酵母细胞表达人白细胞介素10的方法

摘要

本发明是酵母细胞表达人白细胞介素10的方法，技术方案是：人工合成hIL－10全基因序列，包括hIL－10的带有其信号序列和不带信号序列，分别记为shIL－10和nshIL－10，给其两端加上EcorR I和Not I酶切序列或两端都加上EcorR I酶切序列，用EcoR I和Not I分别双酶切目的基因shIL－10、nshIL－10以及毕赤酵母的整合型表达载体pPIC3.5K、pPIC9K，构建重组质粒pPIC3.5K/shIL、pPIC9K/nshIL，然后通过电穿孔、原生质体法转化毕赤酵母细胞，重组质粒和目的基因整合到酵母染色体上，应用甲醇诱导毕赤酵母进行胞内可溶性表达或胞外分泌型表达。本发明与现有在大肠杆菌中表达相比，提高人白细胞介素10的空间结构的正确折叠及其生物学活性，具有明显的优势：①酵母细胞表达hIL－10，不形成变性蛋白的包涵体，蛋白为可溶形式表达，直接形成活性蛋白；②可溶性活性蛋白有利于纯化，纯化得率高，避免包涵体复性时的损失。

说明书

技术领域

本发明涉及到人白细胞介素10的制造方法，更具体地说是关于应用酵母细胞表达人白细胞介素10，属于生物技术高科技研究领域。

背景技术

1989年Fiorentino等发现鼠CD4+Th2细胞分泌一种可抑制Th1细胞产生细胞因子(如IFN)的物质，称其为细胞因子分泌抑制因子(CSIF)，后统一称为白细胞介素10(IL-10)。

IL-10是正常人体的一类重要细胞因子，成熟的IL-10有160个氨基酸残基，单体分子量为18.7KD，含有4个半胱氨酸形成的二硫键(12-108，62-114)。活性形式是由非共价键连接的分子量为39KD的同源寡二聚体。

人IL-10由多种细胞分泌，主要由Th2细胞产生，并对多种细胞和因子发挥免疫抑制和调节作用。IL-10可抑制T细胞、单核细胞、巨嗜细胞的活性和功能，调节B细胞、Tc、Th、肥大细胞、粒细胞、DC、角化细胞和上皮细胞的生长、分化。IL-10抑制致炎细胞因子(IL-1、IFN、TNF)、趋化因子(CC、CXC)、PGE2、NO、MHC II以及共刺激分子(IL-12、CD80/CD86)的合成、抗原提呈，下调TLR4的表达、LPS受体的信号转导，增强CD14、CD16、CD64、CD163以及被LPS、IFN-γ和TNF下调的清除因子受体的表达，从而限制免疫反应和炎症反应，最终结束炎症反应。

当机体处于病理状态时，IL-10可以抑制致炎因子及其产生细胞的活性，保护机体免于过度的免疫病理损伤。动物实验和人体临床试验证明了IL-10的抑制作用和抗炎反应在机体的免疫系统中发挥着根本的作用，提示其在器官移植和治疗炎症及自身免疫疾病方面如炎性结肠炎、克隆病(Crohns disease)、类风性关节炎、多发性硬化症、银屑病、慢性丙型肝炎具有很大的应用潜力。IL-10在临床治疗方面表现出良好的安全性和生物学活性，具有极为重要的临床应用价值，为开发rhIL-10基因工程药物奠定了坚实的理论基础、提供了可靠的临床依据。

随着对IL-10在作用机理以及治疗临床疾病方面深入而广泛的研究，一方面肯定了IL-10的生物学功能，另一方面扩展了其临床应用范围；同时也表现出对IL-10的大量需求，所以，通过基因工程手段大规模生产高纯度天然活性的重组hIL-10成为必然。

IL-10单体含有4个半胱氨酸形成的二硫键，1个N-糖基化位点，但无糖链，活性形式是由非共价键连接的同源寡二聚体。这种结构特征决定了以分泌形式来表达rhIL-10才不会影响其天然活性的发挥。大肠杆菌是常用的基因工程菌株，在大肠杆菌中以包涵体形式表达hIL-10，是无活性的变性蛋白，经过纯化和复性，仍有部分蛋白不能形成准确的二硫键和适当的空间折叠，影响了hIL-10的生物活性，而且工艺复杂，回收率低，增加了生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一种以分泌形式来表达rhIL-10的方法，具体是应用酵母细胞进行胞内可溶性表达或胞外分泌性表达，这种表达提高可以有效地人白细胞介素10的空间结构的正确折叠及其生物学活性。

