CD26/DPP IV在制备治疗和/或诊断疾病的药物中的应用

摘要

本发明涉及CD26/DPP IV在制备治疗和/或诊断疾病的药物中的应用，其中该疾病的治疗和/或诊断需要有拮抗趋化因子作用的活性。

说明书

本申请是申请日为1998年9月28日、申请号为CN98809572.6、发明名称为“作为趋化因子拮抗剂的氨基端截短的RANTES”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及CD26/DPP IV在制备治疗和/或诊断疾病的药物中的应用。

背景技术

趋化因子构成了具有白细胞趋化和活化性能的促炎性细胞因子小家族。根据第一个半胱氨酸的位置，趋化因子家族可以分为C-C、C-X-C和C-X₃-C趋化因子(BaggioliniM.等人，1994；Baggiolini M.等人，1997和Taub D.等人，1996)。

许多C-X-C趋化因子，如白细胞介素-8(IL-8)，对于嗜中性粒细胞有趋化作用，而C-C趋化因子，如单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)，则对包括单核细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞和树突细胞在内的各种白细胞有活性。

趋化因子的氨基端区域参与受体结合，氨基端的加工可以激活趋化因子，减少趋化因子活性或使趋化因子完全没有活性。

C-X-C趋化因子血小板碱性蛋白只有在除去氨基端的24个残基后才变成一种嗜中性粒细胞趋化肽(NAP-2)(Walz A.等人，1989和Van Damme J.等人，1990)。

IL-8缺失8个氨基端残基导致趋化活性增强，但是位于所有嗜中性粒细胞趋化性C-X-C趋化因子中第一个Cys前的Glu-Leu-Arg基序进一步断裂却导致其完全失去活性(Clark-Lewis I.等人，1991)。

另一个C-X-C趋化因子粒细胞趋化蛋白-2(GCP-2)所发生的相似的氨基端蛋白水解(解离下8个氨基酸)却对嗜中性粒细胞趋化活性没有影响(Proost P.等人，1993a)。

RANTES(是“Regulated upon Activation，Normally T Expressed，and presumbalySecreted(活化后可调节的、正常T细胞表达并可能分泌的因子)”的首字母缩略语)是一种C-C趋化因子，其cDNA克隆已经从T细胞特异性序列富集的cDNA文库中分离出来(Schall T.J.等人，1988)。

缺少8到9个氨基端氨基酸的合成的C-C趋化因子MCP-1、MCP-3和RANTES对单核细胞没有活性，并被用作受体拮抗剂(Gong J.等人，1996；和Gong J.等人，1995)。

RANTES延伸一个甲硫氨酸将导致该分子完全失活，Met-RANTES表现为真正的RANTES拮抗剂(Proudfoot A.E.等人，1996)。

发明内容

本发明的主要目的是氨基端截短的RANTES，它缺少对应于天然存在的RANTES的氨基酸残基1、1-2、1-3或1-4的氨基端氨基酸，并具有趋化因子拮抗剂活性。

本发明的一个具体的目的是RANTES(3-68)，它是缺少前两个氨基酸的RANTES，如图1和SEQ ID NO：2所示。

本发明的氨基端截短的RANTES可以是糖基化形式或非糖基化形式。

术语“趋化因子拮抗剂”指“成熟的、天然存在的全长趋化因子的拮抗剂”。

本发明的另一个目的是包含编码本发明氨基端截短的RANTES的DNA序列的DNA分子，它包括基本上相同的核苷酸序列。完整RANTES的cDNA序列公开在Schall T.J.等人(1988)中，截短的RANTES的cDNA很容易推导出来。

“基本上相同的核苷酸序列”包括凭借遗传密码的简并性也能编码出给定氨基酸序列的所有其它核酸序列。

本发明还包括含有上述DNA的表达载体，转化了该载体的宿主细胞，以及通过将所述转化细胞培养在合适培养基中来制备本发明这些氨基端截短的RANTES的方法。

编码本发明蛋白的DNA序列可以插入合适的质粒并与其连接。一旦形成表达载体，就将其导入合适的宿主细胞，该宿主细胞进而表达该载体，产生所需蛋白。

本文提到的任何本发明重组蛋白的表达均可用合适的表达载体在真核细胞(如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)或原核细胞中进行。本领域中已知的任何方法均可采用。

例如，用本领域熟知的技术(参见Sambrook等人，1989)将上述任一方法获得的编码蛋白的DNA分子插入适当构建的表达载体中。利用同聚物加尾、采用合成的DNA接头的限制性连接或平头连接技术，将双链cDNA连接到质粒载体中。用DNA连接酶连接DNA分子，通过碱性磷酸酶处理避免不希望发生的连接。

为了能表达所需的蛋白，表达载体还应包含特异的含有转录和翻译调控信息的核苷酸序列，该核苷酸序列与编码所需蛋白的DNA连接，从而允许该基因表达和产生蛋白。首先，为了使基因被转录，它的前面必须有能被RNA聚合酶识别的启动子，该启动子与聚合酶结合，从而启动转录过程。可以采用具有不同工作效率的各种启动子(强的和弱的启动子)。

