包含因子VIIα和因子XIII的药物组合物

摘要

本发明涉及因子VIIa和因子XIII在治疗或预防流血事件中的用途。

说明书

发明领域

本发明涉及包含因子VIIa和因子XIII的药物组合物。本发明还涉及因子VIIa和因子XIII的组合在生产用于治疗或预防主体发生流血事件的药物中的用途。本发明还涉及治疗主体的流血事件的方法和增强主体血块形成的方法。本发明还涉及包含这些化合物的试剂盒。

发明背景

止血(haemostasis)是由于在血管壁受到损伤后，在暴露于循环血液的组织因子(TF)与血液循环中存在的对应于约1％的总FVII蛋白质量的FVIIa之间形成复合物(complex)而启动的。这种复合物锚固在带有TF的细胞上，把细胞表面上的FX活化为FXa，把FIX活化为FIXa。FXa把凝血酶原活化为凝血酶，凝血酶使FVIII、FV、FXI和FXIII活化。而且，在止血的这个启动步骤中形成的有限数量的凝血酶还使血小板活化。在凝血酶作用于血小板上之后，血小板的形状发生改变，将带电荷的磷脂暴露在它们的表面上。这种活化后的血小板表面成为进一步活化FX和形成全部的凝血酶的模板。通过在活化的血小板表面上形成的FIXa-FVIIIa复合物，在活化的血小板表面上的FX发生进一步活化，然后FXa把凝血酶原转变为凝血酶，同时仍然位于表面上。然后凝血酶把血纤蛋白原转变为能使最初的血小板栓稳定的不溶性的血纤蛋白。把这个过程分区，即定位到TF表达或暴露的部位，从而尽可能地减小凝固体系发生系统性活化的危险。形成血栓的不溶性血纤蛋白进一步被FXIII-催化的血纤蛋白-纤维的交联所稳定。

血浆中的FVIIa主要以单链酶原的形式存在，该酶原被FXa切割成两条链—活化形式的FVIIa。已经把重组体活化因子(recombinant activatedfactor)VIIa(rFVIIa)开发成促止血剂。服用(administer)rFVIIa能在血友病主体中产生迅速并且高效的促止血反应。这些血友病主体(subject)由于抗体的形成，不能用凝血因子产品治疗流血。而且可以用FVIIa成功地治疗缺乏因子VII的流血主体或具有正常的凝血体系但是遭遇过量流血的主体。在这些研究中，还没有遇到过rFVIIa产生不良的副作用(特别是发生血栓栓塞)。

额外服用外源性的FVIIa促进了活化的血小板表面上凝血酶的形成。这发生在缺乏FIX或FVIII的血友病主体中，因此失去了凝血酶充分形成的最有力的途径。而且在较低数量的血小板或缺乏功能的血小板存在下，额外的FVIIa促进了凝血酶的形成。

FXIII—血纤蛋白稳定因子，是一种能使血纤蛋白单体交联从而使血纤蛋白结构抵抗血纤蛋白溶酶和其它蛋白水解酶溶解的能力增大的谷胺酰胺转移酶。还已知因子XIII被称为＂血纤蛋白连接酶＂和＂血纤蛋白稳定因子＂。活化后，FXIIIa能在血纤蛋白分子的侧链之间以及其它底物之间形成分子间的γ-谷氨二酰基-ε-赖氨酸交联。在血浆和血小板中发现有FXIII。在血浆中以四聚的酶原形式存在的酶由两个α-亚基和两个β-亚基组成(表示为a₂b₂)，而在血小板中以酶原形式存在的酶由两个α-亚基组成(表示为a₂-二聚体)。

这两种酶原都可以被凝血酶和Ca²⁺活化。血小板在受伤部位聚集时释放出钙。凝血酶切去1-37N-末端氨基酸残基(a₂-二聚体的)。在为a₂b₂-酶原的情况下，接下来β-亚基从活化后的α-亚基上解离下来。钙同样能与酶原和凝血酶改性的分子很好地结合。在凝血酶和钙活化后，α-链上的活性中心半胱氨酸暴露出来，形成了充分活化的酶。已经发现患有严重的血小板减少症的主体其血浆中FXIII的水平很低。

