结合结构域，该结构域已以这样一种方式进行了添加、去除或修饰，从而显著地消弱或增强其钙结合活性。相似地，可将催化性蛋白水解结构域进行添加、去除或修饰以与蛋白酶一起进行操作。预期根据本发明的衍生物可源自编码蛋白酶衍生物的DNA片段，其中保留了表达的蛋白酶衍生物的功能活性。对前体DNA序列的这种修饰的适当方法包括在此处公开的方法，以及本领域技术人员公知的方法(参见如EP 0 328299，WO89/06279和在此处参考的美国专利及申请)。一些为了替代、插入或缺失而鉴定的残基是保守的，而其他的不是。

这种修饰优选地是对编码前体酶的氨基酸序列的“前体DNA序列”进行的，但也可通过对前体蛋白质进行操作的。前体DNA序列的例子包括但不局限于BPN’和BPN’-Y217L。在残基不是保守的情况下，一个或多个氨基酸的替代局限于产生变体的替代，其中该变体具有与天然发现的不相应的氨基酸序列。在保守残基的情况下，这种替代不应导致天然存在的序列。衍生物进一步包括改变蛋白酶特征的化学修饰。

因而在两个核酸或多肽的情况下短语“基本相同的”一般指多核苷酸或多肽包含用上述程序(如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)和用标准参数与参考序列相比具有至少60％的序列一致性、优选地为至少80％的、更优选地为至少90％、仍然更优选地为95％及有时高达97％的序列。两个多肽基本相同的一个指示是第一个多肽与第二个多肽具有免疫学的交叉反应。一般地，区别在于保守的氨基酸替代的多肽是免疫学交叉反应的。因而，例如当多肽与第二个多肽仅仅区别在于保守的替代时，那么这两个多肽是基本相同的。两个核酸序列基本相同的另一个指示是两个分子在严格性条件下相互杂交(如在中等到高度严格性的范围内)。

“杂交”包括核酸链与互补核酸链通过碱基配对而结合的任何过程。因而，严格地说，该术语指目标序列的互补体结合检验序列的能力，反之亦然。

“杂交条件”一般通过测量杂交的条件的“严格性”程度进行分类。例如，严格性程度可基于核酸结合复合物或探针的熔解温度(Tm)。例如，“最大严格性”一般发生于约Tm-5℃(比探针的Tm低5℃)；“高度严格性”为比Tm低约5-10℃；“中等严格性”为比探针的Tm低约10-20℃；且“低严格性”为比Tm低约20-25℃。可选择地或者另外地，杂交条件可基于杂交的盐或离子强度条件和/或一种或多种严格性洗涤。例如，6×SSC＝非常低的严格性；3×SSC＝低到中等的严格性；1×SSC＝中等严格性；和0.5×SSC＝高度严格性。功能性地，可将最大严格性条件用于鉴定与杂交探针具有严格一致性或接近严格一致性的核酸序列；而将高的严格性条件用于鉴定与探针具有约80％或更多序列一致性的核酸序列。

具有改变的抗原决定部位的变体蛋白酶可用于获得寡核苷酸序列，或者长度约为10-30个核苷酸的引物可从多核苷酸序列设计得来，例如那些在图6中公开的，并将其用于PCR技术中以从基因组序列中分离天然存在的序列或变体。

“克隆”枯草芽孢杆菌基因组DNA片段以进行测序的另一个一般的策略是使用反向PCR。对已知的区域进行扫描以得到一套适当的限制酶切割位点，并用一套从最外面的DNA序列确定的DNA引物来进行反向PCR。将来自反向PCR的DNA片段直接用作测序反应的模板。新导出的序列可用于设计新的寡核苷酸。将这些新寡核苷酸用于扩增DNA片段，其以基因组DNA作为模板。DNA区域中两个链的序列确定是通过在基因组PCR片段上应用引物步移策略来完成的。引物步移中多个起始点的益处来自具有不同大小的新“克隆的”DNA片段的一系列反向PCR片段。从最外面的DNA序列起始了新一轮的反向PCR。整个的反向PCR策略是基于常规taq聚合酶的连续使用和在那些taq聚合酶未能扩增DNA片段的情况下长范围反向PCR的使用的。核酸测序是用标准技术进行的。核酸测序的一个方法包括根据生产商的说明书使用Perkin-Elmer Applied Biosystems 373 DNA测序仪(Perkin-Elmer，Foster City，California)。

源自基因组DNA的核酸序列在编码区之外可含有调节区。不论什么来源，都应该将分离的MP基因克隆到适当的载体中以使该基因增殖。

在对来自基因组DNA的基因的分子克隆中，生成了DNA片段，一些该片段编码想要的基因。该DNA可用多种限制酶在特定的位点进行切割。可选择地，人们可在锰存在时用DNAse使DNA片段化，或者该DNA可如通过超声处理以进行物理剪切。然后可根据大小用标准技术将线形DNA片段进行分离，该标准技术包括但不局限于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳和柱层析。

一旦生成了DNA片段，对含有改变的抗原决定部位序列的特定DNA的鉴定可通过许多途径来完成。例如，可将本发明枯草芽孢杆菌基因的改变的抗原决定部位的寡聚体或其特定的RNA或其片段(例如探针和引物)进行分离和标记，并然后用于杂交测定以探测具有改变的免疫原性反应的抗原决定部位序列。(Benton，W.和Davis，R.，1977，Science 196：180；Grunstein，M和Hogness，D.，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72：3961)。那些共享与探针相似的基本序列的DNA片段将在严格性条件下进行杂交。

因此，本发明提供了探测改变的免疫原性多核苷酸同系物的方法，该方法包含使基因组或者cDNA来源的枯草芽孢杆菌抗原决定部位的核酸序列的部分或全部进行杂交。

在聚合酶链反应(PCR)技术中实现的扩增方法描述于Dieffenbach，CW和GS Dveksler，(PCR Primer，a LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，Plainview，NY，1995)。来自枯草芽孢杆菌MP的至少约10个核苷酸及多达约60个核苷酸的核酸序列(优选地为约12～30个核苷酸且更优选地为约20～25个核苷酸)可用作探针或PCR引物。

对于需要高选择性的应用，人们一般想要采用相对严格的条件来形成杂交体，如人们将选择相对低的盐和/或高的温度条件。杂交条件(包括中等严格性和高度严格性)由Sambrook等人提供，此处引用该文献作为参考。

本发明包含具有改变的免疫原性的蛋白酶，该蛋白酶与那些源自提到的特定的微生物品系的相当。作为“相当的”，在这个情况下指该蛋白酶是由能够与具有在图1A-1C中任何一个所示的序列的多核苷酸在中等到高度严格性下杂交并仍然保留对T-细胞的改变的免疫原性反应的多核苷酸编码。相当的是指该蛋白酶与抗原决定部位序列和具有这种抗原决定部位(如具有在本申请的其他地方描述的修饰的并且在图4a中公开的氨基酸序列)的变体蛋白酶包含至少55％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％的一致性。

“杂交蛋白酶”或“融合蛋白酶”为从至少两个不同的或“亲代”蛋白质进行加工得到的蛋白质，它们优选地相互为同系物。例如，优选的杂交蛋白酶或融合蛋白质可具有蛋白质的N-末端和蛋白质同系物的C-末端。在一个优选的实施方案中，可将两个末端组合以相应于全长的活性蛋白质。在一个优选的实施方案中，同系物共享基本的相似性，但不具有相同的T-细胞抗原决定部位。因此，例如，在一个实施方案中，在C-末端具有一个或多个T-细胞抗原决定部位的目标蛋白酶可具有用同系物的C-末端替代的C-末端，该同系物的C-末端具有较不有力的T-细胞抗原决定部位、较少的T-细胞抗原决定部位或在C-末端不具有T-细胞抗原决定部位。因而，技术人员理解通过能够在同系物中鉴定T-细胞抗原决定部位，可形成多种产生不同免疫原性反应的变体。此外，可理解的是可将内部部分和多于一个的同系物用于产生本发明的变体。

本发明者考虑的杂交例子包括用确立的蛋白质工程技术构建的蛋白酶杂交体。该杂交体是这样构建的，即将蛋白质的高变应原的氨基酸序列用来自较低变应原的同系物的相应序列进行替代。在这个例子中，蛋白酶的前122个氨基酸源自GG36，且剩余的氨基酸序列源自BPN’。

本发明的变体包括蛋白质变体的成熟形式以及这种蛋白质变体的前体(pro-)或前体原(prepro-)形式。前体原形式是优选的构建形式，这是因为它促进了蛋白质变体的表达、分泌和成熟。

“前序列”指结合到蛋白质成熟形式的N-末端的氨基酸序列，当该序列去除时导致蛋白质“成熟”形式的出现。在自然中发现有许多蛋白水解酶作为翻译的酶原产物存在，并在翻译后不存在加工时以这种方式表达。产生蛋白质变体如蛋白酶变体的优选的前序列为解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的推定的前序列，尽管可用到其他的前序列。

“信号序列”或“前序列”指任何结合到蛋白质的N-末端部分或原蛋白质(proprotein)的N-末端部分的序列，该序列可参与蛋白质的成熟或前体形式的分泌。信号序列的这个定义是功能性的，指包括所有那些由在天然条件下参与蛋白质分泌的完成的蛋白质基因的N-末端部分编码的氨基酸序列。本发明利用这种序列以实现如在此处所定义的蛋白质变体的分泌。一个可能的信号序列包含与来自迟缓芽孢杆菌(ATCC 21536)枯草杆菌蛋白酶的信号序列的剩余部分融合的来自枯草芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的信号序列的前7个氨基酸残基。

蛋白质变体的“前体原”形式由具有可操作地连接到蛋白质的氨基末端的前序列的蛋白质的成熟形式和可操作地连接到前序列的氨基末端的“前体”或“信号”序列组成。

“表达载体”指含有可操作地连接到适当的控制序列的DNA序列的DNA构建体，该控制序列能够实现该DNA在适当的宿主中的表达。这种控制序列包括实现转录的启动子、控制这种转录的可选择的操纵基因序列、编码适当的mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。该载体可为质粒、噬菌体颗粒或只是一个潜在的基因组插入物。一旦转化入适当的宿主中，该载体可独立于宿主基因组复制并发挥功能，或者在一些情况下整合入基因组自身中。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时是互换使用的，这是因为质粒是目前最常用的载体形式。然而，本发明想要包括其他形式的表达载体，该载体发挥相当的功能且是或者变为本领域公知的。

本发明中所用的“宿主细胞”一般是原核或真核宿主，优选地已对这些宿主用在美国专利4,760,025(RE 34,606)中公开的方法进行处理以使得其不能够分泌酶活性的内切蛋白酶。表达蛋白质的优选的宿主是芽孢杆菌属品系BG2036，该品系缺失酶活性的中性蛋白质和碱性蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶)。品系BG2036的构建详细描述于美国专利5,264,366。表达蛋白质的其他宿主细胞包括枯草芽孢杆菌I168(同样描述于美国专利4,760,025(RE 34,606)和美国专利5,264,366，将其公开内容在此处引用作为参考)，以及任何适当的芽孢杆菌属品系如地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌等。

宿主细胞是用以重组DNA技术构建的载体进行转化或转染的。这些技术可发现于任何分子生物学实践指南中，如Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2^nd ed.)Vol.1-3，Cold Spring Harbor Publishing(1989)(“Sambrook”)；和Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人(eds.)，Current Protocols，a joint venture between GreenePublishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，(1997补充本)(“Ausubel”)。这种转化的宿主细胞能够复制编码蛋白质变体的载体或表达想要的蛋白质变体。在编码蛋白质变体的前体或前体原形式的载体的情况下，这种变体当表达时一般从宿主细胞分泌到宿主细胞培养基中。

术语“可操作地连接的”当描述两个DNA区域间的关系时简单地指它们相互功能上相关。例如，前序列是可操作地连接到肽的，如果它发挥信号序列的功能，参与蛋白质成熟形式的分泌，并且最可能的是信号序列的切割。启动子如果其控制序列的转录则是可操作地连接到编码序列的；核糖体结合位点如果其以允许翻译的方式则是可操作地连接到编码序列的。

编码天然存在的前体蛋白质的基因可根据本领域技术人员公知的一般方法获得。该方法一般包含合成标记的具有目标蛋白质推定的序列编码区的探针，从表达该蛋白质的生物中制备基因组文库，及通过与探针的杂交筛选目标基因的文库。然后对阳性杂交克隆进行作图和测序。

将蛋白质基因连接到适当的表达质粒中。然后将克隆的蛋白质基因用于转化或转染宿主细胞以表达该蛋白质基因。该质粒在它含有质粒复制所必需的众所周知的元件的意义上可在宿主中复制或该质粒可设计为整合入宿主染色体。将提供必需的元件以进行有效的基因表达，如可操作地连接到正被讨论的基因上的启动子(该启动子如果被宿主识别即转录，则可作为基因自身的同源启动子来提供)、外源的或由蛋白质基因的内源终止子区域提供的翻译终止子(真核宿主细胞的多腺苷酸化区域)和想要的选择基因如抗生素抗性基因，该基因使得能够通过在含有抗生素的培养基生长而连续地对质粒感染的宿主细胞进行培养维持。

在一个实施方案中，基因可为如来自迟缓芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的天然基因。可选择地，可产生编码天然存在的或突变的前体蛋白质的合成基因。在这样一种方法中，确定了前体蛋白质的DNA和/或氨基酸序列。其后合成了多个重叠的合成单链DNA片段，该片段在杂交和连接时产生了编码前体蛋白质的合成DNA。合成基因构建的一个例子是在美国专利5,204,015的实施例3中阐明的，此处将其公开内容引用作为参考。