对于真核宿主，可以采用不同的转录和翻译调控序列，这取决于宿主的性质。它们可以来自病毒，如腺病毒、牛乳头瘤病毒、猿猴病毒等，其中调控信号与具有高表达水平的特定基因相关联。例子是疱疹病毒的TK启动子、SV40早期启动子、酵母gal4基因启动子等。可以选择转录起始调控信号，使其具有阻遏和激活作用，从而能够调节基因的表达。

将包含编码本发明蛋白的核苷酸序列的DNA分子插入载体中与转录和翻译调控信号操作性相连，该载体能将所需基因序列整合入宿主细胞中。

还可以通过导入一个或多个允许选择含有表达载体的宿主细胞的标记物，来选择被导入的DNA稳定转化的细胞。标记物还可为营养缺陷型宿主提供光营养、杀微生物的抗性，例如抗生素，或重金属如铜等。可选择的标记基因可以和待表达的DNA基因序列直接连接，或通过共转染导入同一细胞中。为了使本发明蛋白的合成最优，可能还需要额外的元件。

选择特定质粒或病毒载体的重要因素包括：从不含载体的受体细胞中识别和选出含有载体的受体细胞的容易程度；特定宿主中所希望的载体拷贝数；以及是否希望载体能在不同种宿主细胞之间“穿梭”。

一旦制得了用于表达的载体或含DNA序列的构建物，就可用以下多种合适的方法将该DNA构建物导入合适的宿主细胞中：转化、转染、偶联、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等。

宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。较佳的是真核宿主，例如哺乳动物细胞，如人、猴、小鼠和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，因为它们为蛋白质分子提供了翻译后的修饰，包括正确折叠或在正确位点的糖基化。酵母细胞也可进行包括糖基化的翻译后肽修饰。有许多重组DNA策略采用了强启动子序列和高拷贝数的质粒，它们可用来在酵母中产生所需的蛋白质。酵母识别克隆的哺乳动物基因产物上的前导序列，并分泌携带前导序列的肽(即前肽(pre-peptide))。

在导入载体后，使宿主细胞在选择性培养基中生长，该培养基使含有载体的细胞选择性地生长。克隆的基因序列的表达导致产生所需的蛋白质。

本发明的氨基端截短的RANTES可用本领域中其它熟知的方法来制备，尤其是已建立的化学合成方法：用自动化固相肽合成仪，然后进行层析纯化。

例如，本发明的趋化因子可用Fmoc(9-芴甲氧基羰基)、tBoc(叔丁氧羰基)或其它任何类似的化学合成在不同氨基酸上有或没有合适的侧链保护基团的条件下合成。有或没有合适的侧链保护基团的氨基酸被预先激活(例如用HBTU/HOBt[2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-脲六氟磷酸/1-羟基苯并三唑)，并偶联到生长的肽链上。在加入下一个残基之前，从α氨基上除去保护基团(例如Fmoc)。合成后除去所有保护基团，纯化完整的全长肽并用化学方法或酶法将肽折叠(包括在半胱氨酸之间形成二硫键)成本发明相应的趋化因子。

天然的、合成的或重组的蛋白可用已知用于纯化的任一种方法(即任何常规方法，包括抽提、沉淀、层析、电泳等(例如参见Proost P.等人，1996))来进行纯化。用于纯化本发明蛋白的另一优选的纯化方法是亲和层析，该方法利用的是结合靶蛋白并产生和固定在柱中所含凝胶基质上的单克隆抗体或肝素的亲和力。使含有蛋白质的不纯制备物通过该柱。蛋白质将会通过特异性抗体结合在柱上，而杂质则将通过柱。洗柱后，通过改变pH或离子强度将蛋白质从凝胶上洗脱下来。

本发明的氨基端截短的RANTES可用于治疗和/或诊断需要有拮抗趋化因子作用的活性的疾病。这些疾病的例子包括：炎性疾病、血管生成和血细胞生成相关疾病、肿瘤、传染病(包括HIV)、自身免疫疾病、动脉粥样硬化、肺疾病和皮肤病。较佳的用途是用于HIV-感染场合。

因此，本发明另一方面提供了本发明的蛋白在生产用于治疗上述疾病的药物中的应用。

药物宜为包含本发明蛋白以及一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物形式。这些药物组合物形成了本发明的另一个方面。

本发明还有一个方面是一种治疗上述疾病的方法，该方法包括给予处于发生这些疾病危险的对象或已经表现出这些病理学现象的对象药学上活性量的本发明氨基端截短的RANTES。

