酶法水解白头翁皂甙糖基制备低糖基白头翁皂甙的方法

摘要

本发明公开一种酶法水解白头翁皂甙糖基制备低糖基皂甙的方法，是用酶水解白头翁皂甙糖基，制备低糖基白头翁皂甙。包括如下步骤：取能水解白头翁皂甙糖基的酶；将酶、白头翁皂甙及缓冲液混合反应4－40小时，反应条件为温度4－75℃、pH值3－9，提取低糖基白头翁皂甙。克服了现有技术所存在的对甙破坏性大、污染严重、目的性差等缺点，具有无污染、目的性强、转化率高的优点。不仅提高抗菌效果，同时还可消除溶血性，对药物、保健食品开发很有意义。尤其是在微生物发酵中加入了产酶诱导物，可大大提高其产酶量，有助于充分水解白头翁皂甙糖基，更加提高了低糖基白头翁皂甙的转化率。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种制备低糖基白头翁皂甙的方法，尤其是一种用能水解白头翁皂甙糖基的酶处理白头翁皂甙，酶法水解白头翁皂甙糖基制备低糖基白头翁皂甙的方法。

背景技术：

白头翁是毛莨科、白头翁属植物，属多年生草本，多取其根部入药，又名奈何草、粉草、毛姑朵花等。主要分布在东北，华北及陕西、安徽、江苏、湖北、四川等地。史料载“白头翁生高山山谷及田野，四月采。白头翁种类繁多，《中国药典》仅收载白头翁P.chinensis一种作为正品白头翁使用，既毛莨科植物白头翁Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel。此外还有以下几种：兴安白头翁Pulsatilla dahurica(Fisch)Spreng，细叶白头翁Pulsatillaturczaninovii Kryl.et Serg.(细裂白头翁)，朝鲜白头翁Pulsatillakoreana Nakai exMari，新疆白头翁Pulsatilla ambigua Turcz.exPritz.，阿尔泰白头翁Pulsatilla companella Fisch.，掌叶白头翁Pulsatillapatens Mill.，黄花白头翁Pulsatilla sukaczevii Turcz等，还有一些变种。白头翁的主要有效成分是皂甙(苷)，其甙元是三萜类23-羟基白桦酸(anemosapogenin)。其化学分子结构为：

其中R¹和R²为糖的侧链，根据R¹、R²的不同进行区分，白头翁皂甙的种类可按序号排列入下：

皂甙1：R¹＝α-L-rha-(1→2)-α-L-ara-

       R²＝H-

皂甙2：R¹＝α-L-ara-

       R²＝α-L-rha-(1→4)-β-D-glc-(1→6)-β-D-glc-

皂甙3：R¹＝α-L-rha-(1→2)-α-L-ara-

       R²＝α-L-rha-(1→4)-β-D-glc-(1→6)-β-D-glc-

皂甙4：R¹＝α-L-ara-

       R²＝β-D-glc-(1→6)-β-D-glc-

皂甙5：R¹＝α-L-ara-

       R²＝β-D-glc-

皂甙6：R¹＝H-

       R²＝β-D-glc-

皂甙7：R¹＝α-L-ara-

       R²＝H-

甙元：R¹＝H-

      R²＝H-

(glc，葡萄糖；ara，阿拉伯糖；rha，鼠李糖)

白头翁中含量较高的皂甙是白头翁皂甙2和3；以皂甙3为例，其学名是3-0-[α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-α-L-比喃阿拉伯糖基]-3β，23-二羟基-(烯)Δ²⁰⁽²⁹⁾-羽扇豆烯-28-酸糖酯[28-0-[α-L-比喃鼠李糖-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖基]。