一旦已克隆了天然存在的或合成的前体蛋白质基因，则在合成该天然存在的蛋白质之外再进行一些修饰以增强该基因的用途。这种修饰包括如在美国专利4,760,025(RE 34,606)和EPOPublication No.0 251 446中公开的重组蛋白质的生产和在此处描述的蛋白质变体的生产。

蛋白质变体可通过本领域技术人员众所周知的多种不同的诱变技术来制备。这些技术可发现于任何分子生物学实验室手册中，如Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2nded.)，Cold Spring Harbor或Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel等人，Green Publishing Associates Inc.andJohn Wiley & Sons。诱变试剂盒也可从许多商业分子生物学供应商购得。在限定的氨基酸进行特定的替代(定点的)、在基因的局部区域进行特异性的或随机的突变(区域特异性的)或者在整个基因上进行随机诱变(饱和诱变)的方法是可用的。用PCR对单链或双链DNA的定点诱变、盒式诱变、基因合成、出错PCR和化学饱和诱变都是人们可用于生成想要的蛋白质变体的技术。在产生了变体之后，可对它们筛选想要的性质(改变的，如高的或增加的；或者低的或减少的免疫原性反应，增加的热或碱稳定性等)。

在本发明的一个方面，目的是得到具有与前体蛋白质相比改变的免疫原性反应潜力的变体蛋白质。尽管目前的发明对于降低免疫原性反应是有用的，但在此处详细说明的突变可以与本领域公知的突变结合以导致与前体相比改变的热稳定性和/或改变的底物特异性、修饰的活性、改进的特定活性或改变的碱稳定性。

因此，本发明涉及改变T-细胞抗原决定部位能力以诱导T-细胞增殖，该抗原决定部位包括解淀粉芽孢杆菌的残基位置109-123。此外，本发明涉及改变T-细胞抗原决定部位能力以诱导T-细胞增殖，该抗原决定部位包括解淀粉芽孢杆菌的残基位置70-84。本发明一个优选的实施方案包含在位置79和122之一或两者进行修饰。本发明的另一个实施方案包含在位置76和122之一或两者进行修饰。另外一个实施方案包含在位置76、79和122的修饰。与目前在相应于氨基酸残基109-123和/或70-84的区域公开的突变结合，本发明进一步涉及在位置76的突变(如替代)，可选择地与选自相应于3、31、40、41、111、147、218、206和/或217的位置的一个或多个替代结合。

本发明的实施方案涉及替代的残基的组合，该残基相应于位置：79-122-217、76-122-217和76-79-122-217，可选择地与目标蛋白酶中的一个或多个替代组合，该替代相当于那些选自相应于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的3、76、31、40、41、111、147、218、206和/或217的位置。其他的实施方案包括在该目标蛋白酶中的一个或多个位置的进一步的额外替代组合，该替代相当于那些选自解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的216、181、101、215、216、217、46、154、128、182、101、104、107、250、254、258、50、47、48、182、183、185、248和262。除降低本发明的变体蛋白质的变应原性潜力之外，这种突变可用于调节酶的总体稳定性和/或蛋白水解活性。

更具体而言地，特定的替代包括N76D、I79T、I79A、I122A和其保守替代。本发明的其他实施方案涉及替代的残基的特定组合，该残基相应于位置：I79A-I122A-Y217L、N76D-I122A-Y217L和N76D-I79A-I122A-Y217L，可选择地连同下面替代的一个或多个一起：S3T；N76D；I31L；P40Q；D41A；I111V；V147P，I；N218S；Q206L和/或L217M。可选择地，包括在一个或多个位置上的进一步替代，其相应于下面位置：A216K、D181G、S101V、G215A、A216E、Y217S、R247Y、R247S、R247Q、G46S、S101Q、S154G、G128S、S182T、S101R、Y104W、I107V、L250G、T254G、T254A、G258S、M50A、G47S、A48G、S182R、S183R、Q185A、S101R、S248G和Y262F。

由本发明者考虑的组合包括但不局限于BPN’-Y217L/I79A；BPN’-Y217L/I79A/I122A；BPN’-Y217L/N76D/I122A；BPN’-Y217L/N76D/I79A/I122A和BPN’-Y217L/N76D。由本发明者考虑的额外组合包括但不局限于N76D/I79A/I122A/N218S；N76D/I79A/I122A/Q206L；N76D/I79A/I122A/Q206L/N218S；I79A/I122A/Q206L；I79A/I122A/N218S；I79A/I122A/P40Q；I79A/I122A/D41A和I79A/I122A/H238Y。在一个实施方案中，这些最后的组合是在BPN’-Y217L目标蛋白酶中进行的。在另一个实施方案中，构建了额外的组合：P1-N76D/I79A/I122A/A216K；P1-N76D/I79A/I122A/D181G；P1-N76D/I79A/I122A/S101V；P1-N76D/I79A/I122A/G215A；P1-N76D/I79A/I122A/A216E；P1-N76D/I79A/I122A/L217S；P1-N76D/I79A/I122A/R247Y；P1-N76D/I79A/I122A/R247S；P1-N76D/I79A/I122A/R247Q；P1-N76D/I79A/I122A/G46S；P1-N76D/I79A/I122A/S101Q/S154G；P1-N76D/I79A/I122A/G128S；P1-N76D/I79A/I122A/S182T；P1-N76D/I79A/I122A/S101R；P1-N76D/I79A/I122A/Y104W/I107V；P1-N76D/I79A/I122A/L250G；P1-N76D/I79A/I122A/T254G；P1-N76D/I79A/I122A/T254A；P1-N76D/I79A/I122A/G258S；P1-N76D/I79A/I122A/M50A；P1-N76D/I79A/I122A/G47S；P1-N76D/I79A/I122A/A48G；P1-N76D/I79A/I122A/S182R；P1-N76D/I79A/I122A/S183R；P1-N76D/I79A/I122A/Q185A；P1-N76D/I79A/I122A/S101R/I107V；P1-N76D/I79A/I122A/S248G和P1-N76D/I79A/I122A/Y262F，P1为BPN’-Y217L。

本发明最优选的实施方案包括下面相应于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的位置N76D-I122A-Y217L的替代残基的特定组合。这些替代优选地是在解淀粉芽孢杆菌(重组型或天然类型的)枯草杆菌蛋白酶中进行的，尽管该替代可在任何芽孢杆菌属蛋白质中进行。

基于用变体蛋白质获得的筛选结果，在解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶中的上述突变对于这些酶的蛋白水解活性、性能和/或稳定性和清洁或洗涤性能以及这些变体酶的其他应用是重要的。

除上述的点突变之外，使两个同源蛋白质融合也可消除T-细胞抗原决定部位。如在下面例示的，T-细胞抗原决定部位残基所在的蛋白质区域可由不具有T-细胞抗原决定部位的同源蛋白质的相同区域替代。在下面的范例中，融合蛋白质是用迟缓芽孢杆菌的蛋白酶及其解淀粉芽孢杆菌同系物来生成的，从而结果所得的蛋白质不具有存在于亲代迟缓芽孢杆菌蛋白酶中的T-细胞抗原决定部位。从仅仅抗原决定部位到蛋白质的大部分的任何长度都可融合到亲代蛋白质中，只要维持了想要的活性。然而，不必要维持初始水平的活性。由于蛋白质降低的变应原性，可能的是使用比亲代蛋白质多的杂交蛋白质以达到相同的活性水平。

可对变体蛋白酶的活性进行确定并将其与目标蛋白酶通过检查蛋白酶与多种商业底物的相互作用而进行比较，该底物包括但不局限于酪蛋白、角蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白。蛋白酶活性可通过那些本领域公知的分析进行确定。确定蛋白酶活性的示范性测定包括但不局限于琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基酰苯胺(paranitroanilide)(SAAPFpNA)测定(Delmar，E.G.等人，Anal.Biochem.94(1979)316-320；Achtstetter，Arch.Biochem.Biophys 207：445-54(1981))；和2，4，6-三硝基苯磺酸钠盐(TNBS)测定。在SAAPFpNA测定中，蛋白酶在肽和对硝基酰苯胺之间切割键以得到肉眼可见的在405nm有吸收的黄色。在TNBS颜色反应方法中，测量底物酶促水解为含有自由氨基基团的多肽。这些氨基基团与TNBS反应以形成黄色复合物。因而反应的颜色越深，则测量到越高的活性。黄色可通过本领域公知的多种分析仪或分光光度计进行确定。

变体蛋白酶的其他特征可通过本领域技术人员公知的方法进行确定。示范性的特征包括但不局限于热稳定性、碱稳定性和特定蛋白酶在多种底物或缓冲溶液或产物制剂中的稳定性。

当与在此处公开的酶稳定性测定程序结合时，鉴定了由随机诱变获得的突变，该突变证明增加的或降低的碱或热稳定性而维持酶活性。

碱稳定性是通过已知程序或在此处所描述的方法进行测量的。碱稳定性中的实质变化是由当与前体羰基水解酶比较时突变体的酶活性半衰期中至少约5％或更多的增加或降低(优选地为增加)来证实的。在枯草杆菌蛋白酶的情况下，碱稳定性可作为枯草杆菌蛋白酶在不同pH时的酶活性的函数来测量。

热稳定性是通过已知程序或在此处所描述的方法进行测量的。热稳定性中的羰基变化是由与前体羰基水解酶相比当暴露于相对高的温度和中性pH时突变的催化活性半衰期中至少约5％或更多的增加或降低(优选地为增加)来证实的。在枯草杆菌蛋白酶的情况下，热稳定性可通过在增高的温度和多种pH时枯草杆菌蛋白酶的自身蛋白水解降解来测量。参见图14和15。

本发明的许多蛋白质变体在制备多种去污剂组合物中是有用的。许多公知的化合物是在包含本发明的蛋白质突变体的组合物中有用的适当表面活性剂。这些包括非离子的、阴离子的、阳离子的、阴离子的或两性离子的去污剂，如在Barry J.Anderson的US4,404,128和Jiri Flora等人的US 4,261,868中公开的。适当的去污剂制剂是在美国专利5,204,015的实施例7中描述的(在前面引用作为参考)。本领域熟悉不同的可用作清洁组合物的制剂。除一般的清洁组合物之外，易于理解的是本发明的蛋白质变体可用于任何使用天然或野生型蛋白质的目的。因而，这些变体可用于如块状或液体肥皂应用、皿碟处理制剂、表面清洁应用、隐形眼镜清洁溶液或产品、肽水解、废物处理、纺织品应用，以及作为蛋白质生产中的融合切割酶等。除降低的变应原性之外，本发明的变体可包含在去污剂组合物中增强的性能(如与前体相比较的)。如在此处所用的，去污剂中增强的性能定义为对某些酶敏感的污染如草或血液的增加的清洁，这由标准洗涤循环后的通常估计所确定。

蛋白质特别是本发明的蛋白酶可制备成公知的粉末状或液体去污剂，该去污剂的浓度按重量在约0.01％～约5％的水平(优选地在0.1％～0.5％)，且具有6.5～12.0的pH。这些去污剂清洁组合物也可包括其他的酶，如公知的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂酶或内切糖苷酶，以及助洗剂和稳定剂。

蛋白质特别是本发明的蛋白酶向常规清洁组合物中的加入不形成任何特别的使用限制。换句话说，任何适合于去污剂的温度和pH也适合于本组合物，只要pH在上述的范围内，且温度低于描述的蛋白质的变性温度。此外，本发明的蛋白质可用于无去污剂的清洁组合物中，单独使用或与助洗剂和稳定剂组合使用。

本发明的一个方面是处理纺织品的组合物，该组合物包括本发明的变体蛋白质。该组合物可用于处理如丝或羊毛，如在出版物如RD 216,034；EP 134,267；US 4,533,359和EP 344,259中描述的。

可根据本领域众所周知的方法筛选该变体的蛋白水解活性。优选的蛋白酶变体包括在相应于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的76、79、122位置的多种替代。

本发明的蛋白酶当与其前体比较时展示了修饰的免疫原性。在优选的实施方案中，蛋白质展示了减少的变应原性。技术人员易于认识到本发明的蛋白酶的使用将在很大程度上根据蛋白质的免疫学性质进行确定。例如，展示减少的变应原性的蛋白酶可用于清洁组合物中。“清洁组合物”是可用于从底物中去除不想要的化合物的组合物，该底物如织品、皿碟、隐形眼镜、其他固体底物、头发(洗发精)、皮肤(肥皂和面霜)、牙齿(漱口水、牙膏)等。此处所描述的一种或多种蛋白酶变体的有效量可包括于组合物中，该组合物用于清洁多种需要去除蛋白质污染的表面。这种清洁组合物包括清洁硬表面的去污剂组合物，形式不限(如液体和颗粒状)；清洁织品的去污剂组合物，形式不限(如颗粒状、液体和块状制剂)；皿碟洗涤组合物(形式不限)；口腔清洁组合物，形式不限(如牙粉、牙膏和漱口水制剂)和牙齿清洁组合物，形式不限(如液体、片剂)。如在此处所用的，“有效量”指达到在特定的清洁组合物中所必需的酶活性而必需的蛋白酶变体的量。这种有效量易于由本领域普通技术人员确定，且基于许多因素，如所用的特定的酶变体、清洁应用、清洁组合物的特定组成和需要液体还是干燥的(如颗粒状、块状)组合物等。

此处所描述的一种或多种蛋白酶变体的有效量也可包括于应用于角质材料如指甲和头发的组合物中，该组合物包括但不局限于那些用作发胶组合物、洗发精和/或头发调理组合物的、为了头发生长调节的目的应用的组合物和为了治疗皮脂溢、皮炎和/或头皮屑的目的而应用于头发和头皮的组合物。