已经发现，CD26/DPP IV能在体外产生氨基端截短的RANTES。RANTES是据报道生物活性能被CD26/DPP IV修饰的第一个细胞因子。

因此，本发明的另一个目的是用CD26/DPP IV来治疗和/或诊断需要有拮抗细胞因子作用活性的疾病，特别是炎性、免疫和传染性疾病。

即，本发明另一方面涉及CD26/DPP IV在制备治疗和/或诊断疾病的药物中的应用，其中该疾病的治疗和/或诊断需要有拮抗趋化因子作用的活性。

由于这代表的是内源性调节的趋化因子变成拮抗剂的已确定机制的第一个例子，但相似的生理性加工还可由其它因子(蛋白酶)介导。本发明也包括用这些因子(蛋白酶)来治疗和/或诊断上述疾病。

现在将通过下列实施例来描述本发明，这些实施例不应被理解成以任何方式限定了本发明。实施例将参考下文所述的附图。

附图说明

图1：它显示了RANTES的氨基酸序列。信号序列用斜体字表示，而C端残基用粗体表示。箭头表示本发明的氨基端截短的RANTES(也称为RANTES(3-68))的第一个氨基酸。

图2：在Boyden微室试验中比较完整的和氨基端截短的天然或重组RANTES对单核细胞性THP-1细胞的趋化效力：天然RANTES(1-68)(△)，天然的截短的RANTES(3-68)(□)，完整的重组RANTES(1-68)(▲)和CD26/DPP IV断裂的重组RANTES(3-68)(■)。结果表示成四个或四个以上单独实验的平均趋化指数±SEM。

图3：天然RANTES(3-68)(□)，天然RANTES(1-68)(△)，重组RANTES(1-68)(▲)和CD26/DPP IV处理的重组RANTES(3-68)(■)对于THP-1细胞中[Ca²⁺]_i的影响。结果表示成3次或3次以上独立实验的[Ca²⁺]_i增加平均值±SEM。

图4：它显示了RANTES(3-68)对完整的recRANTES(1-68)的Ca²⁺迁移活性的脱敏作用。首先，用缓冲液或不同浓度的重组RANTES(1-68)或RANTES(3-68)刺激THP-1细胞。结果表示成对作为第二刺激的30ng/ml完整的重组RANTES反应中[Ca²⁺]_i增加的平均值(三次或三次以上独立的实验)±SEM。

图5：截短的RANTES(3-68)和完整的RANTES(1-68)的趋化效力的比较。在微室试验中，测定了天然(nat)和重组(rec)截短的RANTES、完整的RANTES和合成的MCP-3的嗜酸性粒细胞趋化活性。结果表示成两次或两次以上的独立试验(每一次进行一式三份)的平均趋化指数(CI)±SEM。

图6：在CCR转染体中用完整的RANTES使钙迁移脱敏。钙迁移实验在转染了CD4和CC趋化因子受体CCR1或CCR5的HOS细胞中进行。首先用不同浓度的完整或截短的RANTES刺激细胞，然后用100ng/ml完整的RANTES刺激。图中显示了第二刺激诱导的[Ca²⁺]_i增加的抑制百分数。通过在加入RANTES(1-68)或RANTES(3-68)后将100ng/ml完整RANTES的反应与用缓冲液(100％)刺激后的反应相比较，计算出该百分数。结果表示成两次或两次以上实验的平均抑制百分数±SEM。

图7：RANTES(3-68)对HIV-1感染单核细胞有强效抑制效果。在不同浓度的RANTES(1-68)或RANTES(3-68)(在感染时加入0-1000ng/ml)存在下，用亲M的HIV-1Ba-L病毒株感染PHA激活的PBMC。10天后，用p-24 Ag ELISA监测细胞上清液中的病毒产量(图中示出了四个实验中的一个典型实验)。

图8：RANTES(1-68)和RANTES(3-68)对PHA-激活的PBMC中HIV-1 SF162病毒株感染的效果。感染后10天用p24 Ag ELISA监测细胞上清液的病毒产量。图中示出了三个实验中的一个典型的实验结果。^*表示在p24 Ag ELISA的检测极限下(＜5pg/ml)。

图9：CD26在HOS.CD4.CCR5细胞、U87.CD4.CCR5细胞和新分离的PBMC上的表达。CD26阳性细胞的百分数(％)显示在各柱状图中。

图10：RANTES(1-68)、RANTES(1-68)加上sCD26(50U/L)、以及RANTES(3-68)对HOS.CD4.CCR5细胞被HIV-1 BaL毒株感染的效果。感染后8天用p24Ag ELISA检测细胞上清中的病毒产量。图中示出了三个实验中一个典型实验的结果。

具体实施方案

实施例1：氨基端截短的RANTES

材料和方法

试剂

天然的人RANTES由人Malavu肝肉瘤细胞、MG-63骨肉瘤细胞或外周血白细胞(Antwerp和Leuven的输血中心)产生，并如前所述的那样(Proost P.等人，1996和Proost P.等人，1993)纯化。用Fmoc化学方法(Proost P.等人，1995和Wuyts A.等人，1997)合成MCP-2、MCP-3和GCP-2，重组人RANTES购自Peprotech(Rocky Hill，NJ)，重组MCP-1由J.J.Oppenheim博士(NCI-NIH，Frederick，MD)赠与。