众所周知，与外科手术损伤或大的损伤有关的流血过多的需要输血的主体与没有发生任何流血的主体相比，出现了更多的并发症。然而，还有需要供给人血或血液产品(血小板、白细胞、从血浆制得的用于治疗凝血缺陷的浓缩液等)的中度失血也会产生与人类病毒(肝炎病毒、HIV病毒、细小病毒以及其它目前未知的病毒)转移的危险有关的并发症。需要大量输血的大面积失血会导致发展成许多器官衰竭，包括肺和肾功能受损。一旦主体出现了这些严重的并发症，就会启动涉及多种细胞因子和炎症反应的连锁事件的发生，使得治疗极其困难，而且不幸的是经常会不成功。因此，在外科手术和主要的组织损伤的治疗中，一个主要的目标是避免或最大限度地减少失血。

为了避免或最大限度地减少这种失血，重要的是要确保不容易被血纤蛋白溶酶溶解的稳定的固体止血栓的形成，而且重要的是要确保这种血栓或血块能够快速有效地形成。

JP2-167234A涉及一种用于生物组织的黏附剂(adhesive)，其特征在于包含血纤蛋白原、凝血酶原、血液凝固因子VII、血液凝固因子IX、血液凝固因子X、血液凝固因子XIII、抗凝血酶、蛋白酶抑制剂和钙离子。

JP 59-116213A涉及一种用作组织胶的包含一种血液凝固剂作为活性组份的气溶胶组合物。血液凝固剂可以选自血液凝固因子I、II、III、IV、V、VII、VIII、IX、X、XI、XII和XIII、激肽释放酶原、高聚物激肽原和凝血酶，优选F XIII和凝血酶的组合物。

WO 93/12813(ZymoGenetics)涉及FXIII在减少进行外科手术的主体发生外科手术失血中的用途。该组合物还包含抑肽酶。FXIII是以大丸剂注射液的形式给主体服用的，典型地是在外科手术的前一天服用。

欧洲专利225160(Novo Nordisk)涉及FVIIa的组合物和治疗不是由凝血因子缺陷或凝血因子抑制剂引起的流血症的方法。

欧洲专利82182(Baxter Travenol Lab.)涉及一种用于主体的平衡凝血因子缺乏或凝血因子抑制剂的作用的因子VIIa的组合物。

国际专利公开号WO 93/06855(Novo Nordisk)涉及FVIIa的局部应用。

Kjalke等人的Thrombosis and Haemostasis，1999(Suppl)，0951涉及在一种模拟血友病A或B的条件的模型体系中，服用额外的外源性FVIIa及其对活化的血小板表面上凝血酶形成的影响。

本领域中依然需要一种改善的可靠的并且可以广泛应用在主体，特别是凝血酶的形成受到损伤的主体中，促进凝血、快速形成稳定的止血栓(haemostatic plug)和达到完全止血的方法。还需要一种为了达到完全止血只需要低剂量的FVIIa的方法。

发明概述

本发明的一个目的是提供能有效地用于治疗或预防流血事件(bleedingepisode)和凝血症(coagulation disorder)的组合物。

本发明的第二个目的是提供能有效地用于治疗或预防流血事件或作为促凝血剂使用的单一剂型的组合物。

本发明的另一个目的是提供具有协同作用的组合物、治疗方法或试剂盒。

本发明的另外一个目的是提供没有实质性的副作用(例如高水平的凝血体系的系统性活化)的组合物、治疗方法或试剂盒。

在阅读了本发明的说明书后，本发明的其它目的将变得显而易见。

本发明人证实：与单独的因子VIIa或因子XIII相比，因子VIIa和因子XIII的组合能更有效地减少正常人血浆的凝固时间。并且还显示：与单独的因子VIIa或因子XIII相比，因子VIIa和因子XIII的组合能更有效地增大血块的牢固度(firmness)。通过把观察到的不会进一步增大血块牢固度的浓度的因子VIIa与同样是观察到的不会进一步增大血块牢固度的浓度的因子XIII组合，出人意料地显示出血块的牢固度得到了进一步的增大。此外还显示：与单独的因子VIIa或因子XIII的抑制剂相比，因子VIIa和因子XIII的组合能更有效地延长体外的正常人血浆中血块的溶解时间。因此，通过增强凝血，能使主体的流血得到更有效的治疗。而且，可以用相对较低浓度的因子VIIa来治疗病人，降低与单独使用因子VIIa进行的常规治疗有关的相对较高的费用。