此处所描述的一种或多种蛋白酶变体的有效量可包括于适合于对皮肤或头发的局部应用的组合物中。这些组合物可为面霜、洗剂、凝胶等形式，且可制成水组合物或可制成一种或多种油相在水连续相中的乳剂。

例如，皮肤护理组合物可包括如上所述包含T-细胞抗原决定部位的目标蛋白酶变体，其中该变体与目标蛋白酶区别在于具有改变的T-细胞抗原决定部位，从而该变体和该目标蛋白酶在人中产生不同的免疫原性反应。目标蛋白酶的变体可包括选自相应于解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的76、79和122的残基的氨基酸替代；湿润剂；皮肤护理活性物；表面活性剂；润肤剂；多聚增稠剂和硅氧烷。

皮肤护理活性物

此处的组合物可包含按重量计为约0.1％～约20％、优选地为约1％～约10％、更优选地为约2％～约8％水平的皮肤护理活性物。此处所用的适当的皮肤护理活性物的非限制性例子包括维生素B3成分、泛酰醇、维生素E、维生素E乙酸盐、视黄醇、丙酸视黄酯、棕榈酸视黄酯、视黄酸、维生素C、可可碱、α-羟酸、法尼醇、植烷三醇(phytantriol)、水杨酸、palmityl peptapeptide-3及其混合物。

B3化合物

如在此处所用的，“维生素B₃化合物”指具有下面分子式的化合物：

其中R是-CONH₂(即烟酰胺)、-COOH(即烟酸)或-CH₂OH(即nicotinyl alcohol)；其衍生物和任何前述物质的盐。前述的维生素B₃化合物的示范性衍生物包括烟酸酯，该酯包括烟酸的非血管舒张的酯、nicotinyl氨基酸、羧酸的nicotinyl alcohol酯、烟酸N-氧化物和烟酰胺N-氧化物。

烟酸的适当酯包括C₁-C₂₂醇、优选地为C₁-C₁₆醇、更优选地为C₁-C₆醇的烟酸酯。该醇为适当的直链或支链、环状或非环状、饱和或不饱和的(包括芳香族的)及取代的或非取代的。该酯优选地为非血管舒张的。如在此处所用的，“非血管舒张的”指在应用到被试者的皮肤中之后通常不产生可见的脸红反应的酯(一般群体的大多数将不会经历可见的脸红反应，尽管这种化合物可导致非肉眼可见的血管舒张)。烟酸的非血管舒张酯包括生育酚烟酸酯(tocopherolnicotinate)和肌醇六烟酸酯(inositol hexanicotinate)；生育酚烟酸酯是优选的。维生素B₃化合物的更完整的描述在WO 98/22085中。优选的维生素B₃化合物是烟酰胺和生育酚烟酸酯。

类视黄醇

另外适当的皮肤护理活性物是类视黄醇。如在此处所用的，“类视黄醇”包括维生素A或视黄醇样化合物的所有具有皮肤中维生素A的生物学活性的天然和/或合成的同系物以及这些化合物的几何异构体和立体异构体。当类视黄醇包括于此处的组合物中时，该组合物一般包含约0.005％～约2％、更优选地为0.01％～约2％的类视黄醇。视黄醇优选地以约0.01％～约0.15％的量使用；视黄醇酯优选地以约0.01％～约2％(如约1％)的量使用。

类视黄醇优选地为视黄醇、视黄醇酯(如视黄醇的C₂-C₂₂烷基酯，包括棕榈酸视黄酯、乙酸视黄酯、丙酸视黄酯)、视黄醛和/或视黄酸(包括全反式视黄酸和/或13-顺式-视黄酸)，更优选地为除视黄酸以外的类视黄醇。这些化合物是本领域中众所周知的，且可从许多来源商业地购得，如Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)和Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)。优选的类视黄醇是视黄醇、棕榈酸视黄酯、乙酸视黄酯、丙酸视黄酯、视黄醛、视黄酸及其组合。更优选的是视黄醇、丙酸视黄酯(retinoicpropionate)、视黄酸和棕榈酸视黄酯。类视黄醇可作为基本纯的材料或作为通过适当的物理和/或化学分离方法从天然(如植物)来源获得的提取物而包括在组合物中。

载体

此处的组合物可包含安全和有效量的皮肤病学可接受的载体，该载体适用于对皮肤或头发的局部应用，在其中结合了基本材料和可选择的其他材料以使得基本材料和可选择的其他材料能够以适当的浓度送递到皮肤或头发。因而该载体可充当该基本成分的稀释剂、分散剂、溶剂等，这确保它们可以以适当的浓度应用并均匀地分配到选择的目标上。

本发明中利用的载体的类型依赖于想要的组合物的产品形式类型。该载体可为固体的、半固体的或液体的。适当的载体为液体的或半固体的，如面霜、洗剂、凝胶、粘剂(sticks)、油膏、糊剂和摩丝(mousse)。优选地该载体为洗剂、面霜或凝胶的形式，更优选地为一种具有足够的浓度或流动点以防止颗粒沉积的形式。该载体自身可为惰性的或它可具有其自身的皮肤病学益处。该载体可直接应用于皮肤和/或头发，或者它可通过编织的或非编织的搌布或布应用。它也可为贴剂、面具或包裹的形式。也可将它成烟雾状散开或喷雾到皮肤和/或头发上。该载体也应该为与此处描述的基本成分物理地或化学地相容的，且不应该过度地消弱与本发明的组合物相关的稳定性、功效或其他使用益处。

优选的载体含有皮肤病学可接受的亲水稀释剂。适当的亲水稀释剂包括水、有机亲水稀释剂如C₁-C₄一元醇和低分子量二元醇和多元醇，这些醇包括丙二醇、聚乙二醇(如MW为200-600)、聚丙二醇(如MW为425-2025的)、甘油、丁二醇、1，2，4-丁三醇、山梨糖醇酯、1，2，6-hexametriol、乙醇、异丙醇、山梨糖醇酯、乙氧基酯、丙氧基酯及其组合。稀释剂优选地为液体。水是优选的稀释剂。组合物优选地包含至少约20％的亲水稀释剂。

适当的载体也可包含含有亲水相(尤其是水相)和疏水相(如脂类、油或油性材料)的乳剂。如本领域技术人员众所周知的，依赖于组合物的成分，亲水相可分散到疏水相中或反之亦然，以分别形成亲水或疏水的分散或连续相。在乳剂技术中，术语“分散相”是本领域技术人员众所周知的术语，指该相以悬浮于连续相或由连续相包围的小颗粒或小滴存在。分散相也已知为内部的或不连续的相。乳剂可为或包含(如在三相的或其它多相乳剂中)水包油乳剂或油包水乳剂如水在硅氧烷中的乳剂。水包油乳剂一般包含约1％～约60％的(优选地为约1％～约30％的)分散疏水相和约1％～约99％的(优选地为约40％～约90％的)连续亲水相；油包水乳剂一般包含约1％～约98％的(优选地为约40％～约90％的)分散亲水相和约1％～约50％的(优选地为约1％～约30％的)连续疏水相。

湿润剂

本发明的组合物可包含湿润剂，该湿润剂优选地以约0.01％～约20％的水平存在，更优选地为约0.1％～约15％且尤其在约0.5％～约10％。优选的湿润剂包括但不局限于下面的化合物，该化合物选自多元醇、尿素、D或DL泛酰醇、泛酸钙、王浆、panthetine、pantotheine、泛酰乙基醚、潘氨酸、吡哆醇、泛酰乳糖维生素B复合物(pantoyl lactose vitamin B complex)、己烷-1，2，6-三醇、胍或其衍生物，及其混合物。

此处所用的适当的多元醇包括聚二醇和更优选的亚烷基多元醇及其衍生物，这些醇包括丙二醇、双丙甘醇、聚丙二醇、聚乙二醇及其衍生物、山梨糖醇、羟丙基山梨糖醇、赤藓糖醇、苏糖醇、五赤藓糖醇(pentaerythritol)、木糖醇、葡萄糖醇、甘露醇、己二醇、丁二醇(如1，3-丁二醇)、己三醇(如1，2，6-己三醇)、三甲基醇丙烷(trimethylol propane)、新戊二醇、甘油、乙氧基甘油、丙烷-1，3-二醇、丙氧基甘油及其混合物。任何上述多元醇的烷氧基化衍生物也适用于此处的用途。本发明优选的多元醇选自甘油、丁二醇、丙二醇、双丙甘醇、聚乙二醇、己三醇、乙氧基甘油和丙氧基甘油及其混合物。

此处所用的湿润剂是2-吡咯烷酮-5-羧酸钠(NaPCA)、胍；乙醇酸和乙醇酸盐(如铵和四烷基铵)；乳酸和乳酸盐(如铵和四烷基铵)；其多种形式的任何一种的芦荟(aloe vera)(如芦荟凝胶)；透明质酸及其衍生物(如盐衍生物如透明质酸钠)；乳酰胺单乙醇胺；乙酰胺单乙醇胺；尿素；泛酰醇及其衍生物；以及其混合物。

至少部分的湿润剂(按重量至多为组合物的约5％)可以以与颗粒状交联的疏水丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯共聚物的混合物形式整合，其本身优选地以约0.1％～10％的量存在，可将它加入到水的或分散相中。该共聚物对于在有助于提供有效的潮湿化益处时减少发光及控制油是特别有价值的，并进一步详细描述于WO96/03964，此处引用作为参考。

润肤剂

本发明的水包油乳剂的实施方案可包含约1％～约20％的皮肤病学可接受的润肤剂，优选地为约1.5％～约15％，更优选地为约0.1％～约8％，更优选地为约0.5％～约5％。润肤剂可润滑皮肤、增加皮肤的柔滑和柔软、防止或减轻皮肤的干燥和/或保护皮肤。润肤剂一般是水不可混合的、油质或蜡质材料，且具有高分子量的润肤剂可赋予局部的组合物粘的性质。已知有许多适当的润肤剂并可在此处使用。Sagarin，Cosmetics，Science and Technology，2^ndEdition，Vol.1，pp.32-43(1972)含有许多适用于润肤剂的材料的例子。在申请WO 00/24372中讨论的所有润肤剂都应该认为适合于本发明的使用，尽管优选的例子进一步详细地在下面论述：

i)具有约7～约40个碳原子的直链和支链烃，如十二烷、角鲨烷、胆固醇、氢化的聚异丁烯、异十六烷、异二十烷、异六十八烷isohexapentacontahectane和C₇-C₄₀异链烷烃，该异链烷烃是C₇-C₄₀的支链烃。此处所用的适当的支链烃选自isopentacontaoctactane、矿脂及其混合物。适用于此处的是以商品名Permethyl(RTM)销售的支链脂族烃，且商业上购自PresperseInc.，P.O.Box 735，South Plainfield，N.J.07080，美国。

ii)C₁-C₃₀羧酸的、C_12-15烷基苯甲酸的和C₂-C₃₀二羧酸的C₁-C₃₀醇酯，如异壬酸异壬酯、新戊酸异硬脂酸酯、辛酸异癸酯、异壬酸异癸酯、异壬酸三癸酯、辛酸豆蔻酯、壬酸辛酯、异壬酸辛酯、豆蔻酸豆蔻酯、新戊酸豆蔻酯、辛酸豆蔻酯、豆蔻酸异丙酯、丙酸豆蔻酯、硬脂酸异丙酯、异硬脂酸异丙酯、异硬脂酸甲酯、山嵛酸山嵛酯、马来酸二辛酯、己二酸二异丙酯和二亚油酸二异丙酯及其混合物。

iii)糖和相关材料的C₁-C₃₀单-和多酯。这些酯源自糖或多元醇半分子和一种或多种羧酸半分子。依赖于成分酸和糖，这些酯在室温可为液体或固体形式的。例子包括：四油酸葡糖酯、油酸半乳糖四酯、四油酸山梨糖酯、四油酸蔗糖酯、五油酸蔗糖酯、六油酸蔗糖酯、七油酸蔗糖酯、八油酸蔗糖酯、山梨糖醇六酯(其中羧酸酯半分子为1∶2摩尔比例的棕榈油酸和花生酸)，以及蔗糖的八酯(其中酯化的羧酸半分子为1∶3∶4摩尔比例的月桂酸、亚油酸和山嵛酸)。其他材料包括蔗糖的棉籽油或豆油脂肪酸酯。这种材料的其他例子描述于WO 96/16636中，此处引用作为参考。特别优选的材料已知为INCI名称蔗糖聚棉籽油酸酯(sucrosepolycottonseedate)。

iv)植物油和氢化的植物油。植物油和氢化的植物油的例子包括红花油、椰子油、棉籽油、鲱油、棕榈籽油、棕榈油、花生油、豆油、菜籽油、亚麻子油、米糠油、松油、芝麻油、向日葵籽油、来自上述来源的部分或完全氢化的油及其混合物。

v)可溶的或胶状可溶的潮湿化剂。例子包括hylaronic acid和淀粉嫁接的聚丙烯酸钠，如Sanwet(RTM)IM-1000、IM-1500和IM-2500，购自Celanese Superabsorbent Materials，Portsmith，VA，美国，并描述于USA-A-4,076,663。

此处所用的优选地润肤剂为异十六烷、isooctacontane、矿脂、异壬酸异壬酯、辛酸异癸酯、异壬酸异癸酯、异壬酸三癸酯、辛酸豆蔻酯、异壬酸辛酯、豆蔻酸豆蔻酯、异硬脂酸甲酯、异硬脂酸异丙酯、C12-15烷基苯甲酸酯及其混合物。此处所用的特别优选地润肤剂为异十六烷、异壬酸异壬酯、异硬脂酸甲酯、异硬脂酸异丙酯、矿脂或其混合物。