本发明的方法的酵母选用His^-的毕赤酵母GS115株和KM71株，整合性表达质粒是pPIC3.5K、pPIC9K和pAO815。具体方法包括以下步骤：

1、按照毕赤酵母偏爱的密码子人工合成hil-10全基因，核酸序列如下：

        10         20         30         40         50         60

ATGCATTCTT CTGCTTTGTT GTGTTGTTTG GTTTTGTTGA CTGGTGTTAG AGCTTCTCCA

TACGTAAGAA GACGAAACAA CACAACAAAC CAAAACAACT GACCACAATC TCGAAGAGGT

        70         80         90        100        110        120

GGTCAAGGTA CTCAATCTGA AAATTCTTGT ACTCATTTTC CAGGTAATTT GCCAAATATG

CCAGTTCCAT GAGTTAGACT TTTAAGAACA TGAGTAAAAG GTCCATTAAA CGGTTTATAC

       130        140        150        160        170        180

TTGAGAGATT TGAGAGATGC TTTTTCTAGA GTTAAGACTT TTTTTCAAAT GAAGGATCAA

AACTCTCTAA ACTCTCTACG AAAAAGATCT CAATTCTGAA AAAAAGTTTA CTTCCTAGTT

       190        200        210        220        230        240

TTGGATAATT TGTTGTTGAA GGAATCTTTG TTGGAAGATT TTAAGGGTTA CTTGGGTTGT

AACCTATTAA ACAACAACTT CCTTAGAAAC AACCTTCTAA AATTCCCAAT GAACCCAACA

       250        260        270        280        290        300

CAAGCTTTGT CTGAAATGAT TCAATTTTAC TTGGAAGAAG TTATGCCACA AGCTGAAAAT

GTTCGAAACA GACTTTACTA AGTTAAAATG AACCTTCTTC AATACGGTGT TCGACTTTTA

       310        320        330        340        350        360

CAAGATCCAG ATATTAAGGC TCATGTTAAT TCTTTGGGTG AAAATTTGAA GACTTTGAGA

GTTCTAGGTC TATAATTCCG AGTACAATTA AGAAACCCAC TTTTAAACTT CTGAAACTCT

       370        380        390        400        410        420

TTGAGATTGA GAAGATGTCA TAGATTTTTG CCATGTGAAA ATAAGTCTAA GGCTGTTGAA

AACTCTAACT CTTCTACAGT ATCTAAAAAC GGTACACTTT TATTCAGATT CCGACAACTT

       430        440        450        460        470        480

CAAGTTAAGA ATGCTTTTAA TAAGTTGCAA GAAAAGGGTA TTTACAAGGC TATGTCTGAA

GTTCAATTCT TACGAAAATT ATTCAACGTT CTTTTCCCAT AAATGTTCCG ATACAGACTT

       490        500        510        520        530        540

TTTGATATTT TTATTAATTA CATTGAGGCT TACATGACTA TGAAGATTAG AAATTAA...

AAACTATAAA AATAATTAAT GTAACTCCGA ATGTACTGAT ACTTCTAATC TTTAATT...

2、体外构建重组表达载体转化毕赤酵母中，进行胞外的分泌性表达和胞内的可溶性表达：

2.1)体外构建重组分泌性表达载体：

2.1.1)将人工合成的不带原始信号序列的hIL-10和带有原始信号序列的hIL-10分别重组到整合型表达载体pPIC9K和pPIC3.5K的多克隆位点；

2.1.2)将人工合成的不带原始信号序列的hIL-10和α-因子的融合基因以及带有原始信号序列的hIL-10重组到载体pAO815的EcoR I位点，利用Bgl II和BamH I内切酶在pAO815上体外构建多拷贝表达盒；

2.2)体外构建重组胞内可溶性表达载体：

2.2.1)将人工合成的不带原始信号序列的hIL-10 5’端加上起始密码子ATG，重组到载体pPIC3.5K的多克隆位点；

2.2.2)将人工合成的不带原始信号序列的hIL-10 5’端加上起始密码子ATG，重组到载体pAO815的EcoR I位点，利用Bgl II和BamH I内切酶在pAO815上体外构建多拷贝表达盒；