白头翁皂甙抗菌性广泛，它能抑制金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌、枯草杆菌、伤寒杆菌、沙门菌等的生长，杀灭阴道滴虫；也对颈淋巴结核、肺部鳞癌和黑色素瘤等有一定疗效。但是白头翁中含量较高的皂甙，含糖基数量为4-5个，溶血性高，抗菌效果低。而低糖基白头翁皂甙或甙元活性却较高，溶血性低。以往从白头翁皂甙去掉糖基制备低糖基白头翁皂甙或甙元的方法主要是酸碱水解法。如用氨水处理，可以水解28糖上的糖酯键，从白头翁皂甙4得到皂甙2(吴振洁等，中国药科大学学报，1991，22(5)，265-269)；酸处理法可以得到甙元(叶文才等，中国药科大学学报，1990，21(5)，264-266)。上述酸碱水解方法，糖基水解的目的性差，碱水解全部水解糖酯键，酸水解污染严重、对甙元破坏性大。

发明内容：

本发明是为了解决现有技术中所存在的技术问题，提供一种酶法水解含量较高的白头翁皂甙糖基，制备低糖基白头翁皂甙的方法，无污染、目的性强、转化率高。

本发明的技术解决方案是：一种酶法水解白头翁皂甙糖基制备低糖基皂甙的方法，是用酶水解白头翁皂甙糖基，制备低糖基白头翁皂甙。

包括如下步骤：

a.取能水解白头翁皂甙糖基的酶；

b.将酶、白头翁皂甙及缓冲液混合反应4-40小时，反应条件为温度4-75℃、PH值3-9。

c.提取低糖基白头翁皂甙。

所述的a步骤可由微生物发酵制备。

所述的微生物发酵制备是用液态发酵或固态发酵法得到含酶混合液，在含酶混合液内加入硫酸铵或者乙醇提取酶。

所述的微生物为细菌、链霉菌、霉菌、酵母菌、担子菌。

所述的微生物为曲霉属(Aspergillus genus)霉菌。

所述的微生物发酵为有产酶诱导物参与发酵。

所述的b步骤的白头翁皂甙浓度为总反应物体积的0.02-15％。

所述的缓冲液为醋酸或磷酸。

所述的c步骤为用乙醇沉淀提取或用正丁醇萃取。

本发明同现有技术相比，最大的特点是用酶水解白头翁皂甙糖基，制备低糖基白头翁皂甙或甙元。克服了现有技术所存在的对甙破坏性大、污染严重、目的性差等缺点，具有无污染、目的性强、转化率高的优点。不仅提高抗菌效果，同时还可消除溶血性，对药物、保健食品开发很有意义。尤其是在微生物发酵中加入了产酶诱导物，可大大提高其产酶量，有助于充分水解白头翁皂甙糖基，更加提高了低糖基白头翁皂甙的转化率。

具体实施方式：

实施例1：

a.以高温好氧菌Bacillus sp.JF菌(文献1)在含3％玉米粉、0.2％产酶诱导物——白头翁浸出物(干物)、0.01％MgSO4培养基中，在温度60℃条件下通风培养30-40小时，离心除菌得含酶混合液，用50-80％乙醇沉淀酶蛋白，冻干，得到皂甙酶。

b.用10克上述皂甙酶、30克白头翁皂甙、1500毫升醋酸缓冲液(0.2M，pH5.0)和150毫升乙醇混合均匀，使反应物浓度为0.01-15％，在温度75℃条件下搅拌反应4小时。

c.反应後加入6000毫升乙醇，过滤除去蛋白沉淀，滤液减压蒸干，得到20克低糖基皂甙粗品。

用薄层层析法(文献2)检测结果80％以上的白头翁皂甙转化成低糖基次生皂甙。用硅胶柱分离方法(文献3)得到白头翁皂甙酶反应产物单体四种，经热甲醇溶解、冷却结晶法精制单体。经核磁共振方法(文献4、5)确定结构：其单体结构是白头翁皂甙5、6、7和甙元，得到量依次为4.1克、3.5克、1.6克、0.2克。

上述酶液DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪(文献6)分离提纯白头翁皂甙酶蛋白，用SDS电泳方法测定分子量(文献7)，酶的分子量为5.0万。