乳化剂/表面活性剂

此处的组合物可含有乳化剂和/或表面活性剂，它们一般有助于使分散相在连续的水相中分散和悬浮。如果产物想要用于皮肤清洁时，表面活性剂也是有用的。为方便，在下文中将乳化剂称为术语“表面活性剂”，因而“表面活性剂”将用于指用作乳化剂或其他表面活性剂目的(如皮肤清洁)的表面活性试剂。已知的或常规的表面活性剂可用于组合物中，前提是选择的试剂是与组合物的基本成分物理或化学相容的，并提供想要的特征。适当的表面活性剂包括非硅氧烷衍生的材料及其混合物。所有描述于申请WO 00/24372中的表面活性剂都应该认为适用于本发明中。

本发明的组合物可包含约0.05％～约15％的表面活性剂或表面活性剂混合物。表面活性剂或表面活性剂混合物的选择将依赖于组合物的pH和存在的其他成分。

在此处所用的非离子型表面活性剂中的是那些可广泛地定义为长链醇如C_8-30醇与糖或淀粉聚合物即糖苷的缩合产物。其他有用的非离子型表面活性剂包括烯化氧与脂肪酸的缩合产物(即脂肪酸的烯化氧酯)。这些材料具有一般分子式RCO(X)nOH，其中R为C_10-30烷基基团，X为-OCH₂CH₂-(即源自乙二醇或氧乙烯的)或-OCH₂CHCH₃-(即源自丙二醇或氧丙烯的)，且n为约6～约200的整数。其他非离子型表面活性剂是氧化乙烯与2摩尔脂肪酸的缩合产物(即脂肪酸的氧化乙烯二酯)。这些材料具有一般分子式RCO(X)nOOCR，其中R为C_10-30烷基基团，X为-OCH₂CH₂-(即源自乙二醇或氧乙烯的)或-OCH₂CHCH₃-(即源自丙二醇或氧丙烯的)，且n为约6～约100的整数。此处所用的乳化剂最优选地为基于山梨聚糖脂肪酸酯和蔗糖脂肪酸酯混合物的脂肪酸酯混合物，尤其是硬脂酸山梨糖醇酯和sucrosecocoate的混合物。这以商品名Arlatone 2121商业上可购自ICI。再进一步适当的例子包括cetearyl alcohol、cetearyl glucoside的混合物，如那些以商品名Montanov 68可购自Seppic的和可购自Henkel的Emulgade PL68/50。

此处所用的亲水表面活性剂可选择地或额外地包括多种阳离子的、阴离子的、两性离子的和两性的表面活性剂的任何一种，如本领域中公知的。参见如McCutcheon’s，Detergents andEmulsifiers，North American Edition(1986)，由AlluredPublishing Corporation出版；于1991年4月30日授予Ciotti等人的美国专利No.5,011,681；于1983年12月20日授予Dixon等人的美国专利No.4,421,769；于1973年8月28日授予Dickert等人的美国专利No.3,755,560。多种阴离子表面活性剂在此处也是有用的。参见如于1975年12月30日授予Laughlin等人的美国专利No.3,929,678。

多种阴离子表面活性剂在此处也是有用的。参见如于1975年12月30日授予Laughlin等人的美国专利No.3,929,678。示范性阴离子表面活性剂包括alkoyl isethionates(如C₁₂-C₃₀)、烷基和烷基醚硫酸酯及其盐、烷基和烷基醚磷酸酯及其盐、烷基甲基牛磺酸酯(如C₁₂-C₃₀)、和脂肪酸的肥皂(如碱金属盐如钠或钾盐)。

两性的和两性离子的表面活性剂在此处也是有用的。可用于本发明的组合物的两性的和两性离子的表面活性剂的例子是那些广泛描述为脂族仲胺和叔胺的衍生物，其中脂族基团可为直链或支链的，且其中一种脂族成分含有约8～约22个碳原子(优选地为C₈-C₁₈)，且一种含有阴离子水溶基团如羧基、磺酸盐、硫酸盐、磷酸盐或磷酸酯。例子为烷基亚氨基乙酸酯和亚氨基二链烷酸酯和氨基链烷酸酯、咪唑啉鎓盐和铵衍生物。其他适当的两性的和两性离子的表面活性剂为那些选自甜菜碱、磺基甜菜碱、羟基磺基甜菜碱和分支的和未分支的烷酰基肌氨酸酯及其混合物。

本发明的一些乳剂可包括含有硅氧烷的乳化剂或表面活性剂。多种硅氧烷乳化剂在此处是有用的。这些硅氧烷乳化剂一般是有机修饰的有机多分子硅醚，对本领域的技术人员来说，其也称为硅氧烷表面活性剂。有用的硅氧烷乳化剂包括聚二甲基硅氧烷共聚醇。这些材料是聚二甲基硅氧烷，已对该聚二甲基硅氧烷进行修饰以包括聚醚侧链如聚环氧乙烷链、聚环氧丙烷链、这些链的混合物，以及含有源自氧化乙烯和氧化丙烯两者的半分子的聚醚链。其他的例子包括烷基修饰的聚二甲基硅氧烷共聚醇，即含有C₂-C₃₀侧链的化合物。其他有用的聚二甲基硅氧烷共聚醇包括具有多种阳离子、阴离子、两性的和两性离子的侧链半分子的材料。

多聚增稠剂

本发明的组合物可包含至少一种多聚增稠剂。此处有用的多聚增稠剂优选地具有超过20,000的数均分子量，更优选地为超过50,000且尤其超过100,000。本发明的组合物可包含按重量计约0.01％～约10％的多聚增稠剂组合物或其混合物，优选地为约0.1％～约8％且最优选地为约0.5％～约5％。

此处所用的优选地多聚增稠剂包括非离子型的增稠剂和阴离子增稠剂或其混合物。适当的非离子型增稠剂包括聚丙烯酰胺多聚体、交联的聚(N-乙烯吡咯烷酮)、多糖、天然或合成的树胶、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。适当的阴离子增稠剂包括丙烯酸/丙烯酸乙酯共聚物、羧基乙烯基多聚体和交联的烷基乙烯醚和顺丁烯二酸酐的共聚物。此处所用的特别优选地增稠剂为非离子型的聚丙烯酰胺多聚体，如聚丙烯酰胺和异链烷烃和laureth-7，以商品名Sepigel 305购自Seppic Corporation，和由B.F.Goodrich Company以商标Carbopol树脂销售的丙烯酸/丙烯酸乙酯共聚物和羧基乙烯基多聚体或其混合物。适当的Carbopol树脂可为进行了疏水修饰的，以及其他描述于W098/22085中的适当的树脂，或其混合物。

硅油

本组合物可包含至少一种硅油相。硅油相一般占组合物的约0.1％～约20％的组合物，优选地为约0.5％～约10％，更优选地为约0.5％～约5％。硅油相或其每一个都优选地包含一种或多种硅氧烷成分。

硅氧烷成分可为流体，包括直链的、分支的和环状的硅氧烷。此处所用的适当的硅氧烷流体包括聚烷基硅氧烷流体、聚芳基硅氧烷流体、环状和线状聚烷基硅氧烷、聚烷氧基硅氧烷、氨基和季铵修饰的硅氧烷、聚烷基芳基硅氧烷或聚醚硅氧烷共聚物及其混合物。硅氧烷流体可为挥发性的或非挥发性的。硅氧烷流体一般具有低于约200,000的重均分子量。适当的硅氧烷流体具有约100,000或更低的分子量，优选地为约50,000或更低，最优选地为约10,000或更低。硅氧烷流体优选地选自具有约100～约50,000(更优选地为约200～约40,000)的重均分子量的硅氧烷流体。一般地，硅氧烷流体在25℃具有约0.65～约600,000mm².s^-1的粘度，优选地为约0.65～约10,000mm².s^-1。粘度可依靠在1970年7月29日Dow CorningCorporate Test Method CTM0004提出的玻璃毛细管粘度计来测量。此处可用的适当的聚二甲基硅氧烷包括那些作为SF和Viscasil(RTM)系列可从General Electric Company购得的和作为DowCorning 200系列可从Dow Corning购得的。同样可用的是基本非挥发性的聚烷基芳基硅氧烷，例如聚甲基苯基硅氧烷，其在25℃具有约0.65～30,000mm².s^-1的粘度。这些硅氧烷是例如作为SF 1075甲基苯基流体可从General Electric Company购得的或作为556Cosmetic Grade Fluid可从Dow Corning购得的。适用于此处的环状的聚二甲基硅氧烷为那些具有整合了约3～约7个(CH₃)₂SiO半分子的环结构的。

硅氧烷树胶也可用于此处。此处术语“硅氧烷树胶”指具有超过约200,000的重均分子量的高分子量硅氧烷，且优选地为约200,000～4,000,000。包括的是非挥发性的聚烷基和聚芳硅氧烷树胶。在优选的实施方案中，硅油相包含硅氧烷树胶或包括硅氧烷树胶的硅氧烷混合物。一般地，硅氧烷树胶在25℃具有超过约1,000,000mm²s^-1的粘度。硅氧烷树胶包括由Petrarch及其他人描述的聚二甲基硅氧烷，后者包括1979年5月1日授予Spitzer等人的US-A-4,152,416和Noll，Walter，Chemistry and Technology ofSilicones，New York：Academic Press 1968。同样描述硅氧烷树胶的是General Electric Silicone Rubber Product Data SheetsSE30、SE33、SE54和SE76。硅氧烷树胶特定的例子包括聚二甲基硅氧烷、(聚二甲基硅氧烷)(甲基乙烯基硅氧烷)共聚物、聚(二甲基硅氧烷)(二苯基)(甲基乙烯基硅氧烷)共聚物及其混合物。此处所用的优选的硅氧烷树胶为具有约200,000～约4,000,000的分子量的硅氧烷，该硅氧烷选自聚二甲基硅氧烷醇、聚二甲基硅氧烷共聚物、聚二甲基硅氧烷及其混合物。

此处硅氧烷相优选地包含作为部分的硅氧烷树胶流体混合物整合入组合物的硅氧烷树胶。当将硅氧烷树胶作为部分的硅氧烷树胶流体混合物整合时，硅氧烷树胶优选地组成按重量计约5％～约40％的硅氧烷树胶流体混合物，尤其为约10％～20％。此处适当的硅氧烷树胶流体混合物是基本由下面物质组成的混合物：

(i)具有约200,000～约4,000,000的分子量的硅氧烷，该硅氧烷选自聚二甲基硅氧烷醇、氟硅氧烷和聚二甲基硅氧烷及其混合物，和

(ii)硅氧烷流体载体，该载体具有约0.65mm².s^-1～约100mm².s^-1的粘度。

其中i)与ii)的比例为约10∶90～约20∶80，且其中基于该硅氧烷树胶的成分具有约100mm².s^-1～约100,000mm².s^-1的终粘度，优选地为约500mm².s^-1～约10,000mm².s^-1。

适用于此处的硅油相的进一步的硅氧烷成分为交联的聚硅氧烷多聚体，可选择地分散于流体载体中。通常，当存在时，交联的聚硅氧烷多聚体与其载体一起(如果存在时)占组合物的0.1％～约20％，优选地为约0.5％～约10％，更优选地为约0.5％～约5％。这种多聚体包含用交联剂交联的聚硅氧烷多聚体。适当的交联剂描述于WO98/22085中。此处所用的适当的聚硅氧烷多聚体的例子包括甲基乙烯基聚二甲基硅氧烷、甲基乙烯基二苯基聚二甲基硅氧烷和甲基乙烯基苯基甲基二苯基聚二甲基硅氧烷。

适用于此处硅油相的另一类硅氧烷成分包括聚二有机基硅氧烷-聚氧化烯共聚物，该共聚物含有至少一个聚二有机基硅氧烷片段和至少一个聚氧化烯片段。适当的聚二有机基硅氧烷片段及其共聚物公开于WO98/22085中。适当的聚二有机基硅氧烷-聚氧化烯共聚物以商品名Belsil(RTM)可商业上购自Wacker-Chemie GmbH，Geschftsbereich S，Postfach D-8000 Munich 22和以Abil(RTM)购自Th.Goldschmidt Ltd.，Tego House，VictoriaRoad，Ruislip，Middlesex，HA4 OYL，如Belsil(RTM)6031和Abil(RTM)B88183。此处所用的特别优选的共聚物流体混合物包括Dow Corning DC3225C，它具有CTFA名称Dimethicone/Dimethiconecopolyol。

防晒剂

本发明的组合物可包含有机防晒剂。适当的防晒剂可具有UVA吸收性质、UVB吸收性质或其混合性质。活性防晒剂的精确量将依赖于想要的组合物的阳光保护因子即“SPF”以及想要的UV保护水平而变化。本发明的组合物优选地包含至少10的SPF，优选地为至少15。SPF是防晒剂对红斑的光保护的常用测量指标。SPF定义为在保护的皮肤上产生最小的红斑所必需的紫外线能量与在相同的个体未保护的皮肤上产生相同的最小红斑所必需的紫外线能量之间的比例。参见Federal Register，43，No 166，pp.38206-38269，1978年8月25日。所用的防晒剂的量一般为约2％～约20％，更一般地为约4％～约14％。适当的防晒剂包括但不局限于那些发现于CTFAInternational Cosmetic Ingredien t Dictionary and Handbook，7^th edition，第2卷第1672页中的，由Wenninger和McEwen编辑(The Cosmetic，Toiletry，and Fragrance Association，Inc.，Washington，D.C.，1997)。

本发明的组合物可包含吸收UV辐射的UVA吸收防晒剂活性物，该辐射具有约320nm～约400nm的波长。适当的UVA吸收防晒剂活性物选自二苯甲酰甲烷衍生物、邻氨基苯甲酸盐衍生物如氨茴酸甲酯和同甲基(homomethyl)1-N-氨茴酸乙酯(1-N-acetylanthranilate)及其混合物。二苯甲酰甲烷防晒剂活性物的例子描述于授予Depolo的美国专利No 4,387,089和由N.J.Lowe和N.A.Shaath编辑的Sunscreens：Development，Evaluation，andRegulatory Aspects，Marcel Dekker，Inc(1990)中。UVA吸收防晒剂活性物优选地以单独地或与可存在于组合物中的其他UV保护性活性物一起提供广谱UVA保护的量存在。