3、毕赤酵母转化：将重组质粒用限制性内切酶Sal I或Sac I酶切成线性质粒，通过电穿孔或原生质体法转化毕赤酵母；

4、毕赤酵母表达hIL-10：在毕赤酵母培养基中加入甲醇进行诱导表达。

真核细胞酵母中分泌表达人活性蛋白IL-10具有良好的优势：它不仅能够防止宿主菌对表达产物的降解、减轻宿主细胞代谢的负荷以及表达产物对宿主的毒性作用，而且能促进分泌蛋白按适当的方式折叠、恢复其天然构象和活性。尤其hIL-10的活性形式是以非共价键连接的同源寡二聚体，分泌表达hIL-10才有可能保持其生物学活性。利用酵母细胞进行分泌表达rhIL-10，目的蛋白将会大量分泌到培养液中，能够形成准确的二硫键和正确的空间结构，保持了hIL-10天然活性；由于不受宿主菌体细胞内蛋白的影响，减少了纯化工艺，提高了回收率；同时酵母细胞结构简单、生长快速、易于培养和发酵、生产成本低、目的蛋白产量高。

附图说明

图1是构建带有原始信号序列的分泌性表达载体p3K/shIL

图2是构建带有α因子信号序列的分泌性表达载体p9K/nshIL

图3是构建单拷贝非分泌性表达载体pAO/nshIL

图4是构建单拷贝带有原始信号序列的分泌性表达载体pAO/shIL

图5是构建单拷贝带有α因子信号序列的分泌性表达载体pAO/ahIL

图6是构建多拷贝表达载体

具体实施方式

1.人工合成hIL-10全基因，核苷酸序列如下：

        10         20         30         40         50         60

ATGCATTCTT CTGCTTTGTT GTGTTGTTTG GTTTTGTTGA CTGGTGTTAG AGCTTCTCCA

TACGTAAGAA GACGAAACAA CACAACAAAC CAAAACAACT GACCACAATC TCGAAGAGGT

        70         80         90        100        110        120

GGTCAAGGTA CTCAATCTGA AAATTCTTGT ACTCATTTTC CAGGTAATTT GCCAAATATG

CCAGTTCCAT GAGTTAGACT TTTAAGAACA TGAGTAAAAG GTCCATTAAA CGGTTTATAC

       130        140        150        160        170        180

TTGAGAGATT TGAGAGATGC TTTTTCTAGA GTTAAGACTT TTTTTCAAAT GAAGGATCAA

AACTCTCTAA ACTCTCTACG AAAAAGATCT CAATTCTGAA AAAAAGTTTA CTTCCTAGTT

       190        200        210        220        230        240

TTGGATAATT TGTTGTTGAA GGAATCTTTG TTGGAAGATT TTAAGGGTTA CTTGGGTTGT

AACCTATTAA ACAACAACTT CCTTAGAAAC AACCTTCTAA AATTCCCAAT GAACCCAACA

       250        260        270        280        290        300

CAAGCTTTGT CTGAAATGAT TCAATTTTAC TTGGAAGAAG TTATGCCACA AGCTGAAAAT

GTTCGAAACA GACTTTACTA AGTTAAAATG AACCTTCTTC AATACGGTGT TCGACTTTTA

       310        320        330        340        350        360

CAAGATCCAG ATATTAAGGC TCATGTTAAT TCTTTGGGTG AAAATTTGAA GACTTTGAGA

GTTCTAGGTC TATAATTCCG AGTACAATTA AGAAACCCAC TTTTAAACTT CTGAAACTCT

       370        380        390        400        410        420

TTGAGATTGA GAAGATGTCA TAGATTTTTG CCATGTGAAA ATAAGTCTAA GGCTGTTGAA

AACTCTAACT CTTCTACAGT ATCTAAAAAC GGTACACTTT TATTCAGATT CCGACAACTT

       430        440        450        460        470        480

CAAGTTAAGA ATGCTTTTAA TAAGTTGCAA GAAAAGGGTA TTTACAAGGC TATGTCTGAA

GTTCAATTCT TACGAAAATT ATTCAACGTT CTTTTCCCAT AAATGTTCCG ATACAGACTT

       490        500        510        520        530        540

TTTGATATTT TTATTAATTA CATTGAGGCT TACATGACTA TGAAGATTAG AAATTAA...