实施例2：

其它同实施例1，培养基中的产酶诱导物为0.05％的大豆异黄酮。

实施例3：

a.黑曲霉菌(Aspegillus niger)在含5％麦麸浸出物、1％产酶诱导物——白头翁浸出物(干物)的培养基中，在温度28-30℃条件下搅拌通风培养50-100小时，离心除菌得含酶混合液、用60-75％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白、收集蛋白，溶于1/10发酵液体积的醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)中，透析除去硫酸铵，离心除渣，即为酶液。

b.将4克白头翁皂甙、100毫升醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)和50毫升上述酶液混合，使反应物浓度为0.01-15％，在温度为4℃条件下，反应40小时。

c.再加入1/3体积的正丁醇萃取皂甙三次，减压蒸干，得到低糖基次生皂甙粗品。

用硅胶柱分离方法(文献3)得到0.5-1.4克的纯低糖基次生皂甙。经核磁共振方法确定结构(文献4、5)，其结构是白头翁皂甙6。

实施例4：

其它同实施例3，用1克白头翁皂甙、100毫升醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)和50毫升上述酶液混合，得到0.4克纯低糖基次生皂甙两种和0.1克甙元。经核磁共振方法确定结构(文献2、3)，其结构是白头翁皂甙7和8。

上述酶液DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪(文献6)分离提纯白头翁皂甙酶蛋白，用SDS电泳方法(文献7)测定分子量，酶的分子量为5.3万。

实施例5：

a.米曲霉菌(Aspegillus oryzae)在含5％麦麸浸出物、0.2％产酶诱导物——大豆异黄酮或者芦丁，或者0.6％其来源植物的浸出物的培养基中，在温度为28-30℃搅拌通风培养50-100小时，离心除菌得含酶混合液。用60-75％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白、收集蛋白，溶于1/10发酵液体积的醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)中，透析除去硫酸按，离心除渣，即为酶液。

b.将上述酶液按实施例1的方法处理白头翁皂甙。

提纯和检测酶反应产物的结果：白头翁皂甙转化成低糖基次生皂甙的转化率为60％以上，产物主要是白头翁皂甙7和8，还有皂甙6和少量的甙元。

上述酶液经DEAE-Cellulose离子交换树脂柱方法和BioRed蛋白制备色谱仪(分离提纯白头翁皂甙酶蛋白，用SDS电泳方法测定分子量，酶的分子量为6.0万。

实施例6：

a.假丝酵母在含白头翁粉10％的麦麸培养基(干物1000克)上接种，分装在茄子瓶中，温度为30℃、培养3～6天，收集培养物加入6000毫升的生理盐水，浸泡一小时，离心取上清(含酶混合液)，加入饱和度为60～75％的硫酸铵，使酶蛋白沉淀，收集沉淀，用800毫升的pH5、0.02M醋酸钠缓冲液溶解，透析出去硫酸铵，离心除渣，即得1000毫升左右的酶液。

b.将上述酶液按实施例1的方法处理白头翁皂甙。

提纯和检测酶反应产物的结果：白头翁皂甙转化成低糖基次生皂甙的转化率为60％以上，产物主要是白头翁皂甙7和8，还有皂甙6和少量的甙元。酶的分子量为4.3万。

实施例7：担子菌

蘑菇菌(Agaricus campestris)培养在白头翁粉和稻皮各10％的麦麸培养基上、在温度25℃条件下培养6-8天，按实施例6的方法提取酶液，按实施例3的方法处理白头翁皂甙。

分离提纯和检测酶反应产物，50％的白头翁皂甙转化成低糖基皂甙，产物有白头翁皂甙5、6、7和少量甙元。

实施例中所述文献为：

1.Fengxie Jin，et al(金凤燮等)：J.Gen Appl.Bact.，1990，36，415-424.

2.Hongshan Yu，et al(鱼红山等)：J.Ginseng Res.，1999，23(10，50-54.

3.徐人生主编，天然物化学，科学出版社，1997，p17-20.

4.吴振洁等：中国药科大学学报，1991，22(5)，265-269。

5.叶文才等：中国药科大学学报，1990，21(5)，264-266)。

6.Hongshan Yu，et al(鱼红山等)：Chem.Pharm.Bull.，50(2)，175-178.

7.张龙翔等：升华实验方法和技术，高等教育出版社，1997，p100-111。