适当的UVA防晒剂活性物为二苯甲酰甲烷防晒剂活性物及其衍生物。它们包括但不局限于那些选自2-甲基二苯甲酰甲烷、4-甲基二苯甲酰甲烷、4-异丙基二苯甲酰甲烷、4-叔丁基二苯甲酰甲烷、2，4-二甲基二苯甲酰甲烷、2，5-二甲基二苯甲酰甲烷、4，4’-二异丙基苯甲酰甲烷、4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷、2-甲基-5-异丙基-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷、2-甲基-5-叔丁基-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷、2，4-二甲基-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷、2，6-二甲基-4’-叔丁基-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷及其混合物的。优选的二苯甲酰防晒剂活性物包括那些选自4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷、4-异丙基二苯甲酰甲烷及其混合物的。优选地防晒剂活性物是4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷。

也称为丁基甲氧基二苯甲酰甲烷或Avobenzone的防晒剂活性物4-(1，1-二甲基乙基)-4’-甲氧基二苯甲酰甲烷是商业上可以以Parsol1789的名字从Givaudan Roure(International)S.A.(Basel，瑞士)购得的和以Eusolex9020从Merck & Co.，Inc(Whitehouse Station，NJ)购得的。也称为异丙基二苯甲酰甲烷的防晒剂4-异丙基二苯甲酰甲烷是商业上以Eusolex8020的名字可从Merck购得的。

本发明的组合物可进一步包含UVB防晒剂活性物，该防晒剂活性物吸收具有约290nm～约320nm波长的UV辐射。该组合物包含一定量的UVB防晒剂，该量对于独立地或与其他可存在于组合物中的UV保护性活性物一起提供UVB保护为安全和有效的。该组合物可包含按重量约0.1％～约16％的UVB吸收有机防晒剂，更优选地为约0.1％～约12％，且最优选地为约0.5％～约8％。

多种UVB防晒剂活性物适用于此处。这种有机防晒剂活性物的非限制性的例子描述于1992年2月11日授予Haffey等人的美国专利No 5,087,372；和均于1991年12月17日授予Turner等人和Segarin等人的美国专利Nos 5,073,371和5,073,372，在Cosmetics Sciences and Technology的第VIII章第189页以及下列等等。其他有用的防晒剂是那些公开于1990年6月26日授予Sabatelli的美国专利No.4,937,370和1991年3月12日授予Sabatelli等人的美国专利No.4,999,186中的。优选地UVB防晒剂活性物选自2-乙基己基-2-氰基-3，2-乙基己基N，N-二甲基-对氨基苯甲酸盐、对氨基苯甲酸、oxybenzone、水杨酸高薄荷酯(homomenthyl salicylate)、水杨酸辛酯、4，4’-甲氧基-叔丁基二苯甲酰甲烷、4-异丙基二苯甲酰甲烷、3-亚苄基樟脑、3-(4-甲基亚苄基)樟脑、3-二苯基丙烯酸盐(指氰双苯丙烯酸辛酯)、2-苯基-苯并咪唑-5-磺酸(PBSA)、肉桂酸盐及其衍生物如2-乙基己基-对-甲氧基肉桂酸盐和辛基-对-甲氧基肉桂酸盐、TEA水杨酸盐、辛基二甲基PABA、樟脑衍生物及它们的衍生物，及其混合物。优选的有机防晒剂活性物为2-乙基己基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸盐(称为氰双苯丙烯酸辛酯)、2-苯基-苯并咪唑-5-磺酸(PBSA)、辛基-对-甲氧基肉桂酸盐及其混合物。酸性防晒剂的盐和酸中和的形式也用于此处。

也可将试剂加入到本发明中所用的任何组合物中以使UVA防晒剂稳定以防止其在暴露于UV辐射中时导致光降解，并因此维持其UVA保护功效。已提到大量化合物可提供这些稳定性质，并应该选择这些化合物以总体上组合(compliment)UVA防晒剂和组合物。适当的稳定剂包括但不局限于那些描述于美国专利Nos 5,972,316；5,968,485；5,935,556；5,827,508和Patent WO00/06110中的。用于本发明的稳定剂的优选的例子包括2-乙基己基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯(称为氰双苯丙烯酸辛酯)、乙基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯、2-乙基己基-3，3-二苯基丙烯酸酯、乙基-3，3-双(4-甲氧基苯基)丙烯酸酯及其混合物。2-乙基己基-2-氰基-3，3-二苯基丙烯酸酯是最优选的。

也可将一种试剂添加到本发明所用的每一种组合物中以改进那些组合物的皮肤直接性(substantivity)，特别是增强其对被水洗去或擦掉的抗性。提供该益处的一种优选的试剂是乙烯和丙烯酸的共聚物。包含该共聚物的组合物公开于1987年5月5日授予Brock的美国专利4,663,157中。

除有机防晒剂之外，本发明的组合物可额外包含无机物理防晒剂。适当的物理防晒剂的非限制性例子描述于CTFA InternationalCosmetic Ingredient Dictionary，6^th Edition，1995，pp.1026-28和1103，Sayre，R.M.等人，“Physical Sunscreens”，J.Soc.Cosmet.Chem.，vol 41，no 2，pp.103-109(1990)中。优选的无机物理防晒剂是氧化锌和二氧化钛及其混合物。

当使用时，物理防晒剂是以这样的量存在的，从而使得本组合物在皮肤上是透明的(即没有变白的)，优选地少于或等于约5％。当使用了二氧化钛时，它可具有锐钛矿、金红石或无定形的结构。物理防晒剂颗粒如二氧化钛和氧化锌可不用多种材料包被或用多种材料包被，该材料包括但不局限于氨基酸、铝化合物如氧化铝、硬脂酸铝、月桂酸铝等；羧酸及其盐如硬脂酸及其盐；磷脂如卵磷脂；有机硅氧烷化合物；无机硅氧烷化合物如硅石和硅酸盐；以及其混合物。优选的二氧化钛商业上以MT micro-ionised系列(如MT 100SAS)购自Tayca(Japan)并由Tri-K Industries(Emerson，NJ)分发。本发明的组合物可包含按重量约0.1％～约10％的无机防晒剂，更优选地为约0.1％～约4％，且最优选地为约0.5％～约2.5％。

抗微生物和抗真菌活性物

此处组合物也可包含抗微生物和抗真菌活性物。此处所用的抗微生物和抗真菌活性物的非限制性例子包括β-内酰胺药物、喹诺酮药物、环丙沙星、诺氟沙星、四环素、红霉素、氨羟丁卡那霉素A、2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯基醚、3，4，4’-trichlorobanilide、苯氧基乙醇、苯氧基丙醇、苯氧基异丙醇、强力霉素、卷曲霉素、氯己定、金霉素、土霉素、氯林肯霉素、乙胺丁醇、己脒定、伊西酸盐、甲硝基羟乙唑、喷他脒、艮他霉素、卡那霉素、lineomycin、甲烯土霉素、六胺、二甲胺四环素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、链霉素、妥布拉霉素、霉抗唑、盐酸四环素、红霉素、红霉素锌、依托红霉素、硬脂酸红霉素、硫酸阿米卡星、盐酸强力霉素、硫酸卷曲霉素、葡糖酸氯己定、盐酸氯己定、盐酸金霉素、盐酸土霉素、盐酸氯林肯霉素、盐酸乙胺丁醇、盐酸甲硝基羟乙唑、盐酸喷他脒、硫酸艮他霉素、硫酸卡那霉素、盐酸lineomycin、盐酸甲烯土霉素、马尿酸六胺、扁桃酸六胺、盐酸二甲胺四环素、硫酸新霉素、硫酸奈替米星、硫酸巴龙霉素、硫酸链霉素、硫酸妥布拉霉素、盐酸霉抗唑、盐酸amanfadine、硫酸amanfadine、octopirox、对氯间二甲苯酚、制霉菌素、发癣退、克霉唑、鲸蜡基氯化吡啶鎓(CPC)、吡罗克酮乙醇胺、二硫化硒、酮康唑、三氯卡班、triclosan、吡硫锌、伊曲康唑、亚洲积雪草酸、扁柏酚、mipirocin及那些描述于EPA0,680,745中的(此处引用作为参考)、盐酸clinacycin、苯甲酰过氧化物、苄基过氧化物、美浓霉素、苯氧基异丙醇及其混合物。

其他可选择的成分

多种可选择的成分如中和试剂、香料和染料也可加入到此处的组合物中。优选地是任何额外的成分增强产物的皮肤柔和/柔滑优点。此外，优选地是任何这种成分不对产物的美学性质产生负影响。同样地，蛋白质如胶原蛋白和弹性蛋白的高水平在本发明所用的组合物中不是优选的。

本发明的组合物也可含有约0.01％～约10％的泛酰醇潮湿化剂，优选地为约0.1％～约5％。泛酰醇潮湿化剂可选自D-泛酰醇([R]-2，4-二羟基-N-[3-羟丙基])-3，3-二甲基丁酰胺(dimethylbutamide)、DL-泛酰醇、泛酸钙、王浆、panthetine、pantotheine、panthenyl ethyl ether、潘氨酸、吡哆醇、泛酰乳糖。

适用于中和此处含有亲水胶凝剂的酸性基团的中和试剂包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、单乙醇胺、二乙醇胺、氨基甲基丙醇、tris-缓冲液和三乙醇胺。

其他可选择的材料包括溶角蛋白剂(keratolytic agent)；优选地在约0.1％～约5％水平的水溶性或增溶的防腐剂，如Germall115、羟基苯甲酸的甲基、乙基、丙基和丁基酯、苄醇、以商品名Glydant Plus可购自Lonza的DMDM乙内酰脲碘丙基丁基碳酸酯、EDTA、Euxyl(RTM)K400、Bromopol(2-溴基-2-硝基丙烷-1，3-二醇)和苯氧基丙醇；抗细菌剂如Irgasan(RTM)和苯氧基乙醇(优选地在0.1％～约5％的水平上)；可溶性或胶状可溶性潮湿化剂如hylaronic acid和淀粉嫁接的聚丙烯酸钠，如Sanwet(RTM)IM-1000、IM-1500和IM-2500，购自Celanese SuperabsorbentMaterials，Portsmith，VA，美国并描述于USA-A-4,076,663；维生素如维生素A、维生素C、维生素E及其衍生物和其结构单元(building blocks)如植烷三醇和维生素K及其成分如脂肪醇十二碳三烯醇(fatty alcohol dodecatrienol)；α和β羟酸；芦荟；鞘氨醇和植物鞘氨醇、胆固醇；皮肤变白剂；N-乙酰半胱氨酸；染料；抗细菌剂如TCC/TCS，也称为三氯生和trichlorocarbon；香料和香料增溶剂。α羟酸的例子包括乙醇酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、与乙醇酸铵结合的乙醇酸、α-羟基乙酸、α-羟基辛酸、α-羟基辛酸、羟基辛酸、混合的水果酸、三-α羟基水果酸、三水果酸、甘蔗提取物、α羟基和botanical comprise、I-α羟酸和交联的脂肪酸αnutrium中的glycomer。α羟酸优选的例子为乙醇酸和乳酸。优选的是α羟酸在至多10％的水平上使用。

可将安全和有效量的抗炎剂加入到本发明中的组合物中，该量优选地为约0.1％～约5％的组合物，更优选地为约0.1％～约2％。抗炎剂增强了本发明的皮肤外观益处，如这种试剂有助于更均一的和可接受的肤色或颜色。在组合物中所用的抗炎剂的精确量将依赖于利用的特定的抗炎剂，这是因为这种试剂在能力上有变化。

本发明的组合物可进一步包括抗氧化剂/自由基清除剂。该抗氧化剂/自由基清除剂尤其对于提供对可导致角质层皮屑增加和肌理变化的UV辐射和对其他可导致皮肤损害的保护是有用的。适当的量为组合物的约0.1％～约10％，更优选地为约1％～约5％。抗氧化剂/自由基清除剂如抗坏血酸(维生素C)及其盐。

加入螯合剂对于提供对可导致过度的皮屑或皮肤肌理变化的UV辐射和对其他可导致皮肤损害的保护是尤其有用的。适当的量为组合物的约0.01％～约1％，更优选地为约0.05％～约0.5％。此处所用的示范性螯合剂公开于美国专利No.5,487,884中，此处引用作为参考。本发明中所用的优选的螯合剂是乙二胺四乙酸(EDTA)、糠偶酰二肟及其衍生物。

本发明的组合物也可包含皮肤增光剂(lightening agent)。当使用时，该组合物优选地包含约0.1％～约10％的皮肤增光剂，更优选地为约0.2％～约5％，同样优选地为约0.5％～约2％。适当的皮肤增光剂包括那些本领域中公知的，包括曲酸、熊果苷、抗坏血酸及其衍生物，如磷酸抗坏血酸酯镁盐。适用于此处的进一步的皮肤增光剂也包括那些描述于WO 95/34280和WO 95/23780中的；将每一个文献在此处引用作为参考。

其他可选择的材料包括优选地在约0.1％～约5％水平的水溶性或增溶的防腐剂，如Germall 115、羟基苯甲酸的甲基、乙基、丙基和丁基酯、苄醇、以商品名Glydant Plus可购自Lonza的DMDM乙内酰脲碘丙基丁基碳酸酯、EDTA、Euxyl(RTM)K400、Bromopol(2-溴-2-硝基丙烷-1，3-二醇)和苯氧基丙醇；抗细菌剂如Irgasan(RTM)和苯氧基乙醇(优选地在0.1％～约5％的水平上)。抗细菌剂如TCC/TCS(也称为三氯生和trichlorocarbon)在本发明的组合物中也是有用的。