AAACTATAAA AATAATTAAT GTAACTCCGA ATGTACTGAT ACTTCTAATC TTTAATT...

2.构建毕赤酵母整合型表达载体方式如下：

2.1)本发明所使用的毕赤酵母菌株GS115(HIS^-)及其表达载体pPIC3.5K、pPIC9K、pAO815均来自于Invitrogen公司。

2.2)构建表达重组质粒的方法如下：

2.2.1)使用引物PCR扩增人工合成的hIL-10基因，上游引物5’端含有EcoR I酶切序列，下游引物3’端含有Not I酶切序列。

PCR反应按下列试剂调配：

             模板                        1μl

             上游引物                    0.5μl

             下游引物                    0.5μl

             10×reaction buffer         5μl

             MgCl₂                      3μl

             dNTP                        3μl

             DNA聚合酶Taq                2U

             无菌水                      up to 50μl

置于DNA扩增仪上按94℃，4min；94℃，30sec，55℃，20sec，72℃，20sec，循环35次；72℃，10min。取5μl扩增产物在1％琼脂糖电泳，90V，15min。在紫外灯下观察并拍照。

2.2.2)上述PCR扩增的DNA片段大小与预期的大小符合时，使用OMEGA GEL EXTRACT KIT回收片段，具体操作按试剂盒说明书进行。

2.2.3)酶切PCR产物及质粒：反应液组成如下，

                         PCR产物       质粒(pPIC3.5K或pPIC9K)

底物                50μl              50μl

10×H buffer        10μl              10μl

BSA                 10μl              10μl

Not I               10U                10U

EcoR I              10U                10U

无菌水              up to 100μl       up to 100μl

37℃，3小时后，按照2.2.2)方法进行片段回收。

2.2.4)连接反应：

                    酶切PCR产物            10μl

                    酶切质粒               5μl

                    10×ligase buffer      2μl

                    T4 ligase              1μl

                    无菌水                 up to 20μl

      16℃，过夜。

2.2.5)转化感受态细菌DH5α：大肠杆菌感受态制备按常规方法进行。取上述连接产物10μl与感受态细菌100μl小心混合，4℃，30min，42℃，2min，然后加入500μl LB培养液，37℃，30min，6000rpm，室温离心1min，其上清550μl，剩余溶液悬浮细菌沉淀，全部菌液涂Amp-LB平板，37℃培养14小时。

2.2.6)酶切鉴定：随机挑取4个单菌落接种到5ml Amp-LB培养液中，37℃振荡培养12小时，使用OMEGA MINIPREP PLASIMAD KIT抽提质粒，按试剂盒说明书操作。酶切体系组成如下：

    重组质粒           10μl

    10×H buffer       2μl

    BSA                10μl

    Not I              10U

    无菌水             up to 20μl

2.3)带有原信号序列的shIL-10与整合型表达载体pPIC3.5K的重组(如图1示)

引物扩增shIL-10基因(全长537bp)，并在5端和3端分别加上EcoR I和Not I的酶切序列，用EcoR I和Not I分别双酶切shIL-10和表达载体pPIC3.5K，将shIL-10插入到pPlC3.5K上，获得p3K/shIL重组质粒。

2.4)无信号序列的nshIL-10与pPIC9K重组质粒的构建(如图2示)

引物扩增nshIL-10基因(全长480bp)，并在5端和3端分别加上EcoR I和Not I的酶切序列，用EcoR 1和Not I分别双酶切nshIL-10和表达载体pPIC9K，将nshIL-10处插入到pPIC9K上，获得p9K/nshIL重组质粒。

2.5)体外构建多拷贝hIL-10表达盒

2.5.1)构建方法：带有EcoR I酶切序列的引物分别PCR扩增基因nshIL-10、shIL-10、αhIL-10，回收PCR产物并用EcoR I酶切。同时用EcoR I酶切pA0815质粒，37℃，2小时；加入等体积的酚/氯仿，振荡，13200rpm离心5min；取上清再加入等体积的氯仿，振荡，13200rpm离心5min；取上清，加入1/10 3M NaAc，2倍体积的无水乙醇，-30℃ 30min；4℃，13200rpm离心10min，其上清，沉淀用70％冷乙醇漂洗两次，室温干燥；加入pH8.0的无菌水悬浮沉淀。