用CD4和CC趋化因子受体CCR1、CCR3或CCR5(Deng H.，等人，1996)之一转染人骨肉瘤(HOS)细胞在含谷氨酸盐(glutamax)的DMEM中生长。在培养基中加入嘌呤霉素(1微克/毫升)作为选择剂。所有生长培养基(Gibco BRL/Life Technologies，Paisley，UK)增添10％FCS。

人CD26/DPP IV从前列腺小体(prostasomes)(前列腺衍生的细胞器，在精清中游离存在)获得。如前所述(De Meester I.等人，1996)，用离子交换然后腺苷脱氨酶亲和层析，将此酶纯化至均一。

用CD26/DPP IV培育趋化因子并检测蛋白水解加工

使100至1000摩尔过量的趋化因子在100mM Tris/HCl pH 7.7中和CD26/DPP IV培育过夜。如前所述(Proost P.等人，1996)，用SDS-PAGE在Tris/Tricine凝胶系统上从CD26/DPP IV中分离出趋化因子。

将蛋白质电泳印迹到PVDF(聚偏氟乙烯)膜(Problott，Perkin Elmer，Foster City，CA)上，并用考马斯亮蓝R250染色。脱色后，用超纯水洗膜至少5次(Milli Q；Millipore，Bedford，MA)。

为了获得足量的纯的截短的趋化因子用于生物试验，用CD26/DPP IV处理约50微克重组趋化因子，用0.1％三氟乙酸(TFA)酸化断裂产物。加入吐温20(0.01％)以防趋化因子粘在管上。

在C-8 Aquapore RP-300柱(1×50cm)(Perkin Elmer)上以乙腈梯度从CD26/DPP IV中分离趋化因子。用上述的SDS-PAGE和银染法分析含该蛋白质的各级分。

在脉冲液相477A/120A蛋白质测序仪(Perkin Elmer)上用N-甲基哌啶作为偶联碱，用Edman降解法对CD26/DPP IV处理的、RP-HPLC纯化或从PVDF印迹上切下的趋化因子的氨基端进行测序。

趋化活性的检测

在Boyden微室中(Proost P.等人，1996和Proost P.等人，1993)测试趋化因子在新鲜分离的外周血嗜中性粒细胞(10⁶细胞/毫升)或培养的单核细胞性THP-1细胞(0.5×10⁶细胞/毫升)上的趋化活性。

37℃培育45分钟(粒细胞)或2小时(THP-1细胞)后，固定细胞并染色。然后用显微镜计数10个油浸视野中迁移通过孔径5微米的聚碳酸酯膜的细胞。

将迁移到测试样品中的细胞数除以迁移至对照培养基中的细胞数，计算样品(每个室中一式三份)的趋化指数(CI)。在脱敏实验中，在转移至小室前，用无生物活性的趋化因子变体37℃培育细胞10分钟。

计算用HBSS处理的对照细胞脱敏获得的CI抑制百分数，以评价趋化脱敏。

胞内Ca²⁺浓度的检测

如以前所述的那样(Wuyts A.等人，1997)，测定了胞内钙浓度([Ca²⁺]_i)。简言之，使纯化的细胞和荧光指示剂fura-2(fura-2/AM 2.5μM；Molecular Probes Europe BV，Leiden，The Netherlands)和0.01％Pluronic F-127(Sigma，St Louis MO)一起培育。

30分钟后，洗涤细胞两次，并重悬于含1mM Ca²⁺的HBSS中，37℃培育细胞10分钟，然后在LS50B发光分光光度计(Perkin Elmer)中测定fura-2荧光。在340和380nm处激发后，在510nm检测荧光。用Grynkiewicz方程式(Grynkiewicz等人，1985)计算[Ca²⁺]_i。

为了测定R_max，用50μM毛地黄皂苷裂解细胞。随后，用20mM Tris调节pH至8.5，在裂解的细胞中加入10mM EGTA，获得R_min。用于标定的K_d为224nM。

对于脱敏实验，首先用缓冲液或不同浓度的趋化因子刺激细胞。作为第二刺激，加入的趋化因子浓度为缓冲液预先刺激后诱导[Ca²⁺]_i显著增加的浓度。计算预先刺激细胞后对第二刺激反应的[Ca²⁺]_i增加的抑制百分数。

HIV-1感染的抑制

从MRC AIDS试剂方案(Herts，UK)获得HIV-1的M向性病毒株BaL和SF162。用密度梯度离心(5，23)从健康献血员中分离出外周血单核细胞(PBMC)，并用1微克/毫升PHA(Sigma，Bornem，Belgium)37℃刺激3天。用PBS洗涤激活细胞(PHA刺激的母细胞)三次，如前所述(Schols D.等人，1997)用病毒感染。将HIV-1感染的或模拟感染的PHA-刺激的母细胞培育在25U/毫升IL-2和不同浓度的RANTES(1-68)或RANTES(3-68)中。在第10天收集细胞上清，用p-24 Ag ELISA试剂盒(DuPont/NENLife Sciene Products，Brussels，Belgium)分析上清液中的HIV-1核心抗原。