此处的其他可选择的材料包括色素，该色素如是水不溶性的，则有助于并包括在油相成分的总水平中。适用于本发明的组合物的色素可为有机的和/或无机的。在术语色素中同样包括的是具有低的色彩和光泽的材料，如打毛剂(matte finishing agent)，及光散射剂。本发明的组合物优选地包含具有约1.3～约1.7的折射率的颗粒状材料，该颗粒状材料分散于组合物中并具有约2～约30μm的中值颗粒大小。此处所用的颗粒优选地具有相对窄的分布，这意味着超过50％的颗粒落在各自中值两侧的3μm内。同样优选的是超过50％的颗粒落在为各自中值限定的大小范围内，优选地为超过60％的，更优选地为超过70％的。适当的颗粒状材料为有机的或有机硅氧烷，且优选地为有机硅氧烷聚合物。优选的颗粒是自由流动的固体材料。“固体”指颗粒不是空的。空颗粒中部的空间对于折射率具有负作用，并因此对皮肤或组合物上的颗粒的视觉效应有负作用。适当的有机颗粒材料包括那些由上文提到的polymethylsilsesquioxane、聚酰胺、聚乙烯、聚丙烯腈、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯、聚四氟乙烯(PTFE)和聚偏1，1-二氯乙烯制成的。也可使用源自上述材料的单体的共聚物。无机材料包括硅石和一氮化硼。此处有用的颗粒状材料的代表性商业上可购得的例子为具有约4.5μm的中值颗粒大小的Tospearl和来自Kobo的具有约10μm的中值颗粒大小的乙烯/丙烯酸共聚物EA-209，以商品名Orgasol 2002可购自法国ElfAtochem的Nylon-12，或其混合物。

适当的色素的进一步的例子为二氧化钛、购自Kobo的预先分散的二氧化钛如Kobo GWL75CAP、氧化铁、酰基谷氨酸盐(acyglutamate)氧化铁、群青色、D & C染料、洋红及其混合物。依赖于组合物的类型，通常使用色素的混合物。从潮湿化、皮肤感觉、皮肤外观和乳剂相容性的视点看，此处所用的优选的色素为处理的色素。色素可用化合物如氨基酸、硅氧烷、卵磷脂和酯油来处理。

适当地，此处组合物的pH在约6.1～约10.0的范围内，其中将终组合物的pH通过(必要时)添加酸性、碱性或缓冲盐来调节。

组合物制备

本发明的组合物是通过本领域技术人员众所周知的标准技术制备的。通常水相和/或油相将单独制备，其中相似相分离的材料可以以任意顺序加入。如果终产物是乳剂，两相然后将通过激烈的搅动结合。制剂中具有高挥发性的或易于在高温水解的任何成分可在到该过程结束时边温和搅动边加入，如果可行可在乳化之后加入。

具有减少的变应原性的蛋白酶也可用于对纺织品的处理中。“纺织品处理”包含以下过程，其中对可编织、粘结或编结为纺织品的纺织品、单独的纱或纤维进行处理以实现想要的特征。这种想要的特征的例子为“耐洗(stone-washing)”、脱毛(depilling)、去毛、退浆、软化和其他本领域技术人员众所周知的纺织品处理。

在本发明的一个实施方案中，此处鉴定的抗原决定部位可用于引起免疫反应，如在想要产生抗包括一个或两个这种抗原决定部位的的抗体时。这种抗体可用于如筛选其他的蛋白酶，该蛋白酶包括这种区域的一个或两个或者与其高度同源的区域。因此，本发明提供了包括下列序列的一种或两者的蛋白酶：解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶的(i)残基70-84和/或(ii)残基109-123。本发明可实现为利用分离的天然抗原决定部位、重组蛋白质或代表特定抗原决定部位区域的合成肽的测定，该测定用于估计人对包括这些或高度同源的区域的蛋白质的致敏性。

在另一个实施方案中，此处的抗原决定部位片段可用于抗原呈递细胞的探测，该抗原呈递细胞具有能够结合并展示这种片段的MHC分子。例如，抗原决定部位片段可包括可探测的标记(如放射性标记)。然后该标记的片段可与目标细胞温育，然后可探测结合(或展示)了标记片段的细胞。

应理解的是本发明延伸到想要对其调节免疫原性反应的所有蛋白质，例如用作T-细胞疫苗的肽或用作对抗如癌、传染病和自身免疫疾病的治疗剂的肽或蛋白质。

疫苗和/或治疗剂可与药物可接受的载体结合使用。如在此处所用的，“药物可接受的”成分是那些适用于人和/或动物的，且无不适当的有害副作用(如毒性、刺激和变态反应)，与合理的利/害比相称。如在此处所用的，“药物载体”是用于将具有减少的变应原性的蛋白酶送递到动物或人中的药物可接受的溶剂、悬浮剂或载体。载体可为液体的或固体的，并根据头脑中计划的给予方式来选择。示范性液体载体包括无菌的盐水、水、缓冲液、有机溶剂及其组合。

剂量将依赖于温血动物的物种或人以及进行处理的病毒而广泛变化。当然，给予的剂量将依赖于已知的因素而变化，如特定的试剂的药物动力学特征及其给予模式和途径；受体的年龄、健康和/或体重；症状的特性和程度；药物和病人的代谢特征、同时治疗的种类；治疗的频率；或想要的效果。

通常少至约每千克(kg)身体质量1毫克(mg)的剂量是适当的，但优选地为少至10mg/kg的，且可用达10,000mg/kg的。优选地使用了10mg/kg～约5000mg/kg。最优选地，剂量为250mg/kg～约5000mg/kg。用于局部减少免疫原性反应的剂量为250mg/kg、500mg/kg、2500mg/kg、3500mg/kg、4000mg/kg、5000mg/kg和6000mg/kg。可使用任何剂量范围。通常改变的免疫原性蛋白酶可在日基础上每日给予一次或多次，或者减少的免疫原性的蛋白酶可以以一日中单个剂量或分开的剂量每星期给予1～4次。在至少几个星期的时段内每周两次是优选的，且给药经常持续到延长的时段并可能为病人的一生。然而，剂量或剂量制度将依赖于病人维持血液中想要的和有效的抗病毒试剂血浆水平的能力而改变。

静脉内给予时，最优选的剂量为在恒定速率的注入过程中约1～约10mg/kg/分钟。

对人的剂量一般少于用于小鼠的，且一般为在小鼠中有效的剂量的约1/12。因而，如果500mg/kg在小鼠中是有效的，那么42mg/kg的剂量即可用于人中。对于60kg的人，该剂量将为2520mg。

本发明的化合物可通过任何适当的方式给予，该方式包括但不局限于如口腔的、直肠的、鼻的、局部的(包括经皮肤的、气溶胶、口的和舌下的)、阴道的、肠胃外的(包括皮下的、肌内的、静脉内的和皮内的)、膀胱内的或注射入病毒或其周围。

剂量是基于在抗病毒研究中观察的有效抑制浓度的。优选的途径将根据(1)受体的状况和年龄，(2)要处理的病毒(3)传染病的特性和(4)想要的血液水平而改变。据信对本发明用适当的载体、其他抗病毒剂或化合物或稀释剂制备的化合物通过静脉内、皮下或肌内应用的肠胃外治疗以促进应用将成为将化合物给予温血动物的优选的方法。

此处引用的所有出版物和专利均在此处整体引用作为参考。下面是以例子的途径提供的，且不应该理解为对权利要求范围的限制。

                     实施例

                     实施例1

                   皮肤护理产品

“次要成分(minor)”包含：pH调节物、防腐剂、粘度调节物和香料。除非另外说明，量代表近似的重量百分比，且不打算指示特殊数字(significant digit)。

增湿沐浴露(bodywash)                           pH＝7

原材料量去离子水甘油PEG-6辛酸/癸酸甘油酯棕榈籽脂肪酸Sodium Laureth-3硫酸盐Cocamide MEASodium Lauroamphoacetate豆油Polyquaternium-10(JR30M)蛋白酶QS4.04.03.045.03.025.010.00.701000ppm

沐浴露                                     pH 6.5      pH 7        pH 8.5

原材料 量 量 量去离子水Sodium Laureth SulphateCocamidopropyl BetaineAPG葡糖苷(Plantacare 2000 ¹)Polyquaternium-10(JR30M)Polyquaternium-7(Mackam 55)蛋白酶 QS 12 8 0 0.25 0 250ppm QS 15 10 2 0 0 500ppm QS 8 15 1 0 0.7 1000ppm

1-Cognis

身体洗剂(Lotion)                          pH 7          pH 7          pH 7.5        pH 7

原材料 量 量 量 量去离子水甘油异十六烷 烟酰胺异硬脂酸异丙酯聚丙烯酰胺、异链烷烃、Laureth-7(Sepigel 305²)矿脂尼龙12聚二甲基硅氧烷(DC1403⁴)蔗糖聚棉籽油十八烷醇97％D泛酰醇DL-α生育酚乙酸酯鲸蜡醇95％山嵛醇(behynyl alcohol)Emulgade PL 68/50硬脂酸Peg-100-硬脂酸盐(MYRJ 59¹)蛋白酶 QS 8 3  0 3 3 4 2 2 1.5 1 1 1 0.5 1 0.4 0.15 0.15 50ppm QS 8 3  3 3  3 4 2 2 1.5 1 1 1 0.5 1 0.4 0.15 0.15 50ppm QS 10 3  5 3  3 4 2.5 2.5 1.5 1 1 1 0.5 1 0.5 0.15 0.15 250ppm QS 12 6  6 3  3 2 2.5 2.5 1.5 1 1 1 1 0.5 0.5 0.15 0.15 1000ppm

1-Uniqema

2-Seppic

4-Dow Corning

超高增湿面部面霜/洗剂                                      pH 7       pH 7

原材料 量 量去离子水甘油PEG 400⁶烟酰胺异十六烷聚二甲基硅氧烷(DC1403³)聚丙烯酰胺、异链烷烃、Laureth-7(Sepigel 305¹)异硬脂酸异丙酯polymethylsilsesquioxane鲸蜡醇95％蔗糖聚棉籽油D泛酰醇维生素E(生育酚乙酸酯)十八烷醇95％Cetearyl葡糖苷二氧化钛硬脂酸PEG-100-硬脂酸盐(Myrj 59⁴)蛋白酶 QS 12 0 5 5 3 3 2 2 1 1 1 1 0.5 0.5 0.3 0.15 0.15 500ppm QS 5 10 7 5 2 3 2 2 1 1 1 1 0.5 0.5 0.3 0.15 0.15 500ppm

1-Seppic

3-Dow Corning

4-Uniqema

5-Scher Chemicals

6-Dow Chemicals

面部增湿面霜剂                                         pH 7          pH 7          pH 7.5

原材料 量 量 量去离子水甘油矿脂鲸蜡醇95％聚二甲基硅氧烷copolyol(DC 3225C⁴)棕榈酸异丙酯Carbomer 954 2聚二甲基硅氧烷(DC 200/350cs⁴)十八烷醇97％硬脂酸Peg-100-硬脂酸盐(MYRJ 59¹)二氧化钛蛋白酶 QS 3 3 1.5 2 1 0.7 1 0.5 0.1 0.1 0.3 50ppm QS 5 3 1.5 2 1 0.7 1 0.5 0.1 0.1 0.3 250ppm QS 10 0 1 2 0.5 0.7 1 1 0.1 0.1 0.3 1000ppm

1-Uniqema

2-BF Goodrich

4-Dow Corning

                       实施例2

用未实验过的人T-细胞对肽T-细胞抗原决定部位进行鉴定的测定

从“未实验过的”人中收集新鲜人外周血细胞用于确定来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶和人枯草杆菌蛋白酶中的抗原性抗原决定部位，该“未实验过的”人即已知未暴露于或不对迟缓芽孢杆菌蛋白酶致敏的人。未实验过的人意指已知在过去未暴露于蛋白酶中或未发展对蛋白酶的反应。如下制备外周单核血细胞(贮藏于室温，不老于24小时)以供使用：将来自1单位全血的约30ml棕黄层制剂溶液置于50ml Dulbecco氏磷酸盐缓冲溶液(DPBS)中并分为两个试管。将样品置于12.5ml室温lymphoprep密度分离介质(Nycomed密度1.077g/ml)的下面。将试管在600G离心30分钟。收集两相的界面，汇聚并在DPBS中洗涤。结果所得的溶液中的细胞浓度是用血细胞计数器进行测量的。生存力是用锥虫蓝排除(trypan blueexclusion)来测量的。

从结果所得的溶液中，以如下方式自外周血单核细胞样品制备了分化的树突细胞培养物，该样品具有培养基烧瓶中的每75ml溶液10⁸个细胞的密度：

(1)将50ml无血清的AIM V培养基(Gibco)用1∶100稀释的β-巯基乙醇(Gibco)来补充。将烧瓶在5％的CO₂中于37℃平放2小时以使得单核细胞粘着到烧瓶壁上。

(2)单核细胞向树突细胞的分化如下：将非粘着的细胞去除并使结果所得的粘着细胞(单核细胞)与30ml AIM V、800单位/mlGM-CSF(Endogen)和500单位/ml IL-4(Endogen)组合；将结果所得的混合物在5％的CO₂中于37℃的条件培养5天。5天后，将细胞因子TNFα(Endogen)加到0.2单位/ml的终浓度，并将细胞因子IL-1α(Endogen)加到50单位/ml的终浓度，然后将混合物在5％的CO₂中于37℃温育另外2天。