EcoR I酶切pAO815质粒的去磷酸化：

              pAO815/EcoR I           20μl

              10×CIAP buffer         5μl

              CIAP                    3μl

              无菌水                  up to 50μl

37℃，30min。用酚/氯仿抽提后，与EcoR I酶切的nshIL-10、shIL-10、αhIL-10连接，转化感受态大肠杆菌，涂平板培养，挑单菌落接种Amp-LB液振荡培养，抽提质粒，EcoR I酶切鉴定目的基因是否重组到pAO815质粒上(方法同上)；然后再用HindIII和BamH I鉴定重组质粒的目的基因正反方向：

              重组质粒(pAO/nshIL、   10μl

              pAO/shIL、pAO/ahIL)

              10×K buffer            2μl

              BamH I                  5U

              HindIII                 5U

              无菌水                  up to 20μl

37℃，3小时，取10μl进行1％琼脂糖电泳，在紫外灯下观察并拍照。如果除了有约7.7kb之外，还有640bp的片段，说明目的片段在pAO815载体上是正向，若没有640bp条带，是其他条带则为反向。

2.5.2)无信号序列的nshIL-10 5’端加上起始密码子ATG，再在5’端和3’端加上EcoRI的酶切序列；EcoR I酶切后将其连接到经过EcoR I酶切和碱性磷酸酶去磷酸化的质粒pAO815上，筛选正向重组质粒pAO/nhIL(如图3示)。

2.5.3)带有原始信号序列的shIL-10在5’端和3’端加上EcoR I的酶切序列；EcoR I酶切后将其连接到经过EcoR I酶切和碱性磷酸酶去磷酸化的质粒pAO815上，筛选正向重组质粒pAO/shIL(如图4示)。

2.5.4)将酵母的分泌信号序列α-factor连接在hIL-10的5’端，形成融合基因αhIL-10，再在该融合基因的5’端和3’端加上EcoR I的酶切序列；EcoR I酶切后将其连接到经过EcoRI酶切和碱性磷酸酶去磷酸化的质粒pAO815上，筛选正向重组质粒pAO/ahIL(如图5示)。

2.5.5)上述方法构建的重组质粒pAO/nshIL、phO/shIL、pAO/ahIL分别用Bgl I和BamH I双切，回收约2200bp的片段，即为单拷贝表达盒，纯化液加入T4连接酶及其缓冲液，共20μl，16℃进行过夜连接反应；然后加入Bgl II 2U、BamH I 2U、10×K buffer 10μl、无菌水至100μl，37℃ 2小时，目的在于酶切消除头-头、尾-尾连接的表达盒；酶切产物经酚/氯仿抽提和乙醇沉淀(方法同上)后与其对应的并经BamH I酶切及去磷酸化处理的重组质粒(含对应的单拷贝表达盒)连接，转化E.coli DH5α，挑单菌落，抽提质粒，再用Bgl II和BamH I进行酶切鉴定和筛选，电泳观察除了有4028bp和2393bp之外，还有2039bp(pAO/ahIL)或1829bp(pAO/shIL)或1769bp(pAO/hIL)，4076(2×2039)bp(pAO/ahIL)或3658(2×1829)bp(pAO/shIL)或3538(2×1769)bp(pAO/hIL)，6117(3×2039)bp(pAO/ahIL)或5487(3×1829)bp(pAO/shIL)或5307(3×1769)bp(pAO/hIL)……，则表示是1、2、3……等多拷贝表达盒的条带及质粒条带，挑选含最多拷贝数的重组质粒进一步转化毕赤酵母(如图6示)。

3.重组载体转化毕赤酵母及体内筛选多拷贝表达盒的酵母转化子：

3.1)由上述方式构建的重组质粒经Sal I酶切线性化后，应用电穿孔法或原生质体法将重组质粒整合到毕赤酵母染色体上。

3.1.1)电穿孔法：

接种His^-毕赤酵母GS115单菌落于500ml YPD培养液中，过夜培养，至OD₆₀₀约为1.3-1.5。4℃，3000rpm，离心5min，收集细胞，250ml冰冻的无菌水悬浮沉淀；按此法用冰冻无菌水再洗一次，冰冻1M山梨醇洗两次后，将酵母细胞悬浮于1ml山梨醇中。取5-20μg经Sal I酶切线性化的DNA，与80μl电转感受态细胞混合于冰冻的0.2cm电转杯中，冰上孵育5分钟。