结果

天然的氨基端截短的RANTES的鉴定和生物学特性分析

以前已经分离了不同形式的氨基端截短的人GCP-2(Proost P.等人，1993)。截去最少的GCP-2类型在倒数第二个位置的Pro前断裂[GCP-2(3-75)]。用相似的标准纯化程序，从外周血白细胞或肉瘤细胞纯化获得C-C趋化因子RANTES(Proost P.等人，1996)。

具体地说，将细胞因子混合物诱导的MG-63或Malavu肉瘤细胞的条件培养基分级，以分离天然的趋化因子变体。随后用抗体或肝素亲和层析、阳离子交换层析(monoS FPLC)和RP-HPLC纯化趋化因子，用特异性趋化因子ELISA检测免疫活性形式。在阳离子交换柱上，发现IL-8的洗脱与RANTES的洗脱非常靠近(在0.7和0.75M NaCl之间)。然而，用RP-HPLC可将两种趋化因子相互分离(RANTES和IL-8分别在27.5％和30％乙腈处洗脱)。纯蛋白的氨基酸序列分析确认IL-8以不同的氨基端截短形式出现，这在以前已经根据它们的趋化活性作了分离(Van Damme J.等人，1989)。然而，对于RANTES却只分离出一种形式，它与完整的RANTES相比缺少两个氨基端残基。鉴于它的存在占多数，因此更详细地分析该RANTES(3-68)以验证其对单核细胞以及嗜酸性粒细胞的趋化活性。具体地说，测试RANTES(3-68)的趋化活性和/或胞内Ca²⁺释放活性，并将其生物效力和各完整的趋化因子相比较。

RANTES的氨基端缺失两个残基导致单核细胞趋化活性以及Ca²⁺释放活性大大降低。与完整的天然RANTES(最低效应剂量为3-10ng/ml)相比，天然RANTES(3-68)在高达300ng/ml的浓度下在Boyden微室中测试时总地来说没有活性(图2)。另外，与RANTES(1-68)相比，需要浓度高10倍的天然RANTES(3-68)才能获得相似的Ca²⁺-反应(图3)。

CD26/DPP IV除去了趋化因子的氨基端二肽

为了研究氨基肽酶CD26/DPP IV是否导致RANTES的氨基端截短，使完整的趋化因子和CD26/DPP IV培育过夜，印迹到PVDF膜上，用考马斯蓝染色，并进行自动的Edman降解。用CD26/DPP IV处理RANTES将导致除去氨基端的两个肽。用不含CD26/DPP IV的缓冲液并行培育趋化因子没有作用。

由于其它趋化因子含有CD26/DPP IV断裂的共有序列，且MCP的氨基端表现出对于生物活性是关键的(Gong J.等人，1996和Gong J.等人，1995)，因此还使MCP-1、MCP-2和MCP-3与CD26/DPP IV一起培育。

处理后，将MCP印迹到PVDF膜上，用考马斯蓝染色来确认回收了足量蛋白质用于Edman降解。

然而，没有检测到氨基端序列，这表明CD26/DPP IV不改变MCP的氨基端，该氨基端对于焦谷氨酸的Edman降解被阻断。

比较完整的和CD26/DPP IV处理的RANTES的生物学活性

与天然RANTES(3-68)相似，C-8 RP-HPLC纯化的、CD26/DPP IV处理的重组RANTES在Boyden微室趋化实验中、当所用浓度高达1微克/毫升时没有活性，而完整的重组RANTES从30到100ng/ml以上却检测到有显著的单核细胞趋化反应(图2)。

当在Ca²⁺迁移试验中测试截短效应时，RANTES(3-68)在100ng/ml下诱导了低而显著的增加。然而，完整的RANTES在10ng/ml下就已经有活性(图3)。结论是，尽管只除去了两个氨基端残基，RANTES的单核细胞趋化性和Ca²⁺迁移效力减少了10-100倍。

RANTES(3-68)是完整RANTES的天然的趋化拮抗剂。

鉴于RANTES(3-68)在单核细胞趋化实验中没有活性，所以我们测试该截短的RANTES是否可能起拮抗剂的作用。1微克/毫升的RANTES(3-68)就几乎完全(82％)使100ng/ml完整RANTES的趋化效应脱敏(表I)。

当在上排孔中加入3倍过量的RANTES(3-68)后，THP-1细胞向完整RANTES的趋化受到约50-70％的抑制。300ng/ml的RANTES(3-68)仍能使向相同浓度的完整RANTES的趋化反应受到约30％的抑制。