(3)在第7天，将丝裂霉素C加到50微克/ml的浓度以使现在分化的树突细胞培养物的生长停止。将溶液在5％的CO₂中于37℃温育60分钟。通过用细胞刮棒轻轻地将粘着的细胞刮到烧瓶底部来收集树突细胞。然后使粘着和非粘着的细胞在600G离心5分钟，在DPBS中洗涤并计数。

(4)将制备的树突细胞以100微升AIM V培养基总体积中2×10⁴/孔的密度置于96孔的圆底阵列中。

CD4+T细胞是用人CD4+Cellect Kit(Biotex)按照制造商的说明书从用于制备树突细胞的外周血细胞样品的冷冻的等分试样制备的，其程序作了以下修改：将等分试样解冻并洗涤，从而在每个Cellect柱上将应用约108个细胞；将细胞重悬于4ml DPBS和1ml来自Cellect Kit的细胞试剂中，使溶液于室温维持20分钟。将结果所得的溶液在室温于600G离心5分钟，并将沉淀重悬于2mlDPBS且应用于Cellect柱。柱的流出物收集于DPBS中的2％人血清中。将结果所得的CD4+细胞溶液离心，重悬于AIMV培养基中并进行密度计数。

将CD4+T-细胞悬浮液以2×10⁶/ml的量重悬于AIM V培养基中以促进96孔平板的有效操作。

肽抗原是通过在AIM V培养基中按1∶10的比例稀释而从DMSO中的1 M贮存液中制备的。将10微升的贮藏液置于含有分化的树突细胞的96孔平板的每一个孔中。将如上所述制备的100微升稀释的CD4+T-细胞溶液进一步添加到每一个孔中。有用的对照包括稀释的DMSO空白对照，及破伤风类毒素正对照。

每一个孔中的终浓度如下，总体积为210微升：

2×10⁴CD4+

2×10⁵树突细胞(10∶1的R∶S)

5mM肽

                          实施例3

通过全酶/人细胞体外增殖测定对蛋白酶变体中减少的变应原性的检

                            验

原理：

本测定设计为检验人外周血单核细胞(PBMC)对目标肽(P1，BPN’-Y217L)及其变体的体外增殖反应。将P1与酶变体通过用苯甲基磺酰氟(“PMSF”)处理以失活。人PBMC是用要检验的失活P1和所有变体的逐渐增加的剂量培养的。在这些实验中检验的变体为：

LAP 1：BPN’-Y217L；I79A

LAP 2：BPN’-Y217L；I79A；I122A

LAP 3：BPN’-Y217L；N76D；I122A

LAP 4：BPN’-Y217L；N76D；I79A；I122A

LAP 5：BPN’-Y217L；N76D

对P1的增殖显示整个分子已被加工并由PBMC群体中的抗原呈递细胞呈递给T细胞了。对变体不增殖显示了哪些氨基酸修饰成功地抑制了P1抗原决定部位的加工、呈递和/或T细胞识别。

方法：

从Stanford University Blood Center(Palo Alto，CA)获得人棕黄层样品。将PBMC通过密度分离而分离，在Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水(“DPBS”)中洗涤并计数。

P1及其变体是用PMSF失活的：将100％乙醇中的100mM PMSF以1∶50的稀释液加入到2mg/ml的酶溶液中。将混合物涡旋振荡并使其于室温静置5分钟。再次将PMSF以1∶50的稀释液加入，并使其静置另外5分钟。第3次加入PMSF，使其静置额外的5分钟，且残余的酶活性是在比色底物琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基酰苯胺测定中估计的(Delmar，EG等人(1979))。

将PBMC以2×10⁶细胞/ml的浓度重悬于5％的人AB-血清RPMI1640(pen/strep/谷氨酰胺)中。将细胞以2ml/孔置于24孔的平板上并加入酶。将每一个供体用P1进行检验，且检验尽量多的变体(细胞数目限制)。在大多数这些研究中所用的酶浓度为1、5、10和20μg/ml。最后9个实验是用扩大的剂量范围5、10、20和40μg/ml的酶来进行的。然而，为了一致性，此处汇编的数据是基于20μg/ml的最高剂量的。将培养物在5％的CO₂中于37℃温育5天。在第5天，用移液管使培养物重悬，并将100μl来自每一个孔的拷贝转移到96孔的平板上。将孔用含氚的胸苷(0.5μCi/孔)脉冲并于37℃中进行6个小时温育。然后收获平板，并确定整合的数量。

结果：

对30～40个个体检验了其对P1与基于P1的变体(如LAP1-LAP5)的反应。将LAP5酶稍后加入到规程中，且用该变体只检验了18个个体。所有个体的结果都汇编并提供于下面的表和图中。如果在较高的剂量有大于或等于2.0的刺激指数(S.I.)时则称结果是阳性的(“是”)。一个反应如果它显示少于2.0的S.I.但高于背景时称为弱的(图4)。

检验的供体的60％表现了对P1具有2.0的S.I.或更好的增殖反应。对所有6种酶的反应进行了汇编并提供于下面的表中：

表1

P1          LAP1       LAP2       LAP3      LAP4        LAP5

n＝40       n＝40      n＝37      n＝34     n＝33       n＝18

22％否      87％否     65％否     82％否    69％否      83％否

17％弱的    2％弱的    11％弱的   3％弱的   18％弱的    11％弱的

60％是      10％是     24％是     15％是    12％是      5％是

许多具有对变体的阳性反应的个体具有比对亲代P1分子低得多的反应。

结论：

所有检验的变体诱导了较低百分比的反应。所有的变体包括70-84区域的氨基酸变化，即N76D变化或I79A变化。少数供体对每一个变体有反应，提示在培养物中变体能由抗原呈递细胞加工和呈递。然而，对变体的反应通常比对亲代分子P1的低。仅在40个检验的个体中的一个个体(T78186)中，在不存在对亲代酶的反应时有对变体的反应。该供体对LAP1和LAP2有反应，但对LAP3、LAP4或LAP5无反应。

                      实施例4

    抗原决定部位中特定的改变的变应原性残基的确定

基于P1的70-84序列的肽变体是在Stickler等人用20个群体供体血液样品的作图测定中检验的。一组肽是由Mimostopes(SanDiego，CA)构建的。对于每一个肽变体，构建了3个氨基酸子序列(offset)(15聚体)以覆盖计划改变的整个区域。这样做是为了确保当将变体结合到低变应原性蛋白酶中时我们不在另一个3聚体“读框”中形成新的T细胞抗原决定部位。用质谱分析对该组中的亲代肽进行了分析并发现该亲代肽为约70％完整的15聚体。

肽序列如下：

肽 70-84 GTVAALNNSIGVLGV I79A GTVAALNNSAGVLGV N76D GTVAALDNSIGVLGV N76D/I79A GTVAALDNSAGVLGV V81A GTVAALNNSIGALGV N76D/V81A GTVAALDNSIGALGV I79T GTVAALNNSTGVLGV N76D/I79T GTVAALDNSTGVLGV

为了清楚，未显示跨过每一个区域的3聚体子序列。

将20个血液样品用于检验所有的肽变体。肽以5μM使用。在这个群组中，发现50％的供体对70-84区域有反应，图4b。所有的70-84变体诱导了显著低的反应。注意只有一个对I79A肽有反应，且没有其他的对N76D有反应，从而阐明了在特定的肽修饰之后变体免疫原性反应的减少。

                     实施例5

第二个抗原决定部位中特定的改变的变应原性残基的确定

对一组在P1的109-123区域进行丙氨酸替代的肽在标准的引发测定程序(priming assay procedure)进行了检验(Stickler，MM等人，J.Immunother.23(6)：654-660(2000))。109-123的序列为：NGIEWAIANNMDVIN。丙氨酸替代的肽描述于图6中。非反应者描述于图4c中。

检验了总共20个群体供体。2个个体达到了3或更大的刺激指数[“SI”](图5)，这与未实验过的反应者对该区域的低百分比一致。“1.0”的刺激值与背景水平相等。例如，刺激指数值2指反应是背景水平的2倍。为了对锚定残基有更坚定的估计，也汇编了所有对对照肽的SI反应为2或更好的个体的数据(图7)。从这些数据看，认为位置13上的变化对于减少免疫原性是最重要的，这是因为没有任何一个非反应者对该变化有反应(图7)，且所有具有对对照肽的SI为2或更好的反应者都对该改变的肽显示减少的增殖。将肽#13的氨基酸改变命名为I122A，且应为这个序列：NGIEWAIANNMDVAN。

此外，从该数据看，认为位置11上的变化对于增加免疫原性反应是最重要的，这是因为具有对对照肽的SI为2或更好的5个反应者中的3个对该改变的肽显示增加的增殖。将肽#11的氨基酸改变命名为D120A，且应为这个序列：NGIEWAIANNMAVIN。

                 实施例6

             体内变应原性的减少

       HLA-DR3/DQ2小鼠T细胞对P1有反应

方法：

将HLA-DR3/DQ2转基因小鼠培育在MHC类型II基因敲除(C2D)背景上以形成本研究中所用的小鼠(Cosgrove D等人，Cell 66：1051-66(1991))。在这些研究中使用了雄性和雌性小鼠两者。动物在一年到6-8个星期的年龄范围内。所有动物都是在AvironAnimal Facility(Mountain View，CA)即AALAC公认的设备中饲养并维持的。用流式细胞仪对动物进行了估计并用两种不同的抗-HLA-DQ抗体试剂发现其表达高水平的HLA-DR及低水平的HLA-DQ。雌性表达比雄性总体更高水平的HLA分子。动物是通过许多途径进行免疫接种的，包括用完全弗氏佐剂(CFA)的爪垫免疫接种、用CFA的腹膜内免疫接种和用沉淀在明矾上的P1的腹膜内免疫接种。一些动物是通过多途径进行免疫接种的。

结果：

为了核实HLA-DR3/DQ2小鼠加工并呈递来自完整的P1酶的70-84和/或109-123抗原决定部位，在P1免疫接种的小鼠中对脾细胞反应做了抗原决定部位的作图。雌性和雄性小鼠是用10μg在明矾中的P1在1日、3日和10日进行3次免疫接种的。在15日，将脾脏去除。将来自雌性小鼠的脾细胞在体外以每孔10⁶个细胞与50μg/ml的P1肽一起放置。收集了来自5个雄性小鼠的脾细胞，并如所述地建立了对雌性小鼠脾细胞的复制(duplicate)培养物。将该培养物用0.5μCi的含氚胸苷在第24小时进行脉冲，并在第48小时时收获。对复制培养物的计数进行了平均并减去了背景。每一个培养物的背景计数对于明矾中的雌性HLA-Dr3/DQ2 P1为2486+218cpm(图7a)，对于明矾中的雄性HLA-DR3/DQ2 P1为5314+529cpm(图7B)。雌性小鼠对培养基中PMSF失活的20μm/ml P1有反应，SI为2.2，雄性脾细胞的SI为1.7。对10μg/ml PHA的反应是强的，且雌性显示18的SI而雄性显示10的SI。

两组小鼠(上述的雄性和雌性)都显示对109-123肽的明显的反应。对70-84的反应在用这个途径免疫接种的雌性小鼠中是缺失的。然而，雄性小鼠展示了对该肽的反应。

                    实施例7

         低变应原性稳定蛋白酶变体的构建

在确定了T-细胞抗原决定部位的位置之后，用确立的蛋白质工程技术构建了蛋白酶变体。该变体是这样构建的，从而使蛋白质中高变应原性的氨基酸序列用来自低变应原性同系物中的相应序列进行替代。在这个例子中，对解淀粉芽孢杆菌突变的枯草杆菌蛋白酶(P1)中多个残基进行了替代。蛋白酶P1的制备公开于美国再次申请的专利RE 34,606、欧洲专利130,756和美国专利5,441,882中。变体P1基因和氯霉素标记基因侧翼与相应于apre E座位的5’序列的重复序列相接，以用于通过用氯霉素选择来扩增拷贝数。

构建了3个蛋白酶突变体。

LAP2

蛋白酶变体LAP2是通过在基于pBluescript的载体中用定点诱变将I79转变为丙氨酸和将I122转变为丙氨酸而引入到P1(BPN’-Y217L)中的。

在结果所得的LAP2质粒中，使aprE座位的5’序列在氯霉素基因之后重复以通过用增加的氯霉素浓度来扩增基因拷贝数。将LAP2质粒用标准的转化程序转化入芽孢杆菌属生产品系中。在含有5μg/ml氯霉素的LA平板上选择转化体。用增加的氯霉素水平使转化体生长并亚培养于LB培养基中以扩增染色体上LAP2的拷贝数。在LAP2品系对25μg/ml氯霉素进行扩增之后，将LAP2转化体置于含有1％的脱脂乳的LA+25μg/ml氯霉素中，并测定指示蛋白酶活性的晕圈的存在。LAP2扩增的品系在脱脂乳平板测定中产生了晕圈。

LAP3

蛋白酶变体LAP3是通过在基于pBluescript的载体中用定点诱变将N76用天冬氨酸残基替代和将I122用丙氨酸替代而引入到P1中以形成LAP3的。将LAP3转化入芽孢杆菌属生产品系中并如上所述进行扩增，然后平板培养于脱脂乳平板上。LAP3转化体在脱脂乳平板测定中产生了晕圈。

LAP4

蛋白酶变体LAP4是通过在基于pBluescript的载体中用定点诱变将N76用天冬氨酸残基替代、将I79用丙氨酸残基替代和将I122用丙氨酸替代而引入到P1中以形成LAP4的。将LAP4转化入芽孢杆菌属生产品系中并如上所述进行扩增，然后平板培养于脱脂乳平板上。LAP4转化体在脱脂乳平板测定中产生了晕圈。