应用电转仪BIO-PAD Gene Pulse Xcell^TM Electroporation System，以电压2000V、电容25μF、电阻200Ω进行电穿孔，然后加入1ml冰冻的1M山梨醇，取200-600μl溶液涂MD平板。30℃培养，挑选单菌落。

3.1.2)原生质体法：

His^-毕赤酵母GS115经培养至OD₆₀₀为0.2-0.3，3000rpm，室温离心5min，收集细胞，依次用20ml无菌水、20mlSED、20ml 1M山梨醇、20mlSCE洗涤，最后重悬于1mlSCE液中。加入1μl 1mg/ml的Lyticase(Sigma产品)，30℃消化细胞壁约15min，2500rpm离心5min，获得原生质体，再用20ml 1M山梨醇、20ml CaS各洗1次，最后悬浮于0.6ml的CaS中。取原生质体100μl，加入10μg经Sal I酶切线性化的重组质粒室温孵育10min，再加入1mlPEG/CaT室温孵育10min，经2000rpm室温离心10min，沉淀用150μlSOS液悬浮，室温放置20min后与850μl 1M山梨醇缓慢混合，取100μl与2ml RD软琼脂上层培养基混合后涂布RD平板，30℃培养6天。挑选单菌落。

3.2)G418筛选多拷贝表达盒的酵母转化子：

从RD平板或MD平板上挑选50个重组子接种在MD平板上，然接种在含200μl YPD培养液的96孔板传代三次，使每个重组子的浓度基本一致，各取10μl接种在含不同浓度G418(0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mg/ml)YPD平板上，30℃培养。挑选抗高浓度的重组子(即含有多拷贝表达盒的转化子)做诱导表达。

4.毕赤酵母转化子诱导表达hIL-10蛋白：

将含多拷贝表达盒的转化子单菌落接种到20ml BMGY中，30℃振荡培养48小时，收集菌体并悬浮于10ml BMMY中，30℃振荡培养，每隔12小时取样1ml并每24小时补加0.5％的甲醇。分离5天取样上清，按常规方法进行SDS-PAGE和Western Blotting进行鉴定和检测，筛选表达量高的重组子进行大量诱导培养。

附溶液配方：

1.LB培养基(pH至7.0)：

    胰蛋白胨                         10g

    酵母提取物                       5g

    NaCl                             10g

    LB固体培养基再加入2％的琼脂

2.YPD培养基：

     蛋白胨                          2％

     酵母提取物                      1％

     葡萄糖                          2％

     YPD固体培养基再加入2％的琼脂。

3.MD固体培养基：

    酵母含氮碱基                     1.34％

    生物素                           4×10^-5％

    葡萄糖                           2％

    琼脂                             2％

4.RD固体培养基：

    酵母含氮碱基                     1.34％

    生物素                           4×10^-5％

    葡萄糖                           2％

    山梨醇                           1M

    无组氨酸的混合氨基酸             0.005％

    上层软琼脂                       0.8％

      下层琼脂                      2％

5.SCE：

    山梨醇                          1M

    EDTA                            1mM

    柠檬酸缓冲液(pH5.8)             10mM

6.SED

     1ml DTT+19ml SE(1M山梨醇，25mM EDTA(pH8.0)

7.CaS

    山梨醇                          1M

    Tris-HCl(pH7.5)                 10mM

    CaCl₂                          10mM

8.SOS

    山梨醇                          1M

    YPD                             0.3倍

    CaCl₂                          10mM

9.CaT

    Tris pH7.5                      20mM

    CaCl₂                          20mM

10.BMGY

    蛋白胨                          2％

    酵母提取物                      1％

    酵母含氮碱基                    1.34％

    生物素                          4×10^-5％

    葡萄糖                          2％

    磷酸钾缓冲液pH6.0               100mM

    甘油                            1％

11.BMMY

    蛋白胨                          2％

    酵母提取物                      1％

    酵母含氮碱基                    1.34％

    生物素                          4×10^-5％

    葡萄糖                          2％

    磷酸钾缓冲液pH6.0               100mM

    甲醇                            0.5％