在THP-1细胞的Ca²⁺迁移实验中(图4)，30ng/ml的完整RANTES能使30ng/ml的完整RANTES的效应脱敏39±5％。RANTES(3-68)要获得相同程度的脱敏则需要大约高10倍的浓度。然而，在300ng/ml下，RANTES(3-68)本身引起了明显的Ca²⁺反应。该Ca²⁺反应与用30ng/ml完整RANTES获得的反应相当。

                               表I

          RANTES(3-68)使RANTES(1-68)诱导的单核细胞趋化脱敏¹

    趋化因子(ng/ml)                趋化反应(CI)  下排孔  上排孔  ％抑制 RANTES(1-    68) RANTES(3-    68)    A   B    C    D 平均值 ±SEM  平均值  ±SEM    300    1000  12.5  7.5  27.5  50.5 25±10  67±8    300  22.0  20.5  72.5  79.5 49±16  31±13    0  41.0  46.0  71.5  97.0 64±13    0    100    1000  4.0  3.0  13.5  11.0 8±3  82±4    300  7.5  7.0  29.0  33.0 19±7  53±11    0  24.0  21.5  50.0  44.5 35±7    0

¹结果表示为四个独立实验(A-D)的趋化指数(C.I.)(包括平均值±SEM)，以及用无活性RANTES(3-68)或缓冲液预先培育THP-1细胞后向RANTES(1-68)的趋化反应的抑制百分数(％)(四次实验的抑制％的平均值±SEM)。

RANTES(3-68)对人单核细胞以及嗜酸性粒细胞的削弱的趋化活性

在表II中比较了天然RANTES(3-68)与单核细胞趋化蛋白MCP-3以及完整RANTES(1-68)的趋化效力。可以看出，MCP-3和RANTES(1-68)分别在3ng/ml和30ng/ml下对新鲜分离的外周血单核细胞仍有趋化性，而天然的RANTES(3-68)在100ng/ml下仍没有活性。

用重组RANTES(3-68)确认了该天然变体的降低的趋化效力。尽管对单核细胞的趋化性较弱(在1微克/毫升下)，但是纯化的重组RANTES(3-68)还是显示出比活比完整的重组RANTES低10倍。

最后，在对100ng/ml完整RANTES以及30ng/ml MCP-3仍有反应的人嗜酸性粒细胞上验证了RANTES(3-68)的趋化效力(图5)。与单核细胞相似，嗜酸性粒细胞只在1微克/毫升下受刺激迁移。

                            表II

               比较RANTES(3-68)与RANTES(1-68)

                 和MCP-3的单核细胞趋化活性

                      单核细胞趋化活性^a)

浓度(ng/ml)       MCP-3       natRANTES(3-       recRANTES(1-        recRANTES(3-

                                  68)                 68)                 68)

  1000             __^b)          __              3.6±0.8(6)           3.3(1)

  300          6.0±1.2(6)        __                  __                  __

  100              __         1.1±0.1(3)         3.3±0.4(6)           1.0(1)

  30           6.9±1.0(6)    1.7±0.2(3)             __                  __

  10               __         1.9±0.6(3)         1.9±0.4(6)          ＜1.0(1)

  3            4.1±0.4(6)        __                  __                  __

^a)指在新鲜分离的外周血单核细胞上的平均趋化指数(CI)±SEM(n)

^b)未测定

RANTES(3-68)通过CCR5而不是通过CCR1和CCR3传递信号并使RANTES(1-68)脱敏

为了解释RANTES(3-68)的减少的趋化活性，验证了该趋化因子变体通过RANTES所用的已知受体来结合和传递信号的能力。

在测定胞内钙浓度增加的信号传导试验中，采用了用趋化因子受体CCR1、CCR3或CCR5转染的HOS细胞。在高达300ng/ml的浓度下，RANTES(3-68)没有增加CCR1(表III)或CCR3(数据未显示)转染的HOS细胞中的[Ca²⁺]_i，而30ng/ml和100ng/ml的完整的RANTES却足以分别诱导CCR1和CCR3转染体中的[Ca²⁺]_i增加。

然而，完整的和截短的RANTES均能在30ng/ml下诱导CCR5转染体中的[Ca²⁺]_i明显增加。而且，通过用3至10倍过量的RANTES(3-68)或完整的RANTES预先培育CCR5转染的细胞，随后用完整的RANTES(100ng/ml)攻击获得了对[Ca²⁺]_i升高的相同抑制(约75％)(图6)。

相反，300ng/ml的RANTES(3-68)仅仅使CCR1和CCR3转染的细胞对100ng/ml完整RANTES的钙反应勉强脱敏，而3倍以上的完整RANTES作为第一刺激几乎完全抑制了这些细胞因随后RANTES(1-68)的刺激而产生的[Ca²⁺]_i增加。因此，必定能得出这样的结论，即，从RANTES中除去两个氨基端残基对信号转导有显著影响，因为趋化因子受体CCR1和CCR3不再被功能性地识别。因此，RANTES(3-68)的趋化效力削弱可以解释为它不能通过CCR1和CCR3起作用。相反，RANTES(3-68)完全保留了完整RANTES的CCR5信号传导特性。RANTES(3-68)可以通过与完整RANTES的竞争而具有抗炎性，但是仍然能通过保留其结合CCR5的能力而起HIV-抑制剂的作用。