在第一个方面中，本发明涉及一种包含因子VIIa和因子XIII以及选择性使用的药学上可接受的载体的药物组合物。

在另一个方面中，本发明涉及一种包含因子VIIa和因子XIII作为惟一的活性试剂以及选择性(任选)使用的药学上可接受的载体的药物组合物。

在另外一个方面中，本发明涉及一种配制成用于静脉内给药的包含因子VIIa和因子XIII以及选择性使用的药学上可接受的载体的药物组合物。

在另外一个方面中，本发明涉及一种配制成用于静脉内给药的包含因子VIIa和因子XIII作为惟一的活性试剂以及选择性使用的药学上可接受的载体的药物组合物。

在一种实施方式中，因子VIIa是重组的因子VIIa，因子XIII是重组的因子XIII。

在本发明的一种实施方式中，因子VIIa重组的因子(recombinantfactor)VIIa。在另一个实施方式中，因子VIIa是重组的人类因子(recombinanthuman factor)VIIa。在另一个实施方式中，因子VIIa是因子VIIa变体。

在一种实施方式中，因子VIIa的变体是与野生型因子VIIa(即具有US4,784,950中公开的氨基酸序列的多肽)相比，不超过20个氨基酸被替换、删去或插入的氨基酸序列变体。在另一个实施方式中，与野生型因子VIIa相比，因子VIIa的变体有不超过15个氨基酸被替换、删去或插入；在另一个实施方式中，因子VIIa的变体有不超过10个氨基酸被替换、删去或插入；在另一个实施方式中，因子VIIa的变体有不超过8个氨基酸被替换、删去或插入；在另一个实施方式中，因子VIIa的变体有不超过6个氨基酸被替换、删去或插入；在另一个实施方式中，因子VIIa的变体有不超过5个氨基酸被替换、删去或插入；在另一个实施方式中，因子VIIa的变体有不超过3个氨基酸被替换、删去或插入。在一种实施方式中，因子VIIa的变体选自[L305V]-FVIIa、[L305V/M306D/D309S]-FVIIa、[L3051]-FVIIa、[L305T]-FVIIa、[F374P]-FVIIa、[V1 58T/M298Q]-FVIIa、[V158D/E296V/M298Q]-FVIIa和[K3 37A]-FVIIa之列。

在一种实施方式中，因子XIII是FXIIIa2b2。在另一种实施方式中，因子XIII是FXIIIa2。在另一种实施方式中，因子XIII是活化的因子XIII(FXIIIa)。在一种实施方式中，因子XIII是因子XIII的变体。在一种实施方式中，因子XIII是人类因子XIII。在一种实施方式中，因子XIII是重组的因子XIII。在一种实施方式中，因子XIII是重组的人类因子XIII。在一种实施方式中，因子XIII是人类a2-二聚体。

在一个方面中，组合物还包含TFPI抑制剂。在另一个方面中，组合物还包含因子VIII。在另一个方面中，组合物还包含因子VIII和TFPI抑制剂。

在一种实施方式中，组合物还包含一种血纤蛋白溶解体系的抑制剂，例如抑肽酶、ε-氨基己酸或氨甲环酸(tranexamic acid)。

在另一个方面中，本发明涉及含有用于治疗流血事件的治疗剂的试剂盒，它包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的因子VIIa和选择性使用

  的药学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的因子XIII和选择性使用

  的药学上可接受的载体；和

c)用于容纳所说的第一和第二种剂型的容器。

在一个方面中，试剂盒包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的因子VIIa和选择性使用

  的药学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的因子XIII和选择性使用

  的药学上可接受的载体；

c)以第三种单位剂型存在的有效量的TFPI抑制剂和选择性

  使用的药学上可接受的载体；和

d)用于容纳所说的第一、第二和第三种剂型的容器。

在另一个方面中，本发明涉及含有用于治疗流血事件的治疗剂的试剂盒，它包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的因子VIIa和TFPI抑制