                   实施例8

低变应原性蛋白酶稳定突变(N76D、I79A、I122A、N218S、Q206L、

                P40Q、D41A、H238Y)

通过定点诱变来增加稳定性的变体列在下面：

P1-N76D/I79A/I122A/N218S；

P1-N76D/I79A/I122A/Q206L；

P1-N76D/I79A/I122A/Q206L/N218S；

P1-I79A/I122A/Q206L；

P1-I79A/I122A/N218S；

P1-I79A/I122A/P40Q；

P1-I79A/I122A/D41A；和

P1-I79A/I122A/H238Y

每一个蛋白酶变体都是通过在基于pBluescript的载体中用定点诱变替代各自想要替代的残基(如N76用天冬氨酸残基、I79用丙氨酸残基、I122用丙氨酸残基、Q206用赖氨酸残基、N218用丝氨酸残基、P40用谷氨酰胺残基、D41用丙氨酸残基及H238用酪氨酸残基)而形成各自的稳定的LAP变体的。将每一个稳定的LAP转化入芽孢杆菌属生产品系中并如上所述进行扩增，然后平板培养于脱脂乳平板上。LAP转化体在脱脂乳平板测定中产生了晕圈。

                         实施例9

低变应原性蛋白酶的稳定突变(A216K、D181G、S101V、G215A、A216E、L217S、R247Y、R247S、R247Q、G48S、S101Q/S154G、G128S、S182T、S101R、Y104W/I107V、L250G、T254G、T254A、G258S、M50A、G47S、A48G、S182R、S183R、Q185A、S101R/I107V、S248G、Y262F)

通过定点诱变来增加稳定性的变体列在下面：

    P1-N76D/I79A/I122A/A216K；

    P1-N76D/I79A/I122A/D181G；

    P1-N76D/I79A/I122A/S101V；

    P1-N76D/I79A/I122A/G215A；

    P1-N76D/I79A/I122A/A216E；

    P1-N76D/I79A/I122A/L217S；

    P1-N76D/I79A/I122A/R247Y；

    P1-N76D/I79A/I122A/R247S；

    P1-N76D/I79A/I122A/R247Q；

    P1-N76D/I79A/I122A/G46S；

    P1-N76D/I79A/I122A/S101Q/S154G；

    P1-N76D/I79A/I122A/G128S；

    P1-N76D/I79A/I122A/S182T；

    P1-N76D/I79A/I122A/S101R；

    P1-N76D/I79A/I122A/Y104W/I107V；

    P1-N76D/I79A/I122A/L250G；

    P1-N76D/I79A/I122A/T254G；

    P1-N76D/I79A/I122A/T254A；

    P1-N76D/I79A/I122A/G258S；

    P1-N76D/I79A/I122A/M50A；

    P1-N76D/I79A/I122A/G47S；

    P1-N76D/I79A/I122A/A48G；

    P1-N76D/I79A/I122A/S182R；

    P1-N76D/I79A/I122A/S183R；

    P1-N76D/I79A/I122A/Q185A；

    P1-N76D/I79A/I122A/S101R/I107V；

    P1-N76D/I79A/I122A/S248G；和

    P1-N76D/I79A/I122A/Y262F；

每一个蛋白酶变体都是通过在基于pBluescript的载体中用定点诱变替代各自想要替代的残基(如N76用天冬氨酸残基、I79用丙氨酸残基、I122用丙氨酸残基、A216用赖氨酸残基、D181用甘氨酸残基、S101用缬氨酸残基、G215用丙氨酸残基等)而形成各自的稳定的LAP变体的。将每一个稳定的LAP变体转化入芽孢杆菌属生产品系中并如上所述进行扩增，然后平板培养于脱脂乳平板上。LAP转化体在脱脂乳平板测定中产生了晕圈。

                       实施例10

由突变的变体枯草杆菌蛋白酶对二甲基酪蛋白(“DMC”)的水解

对用此处所描述的方法分离和纯化的突变的变体枯草杆菌蛋白酶(P1、LAP2、LAP3和LAP4)分析了其水解商业合成底物二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)的能力。在适当的缓冲液中制备5mg/ml DMC底物溶液(5mg/ml DMC，0.005％(w/w)Tween 80(聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯，Sigma P-1754))。适当的DMC底物缓冲液为如下的：50mM pH 5.5的乙酸钠；50mM pH 6.5的N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(“TES”)；50mM pH 7.5的哌嗪-N-N’-双-2-乙烷磺酸(“PIPES”)和50mM pH 8.5的Tris。将200μl想要的pH底物转移到96孔的微量滴定板上并在加入酶之前于37℃预温育20分钟。2，4，6-三硝基苯磺酸盐(“TNBS”)颜色反应方法是在Spectra Max 250分光光度计上确定的。该测定测量了DMC向含有自由氨基基团的肽的酶促水解。这些氨基基团与2，4，6-三硝基苯磺酸反应形成黄色的复合物，如在下面的反应中描述的：

因而反应的颜色越深，则测量到越高的活性。TNBS探测测定是在于37℃温育2个小时后在上清液中进行的。在一种试剂中制备了1mg/ml的TNBS溶液(2.4g NaOH、通过加热溶解于1000ml的45.4g(Na₂B₄)₇·10H₂O)。将60μl等分试样置于96孔的微量滴定板上。将10μl上述的温育的酶溶液加入到每一个孔中并于室温混合20分钟。使20μl NaH₂PO₄溶液(2000ml中70.4g NaH₂PO₄·H₂O和1.2g Na₂SO₃)在孔中混合1分钟以使反应停止，确定了在SpectraMax 250分光光度计上405nm处的吸收。也制备了空白对照(相同的TNBS溶液不含酶)。水解是在不同的酶浓度下(0、2.5、5、7.5和10ppm)用下面的公式进行测量的：

吸收₄₀₅(酶溶液)-吸收₄₀₅(无酶的)

图8a-10中的数据显示突变的变体水解这种底物的相对能力(与来自已知的突变变体(P1)的蛋白酶相比的)。

如可在图中看到的，所有3个酶在不同的pH和不同的酶浓度都显示对DMC底物的显著的水解。

                    实施例11

     胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白由蛋白酶的水解

对用上述方法分离和纯化的突变的变体枯草杆菌蛋白酶(P1、LAP2、LAP3和LAP4)分析了其水解商业底物牛胶原蛋白(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICNBiomedical 902111)的能力。制备了5mg/ml底物溶液(0.005％Tween 80)。每一种底物都是在如所述的适当的pH(如pH 5.5、6.5、7.5和8.5)下制备的。将1.5ml的每一种底物于37℃转移到24孔的Costar平板上。将该平板在加入酶之前于37℃预温育20分钟。上述TNBS探测测定是在于37℃温育2个小时后在上清液中进行的。

图11-13中的数据显示突变的变体水解这种底物的相对能力(与来自已知的突变变体(P1)的蛋白酶相比)。活性是相对接近的。变体LAP3水解胶原蛋白比已知的P1变体和前述的杂交蛋白酶好。

如可在图中看到的，所有3个酶在不同的pH和不同的酶浓度都显示对胶原蛋白、弹性蛋白和角蛋白底物的显著的水解。

                        实施例12

在哌嗪-N-N’-双-2-乙烷磺酸(“PIPES”)缓冲液中蛋白酶变体的热

                     稳定性

参数：在类型Stratagene Robocycler的PCR热循环仪上确定，5.0ppm的酶(使用P1、LAP2、LAP3、LAP4之一)，在每一温度(在上述PCR热循环仪42-56℃范围内两度的时间间隔)于pH 6.5时从5个时间点(5、10、20、40和60分钟)取样，在42-56内每隔一度对稳定性进行测量。

制备了50mM PIPES缓冲液(50mM PIPES，0.005％Tween80)。将pH调节到6.5。

样品是用标准的琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基酰苯胺(“SAAPFpNA”)测定进行测定的(Delmar，E.G.等人，Anal.Biochem.94(1979)316-320；Achtstetter，Arch.Biochem.Biophys 207：445-54(1981))(pH 6.5，25℃)。将样品稀释到约300毫OD/分钟。热稳定性表达为酶半衰期(分钟)，该半衰期如下进行确定：

H.L.＝ln2/斜率，其中斜率是在每一个温度时曲线上速率对时间的斜率。

如可在图14中看到的，突变的变体LAP4具有最好的稳定性，该稳定性在超过52℃时好于对照P1的。

                     实施例13

在N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸(“TES”)中蛋白酶变体

                     的热稳定性

参数：5.0ppm的酶(P1、LAP2、LAP3、LAP4)，在每一温度(在使用上述PCR热循环仪温度梯度的42-56℃范围内两度的时间间隔)于pH 6.5时从5个时间点(5、10、20、40和60分钟)获取，在42-56内每隔一度对稳定性进行测量。

通过混合50mM TES(Sigma T 1375)和0.005％Tween 80制备了TES缓冲液。将pH调节到6.5。

变体的热稳定性是作为用琥珀酰-ala-ala-pro-phe-对硝基酰苯胺(“SAAPFpNA”)(Sigma no.S-7388，Mol.Wt.624.6g/摩尔)测定的残余变体的活性进行确定的(E.G.Delmar等人，Anal.Biochem.94(1979)316-320；Achtstetter，Arch.Biochem.Biophys 207：445-454(1981))(pH 6.5，25℃)。形成的(黄色)对硝基酰苯胺(pNA)是用SpectraMax 250分光光度计在410nm进行分光广度法测量的：ε_M＝8,480 M_-1·cm_-1()，其中将样品稀释到约300mOD/分钟。热稳定性表达为上述的酶半衰期(分钟)。

如可在图15中看到的，突变的变体LAP4具有最好的稳定性，该稳定性在超过50℃时好于对照P1的。

                  实施例14

二甲基酪蛋白(“DMC”)和角蛋白由突变的变体枯草杆菌蛋白酶的

                    水解

用在实施例10和11中提供的方法，将在实施例9中所述制备的变体的酶活性与LAP2酶活性用所述的DMC和角蛋白底物进行了比较。结果概述于表2中。

表2

突变与LAP2相比的酶活性DMC角蛋白LAP2-A216K＞LAP2-D181G＞＞LAP2-S101V＞＞LAP2-G215A＞＞LAP2-A216E＞＞LAP2-L217LS＞＞LAP2-R247Y＞＞LAP2-R247S＞＞LAP2-R247Q＞＞LAP2-G46S＞＞LAP2-S101G-S154G＞＞LAP2-G128S＞＞LAP2-S182T＞＞LAP2-S101R＞＞LAP2-Y104W-I107V＞＞LAP2-L250G＞＞LAP2-T254G＞＞LAP2-T254A＞＞LAP2-G258S＞＞LAP2-M50A＞＞LAP2-G47S＞＞LAP2-A48G＞＞LAP2-S182R＞LAP2-S183R＞＞LAP2-Q185A＞LAP2-S101R-I107V＞LAP2-S248G＞＞LAP2-Y262F＞＞

                   实施例15

          沐浴露溶液中蛋白酶变体的稳定性

使用克隆的酶(如在实施例1中描述的)，多种蛋白酶的稳定性是用下面的规程测量的。结果概述于下面的表中。

测量沐浴露溶液稳定性的方法

参数：(P1、LAP2、LAP3、LAP4)，在一个研究中为于45℃中30分钟，而在另一个研究中为于50℃中30分钟。

通过将以商标ZEST(Procter & Gamble，Cincinnati，Ohio)销售的沐浴露与去离子水混合而制备50/50(w/w)的沐浴露溶液。缓冲液混合物的pH约为6.8。

将要检验的酶进行稀释，从而当用SAAPFpNA测定终点方法(Dalmer等人，1979)对酶/沐浴露溶液进行测定时，在50 w/w％的沐浴露：去离子水溶液中的最终酶浓度可产生OD₄₀₅ 0.5到0.1的改变。一旦确定了稀释的量，则将200μl稀释的混合物置于96孔的微量滴定板孔中。将平板密封并在一个研究中置于40℃的水浴中，且在另一个研究中置于50℃中。在45分钟之后将平板从水浴中去除，且用终点方法对10μl样品进行测定。剩余活性百分数是通过将终活性除以起始活性再乘以100而计算的。

表3

40℃和50℃时的残余活性百分数

变体                                     40°           50°

Y217L^*                                  84      11

Y217L，N76D，I122A                       -       71

Y217L，N79A，I122A                       56      11

Y217L，N76D，N79A，I122A                 75      29

Y217L，N76D，N79A，I122A，N218S          94      64

Y217L，N76D，N79A，I122A，Q206L          90      58

Y217L，N76D，N79A，I122A，Q206L，N218S   105     84

Y217L，N79D，I122A4，Q206L               76

Y217L，N79D，I122A4，N218S               85

Y217L，N79D，I122A4，P40Q                72

Y217L，N79D，I122A4，D41A                77

Y217L，N79D，I122A4，H238Y               73

*BPN’＝解淀粉芽孢杆菌(Y217→L)

如可从表3所看到的，包括N76D的变体具有增加的酶活性剩余量并因而比P1具有更宽的热稳定性。例如，在50℃，N76D化合物具有71％、29％、64％、58％和84％的活性剩余，而不具有稳定的残基变体的P1只具有11％的剩余活性。此外，Q206L、N218S、P40Q、D41A和H238Y具有76％、85％、72％、77％和73％的活性剩余，但是没有额外的稳定残基的LAP2具有56％的活性剩余。在50℃时沐浴露存在时，所有的酶均具有增加的稳定性，但P1-N76D、N79A、I122A、Q206L、N218S具有最好的稳定性。

描述了本发明的优选实施方案之后，本领域的技术人员可看到对公开的实施方案可进行多种修改，且这种修改是在本发明的范围内的。