                            表III

          RANTES的各种形式在CCR1和CCR5转染体中的钙迁移

  趋化因子     浓度(ng/ml)               [Ca²⁺]_i的增加(nM)^a)

                                       CCR1            CCR5

RANTES(1-68)    300                  133±5(3)        96±1(2)

                100                  100±28(3)       60±4(2)

                30                   25±(3)          24±2(2)

                10                   ＜15(2)          ＜15(1)

RANTES(3-68)    300                  19±9(3)         119±5(2)

                100                  ＜15±0(3)       76±4(2)

                30                   ＜15(2)          56±13(2)

                10                                    ＜15(1)

^a)显示了[Ca²⁺]_i增加的平均值为两次或多次独立实验的nM±SEM。

RANTES(3-68)抑制人单核细胞中CC趋化因子诱导的趋化作用

为了验证单核细胞中是否也发生RANTES(3-68)对CC趋化因子信号传导的抑制，在THP-1细胞中进行抑制实验。证据表明，与完整RANTES相比，RANTES(3-68)显示增加单核细胞中[Ca²⁺]_i的效力减少了10倍(数据未示出)。另外，通过将测试细胞与300ng/ml RANTES(3-68)一起培育，完整RANTES(30ng/ml)对单核细胞的趋化效应受到抑制(71％)，如表IV所示。

另外，RANTES(3-68)减少了对其它CC趋化因子的趋化反应，这些CC趋化因子包括单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)(67％)、巨噬细胞炎性蛋白-1a(MIP-1α)(61％)和MIP-1β(80％)。

这表明RANTES(3-68)的功能是其它CC趋化因子诱导的单核细胞迁移的广谱抑制剂。

                               表IV

             RANTES(3-68)抑制单核细胞向CC趋化因子的趋化

                                                THP-1细胞趋化的抑制

趋化因子^a)     浓度(ng/ml)      缓冲液^b，c)    RANTES(3-68)^b，c)        ％抑制^d)

 RANTES            30            19.0±6.6          3.7±0.6             71±16

 MCP-3             30            48.5±9.3          24.9±2.0            45±10

 MCP-3             3             7.6±2.5           3.1±0.8             67±13

 MIP-1α                        30            6.2±2.4           3.0±1.1             61±22

 MIP-1β                        300           4.3±1.0           1.9±0.6             80±12

  对照                           1.5±0.5           1.0±0.5

a)在微室的下排孔中加入RANTES、MCP-3、MIP-1α、MIP-1β和缓冲液作为趋化吸引物。

b)在微室的上排孔中加入用300ng/ml RANTES(3-68)或缓冲液预先培育(37℃10分钟)的THP-1细胞。

c)四个独立实验的CI平均值±SEM。

d)在300ng/ml RANTES(3-68)存在下，对完整趋化因子诱导的迁移的抑制。

RANTES的CD26特异性截短是其抗病毒活性所必需的。

首先评价不同形式的RANTES在健康献血员衍生的人PBMC中抵御两种不同M向性HIV-1病毒株(BaL和SF162)的作用。完整RANTES(1-68)针对BaL病毒株的IC₅₀为3.4nM，RANTES(3-68)的IC₅₀为0.39nM。RANTES(1-68)的IC₉₀为71nM，它约为RANTES(3-68)IC₉₀的10倍。当在PBMC中评价抵抗SF162病毒株时，RANTES(1-68)(IC₅₀为23nM；IC₉₀为95nM)的活性比RANTES(3-68)(IC₅₀为2nM；IC₉₀为8.5nM)低10倍(表V)。图8中显示了两种趋化因子在133至0.2nM的浓度范围内HIV-1 SF162在抵抗PBMC中复制的浓度依赖型效应。浓度为5.2nM的RANTES(3-68)在减少病毒复制方面是明显有效的，而RANTES(1-68)在此浓度下没有活性。注意到，在Pepro Tech或R&D Systems获得的完整RANTES之间抗病毒活性没有差别。

当在CCR5转染的人细胞中测试时，两种形式的RANTES之间抗病毒活性的显著差别更为明显。在U78.CD4.CCR5细胞中，RANTES(1-68)和RANTES(3-68)抵抗BaL病毒株的IC₅₀分别为21nM和0.65nM。RANTES(1-68)的IC₉₀高于133nM，而RANTES(3-68)的IC₉₀为63nM。另如表V所示，RANTES(1-68)在HOS.CD4.CCR5细胞中基本上没有活性(IC₅₀大于133nM)，而RANTES(3-68)是HIV-1 BaL在这些细胞中复制的强效抑制剂(IC₅₀为5.5nM)。然而，两种形式的RANTES在这些细胞中均没有到达IC₉₀值。