  剂以及选择性使用的药学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的因子XIII和选择性使用

  的药学上可接受的载体；和

c)用于容纳所说的第一和第二种剂型的容器。

在另一个方面中，本发明涉及含有用于治疗流血事件的治疗剂的试剂盒，它包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的因子VIIa和选择性使用

  的药学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的因子XIII和TFPI抑制剂

  以及选择性使用的药学上可接受的载体；和

c)用于容纳所说的第一和第二种剂型的容器。

在另一个方面中，本发明涉及含有用于治疗流血事件的治疗剂的试剂盒，它包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的因子VIIa和因子XIII

  以及选择性使用的药学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的TFPI抑制剂和选择性

  使用的药学上可接受的载体；和

c)用于容纳所说的第一和第二种剂型的容器。

在另一个方面中，本发明涉及含有用于治疗流血事件的治疗剂的试剂盒，它包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的因子VIIa和选择性使用的药

  学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的因子XIII和选择性使用的药

  学上可接受的载体；

c)以第三种单位剂型存在的有效量的因子VIII和选择性使用的药

  学上可接受的载体；

d)以第四种单位剂型存在的有效量的TFPI抑制剂和选择性使用

  的药学上可接受的载体；和

e)用于容纳所说的第一、第二、第三和第四种剂型的容器。

在另一个方面中，试剂盒包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的因子VIIa和因子XIII以及选

  择性使用的药学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的因子VIII和选择性使用的药

  学上可接受的载体；

c)以第三种单位剂型存在的有效量的TFPI抑制剂和选择性使用

  的药学上可接受的载体；和

d)用于容纳所说的第一、第二和第三种剂型的容器。

  在另一个方面中，试剂盒包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的因子VIIa和TFPI抑制剂以

  及选择性使用的药学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的因子XIII和选择性使用的药

  学上可接受的载体；

c)以第三种单位剂型存在的有效量的因子VIII和选择性使用的药

  学上可接受的载体；和

d)用于容纳所说的第一、第二和第三种剂型的容器。

在另一个方面中，本发明涉及含有用于治疗流血事件的治疗剂的试剂盒，它包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的因子VIIa和因子VIII以及选

  择性使用的药学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的因子XIII和选择性使用的药

  学上可接受的载体；

c)以第二种单位剂型存在的有效量的TFPI抑制剂和选择性使用

  的药学上可接受的载体；和

d)用于容纳所说的第一、第二和第三种剂型的容器。

在另一个方面中，本发明涉及含有用于治疗流血事件的治疗剂的试剂盒，它包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的因子VIIa和因子XIII以及选

  择性使用的药学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的因子VIII和TFPI抑制剂以

  及选择性使用的药学上可接受的载体；和

c)用于容纳所说的第一和第二种剂型的容器。

在另一个方面中，本发明涉及含有用于治疗流血事件的治疗剂的试剂盒，它包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的因子VIII和因子XIII以及选

  择性使用的药学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的TFPI抑制剂和选择性使用

  的药学上可接受的载体；

c)以第二种单位剂型存在的有效量的因子VIIa和选择性使用的药

  学上可接受的载体；和

d)用于容纳所说的第一、第二和第三种剂型的容器。

在另一个方面中，本发明涉及含有用于治疗流血事件的治疗剂的试剂盒，它包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的因子XIII和TFPI抑制剂以

  及选择性使用的药学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的因子VIII和选择性使用的药

  学上可接受的载体；

e)以第二种单位剂型存在的有效量的因子VIIa和选择性使用的药

  学上可接受的载体；和

c)用于容纳所说的第一、第二和第三种剂型的容器。

在另一个方面中，本发明涉及含有用于治疗流血事件的治疗剂的试剂盒，它包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的TFPI抑制剂和因子VIII以