RANTES的抗病毒活性取决于膜结合的或可溶的CD26(sCD26)的存在。

评价了两种不同的CCR5转染的细胞系和新鲜分离的PBMC上的CD26表达。经流式细胞计数分析测定，HOS转染体对于CD26表达呈阴性，而U87转染体染色弱，但对抗CD26单抗呈明显阳性染色(图9)。另外，发现新鲜分离的PMBC亚群的CD26表达呈强阳性(图9)。

图10显示了RANTES(1-68)和RANTES(3-68)对于BaL病毒株在HOS.CD4.CCR5转染的细胞中在sCD26存在下产生病毒p24 Ag的浓度依赖型效应。在HIV感染开始时sCD26的加入和RANTES(1-68)一起，明显增强了完整RANTES在HOS.CD4.CCR5细胞中的抗病毒活性。当加入50U/I的sCD26和RANTES一起时，获得的RANTES的IC₅₀为13nM。单独加入sCD26对病毒复制没有影响。将sCD26加入RANTES(3-68)也不改变RANTES(3-68)的抗病毒活性(数据未显示)。因此，CD26的存在是完整RANTES具有抗病毒活性所必需的。

天然MIP-1α的氨基端截短不影响其抗HIV-1趋化性和Ca²⁺迁移活性。

由于大多数天然的MIP-1α是氨基端截短的(截去4个氨基酸)，因此我们研究该截短的MIP-1α(5-70)是否具有改变的HIV-1抑制能力。与RANTES获得的结果相反，在PMBC或CCR5转染的细胞中没有检测到完整MIP-1α和MIP-1α(5-70)的IC₅₀值有明显不同(表V，图8)。另外，在THP-1单核细胞上的趋化作用和胞内Ca²⁺迁移试验中比较了完整的MIP-1α和截短的MIP-1α(5-70)。表VI证明，MIP-1α(5-70)诱导[Ca²⁺]_i增加的最低有效剂量仅稍稍低于完整MIP-1α。而且，尽管在趋化试验中，用0.13nM完整MIP-1α获得的最大迁移较高，但是两种MIP-1α同种型的最低效应浓度却大致相似。总之，结论必然是，MIP-1α的氨基端加工与RANTES相反，只是最低程度地削弱了其抗炎和抗HIV-1活性。

表V.RANTES和MIP-1α在PHA-刺激的PMBC，U87.CD4.CCR5细胞中的抗HIV-1活性。

               RANTES(1-68)    RANTES(3-68)    MIP-(1-70)     MIP-1α(5-70)

               IC₅₀  IC₉₀    IC₅₀  IC₉₀    IC₅₀  IC₉₀   IC₅₀   IC₉₀

PBMC BaL

               3.4    71       0.39   6.9      1.9    62      1.6     13

SF162

               23     95       2.0    8.2      3.1    30      3.6     32

U87.CD4.CCR5

BaL

               21     ＞130    0.65   63       ND     ND      ND      ND

HOS.CD4.CCR5

BaL

               ＞130  ＞130    5.5    ＞130    32     ＞130   21      ＞130

用病毒性p24 Ag ELISA在感染后8-12天监测无细胞上清液中的病毒产量。表中显示了IC₅₀和IC₉₀的平均值(nM)。数据代表了两至四次独立实验的平均值。数值标为“＞130”表明在130nM下没有达到50％或90％抑制。ND，未进行。

表VI完整和截短的MIP-1α之间的生物学效力没有差别

                       趋化^*                    [Ca²⁺]_i的增加⁺

   趋化因子       nM         C.I.            nM              nM[Ca²⁺]_i

MIP-1α(1-70)     1.3       8.5±3.3        3.9               240/195

                  0.13      22.2±4.4       0.39              120/130

                  0.013     5.7±1.6        0.34              30/14

                  0.0013    4.0±3.1

MIP-1α(5-70)     1.3       14.2±0.4       4.0               196/178

                  0.13      11.4±2.9       0.4               71/33

                  0.013     3.8±1.4        0.04              10/＜10

                  0.0013    2.1±0.6

^*单核细胞THP-1迁移通过微室中5.0μm的孔。结果是三次独立实验的平均值。

⁺检测THP-1中[Ca²⁺]_i的增加。表中显示了两次独立实验的结果。

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<151>1998-03-10

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>91

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

Met Lys Val Ser Ala Ala Arg Leu Ala Val Ile Leu Ile Ala Thr Ala

           -20                  -15                 -10

Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro

        -5                  1               5

Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His Ile Lys

10                  15                  20                  25

Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe

                30                  35                  40

Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp

            45                  50                  55

Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser

        60                  65

<210>2

<211>66

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400> 2

Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr Ile Ala Arg Pro

1               5                   10                  15

Leu Pro Arg Ala His Ile Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys

            20                  25                  30

Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys

        35                  40                  45

Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu

    50                  55                  60

Met Ser

65