  及选择性使用的药学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的因子VIIa和选择性使用的药

  学上可接受的载体；

f)以第二种单位剂型存在的有效量的因子XIII和选择性使用的药

  学上可接受的载体；和

c)用于容纳所说的第一、第二和第三种剂型的容器。

在另一个方面中，本发明涉及含有用于治疗流血事件的治疗剂的试剂盒，它包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的TFPI抑制剂和因子XIII以

  及选择性使用的药学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的因子VIII和因子VIIa以及选

  择性使用的药学上可接受的载体；和

c)用于容纳所说的第一和第二种剂型的容器。

在另一个方面中，本发明涉及含有用于治疗流血事件的治疗剂的试剂盒，它包含：

a)以第一种单位剂型存在的有效量的因子VIIa和TFPI抑制剂以

  及选择性使用的药学上可接受的载体；

b)以第二种单位剂型存在的有效量的因子VIII和因子XIII以及选

  择性使用的药学上可接受的载体；和

c)用于容纳所说的第一和第二种剂型的容器。

在另一个方面中，本发明涉及因子VIIa和因子XIII的组合在生产用于治疗流血事件的药物中的用途。

在另一个方面中，本发明涉及因子VIIa和因子XIII的组合在生产用于减少主体的凝血时间的药物中的用途。

在另一个方面中，本发明涉及因子VIIa和因子XIII的组合在生产用于延长哺乳动物血浆中血块的溶解时间的药物中的用途。

在另一个方面中，本发明涉及因子VIIa和因子XIII的组合在生产用于增大哺乳动物血浆中血块的强度的药物中的用途。

在另一个方面中，本发明涉及用途因子VIIa和因子XIII的组合在生产用于增强哺乳动物血浆中血纤蛋白凝块的形成的药物中的用途。

在一种实施方式中，哺乳动物血浆是人血浆。在另一种实施方式中，哺乳动物血浆是正常的血浆；在另一种实施方式中，血浆是正常人的血浆；在一种实施方式中，血浆是从凝血酶的产生受到减损(impaired thrombingeneration)的主体得到的。在一种实施方式中，血浆是来自具有较低的血纤蛋白原水平的主体。

在一种实施方式中，因子VIIa和因子XIII延长了体外的正常人血浆中血块的溶解时间。

在另一个方面中，本发明涉及一种增强主体的血纤蛋白凝块形成的方法，包括给主体服用有效量的因子VIIa和有效量的因子XIII的组合。

在另一个方面中，本发明涉及一种治疗主体的流血事件的方法，包括给主体服用有效量的因子VIIa和有效量的因子XIII的组合。

在另一个方面中，本发明涉及一种减少哺乳动物血浆的凝血时间的方法，包括使血浆与有效量的因子VIIa和有效量的因子XIII的组合接触。在一种实施方式中，给需要这种治疗的主体服用有效量的因子VIIa和有效量的因子XIII的组合(combination)。

在另一个方面中，本发明涉及一种增强主体的血纤蛋白形成的方法，包括给主体服用有效量的因子VIIa和有效量的因子XIII的组合。

在本发明方法的一种实施方式中，因子VIIa和因子XIII是给主体服用的惟一的活性试剂。在本发明的另一种实施方式中，药物组合物包含因子VIIa和因子XIII作为惟一的活性试剂。

在本发明的一种实施方式中，因子VIIa和因子XIII是以一剂形式(one-dosage form)同时被服用的。在另一种实施方式中，因子VIIa和因子XIII是被顺序服用的。在另外一种实施方式中，因子VIIa和因子XIII是在彼此间隔大约1-2小时的时间内，例如30分钟的时间内，例如10分钟的时间内，例如以包含第一种单位剂型的因子VIIa和第二种单位剂型的因子XIII的试剂盒形式被服用的。

在一种实施方式中，有效量的因子VIIa为0.05mg/天至500mg/天(70-kg的主体)。在一种实施方式中，有效量的因子XIII为0.05mg/天至500mg/天(70-kg的主体)。

在本发明的一种实施方式中，药物组合物(单制剂形式时)基本上是由因子VIIa和因子XIII以及至少选择性使用的药学上可接受的赋形剂或载体，和/或稳定剂，和/或去污剂(detergent)，和/或中性盐，和/或抗氧化剂，和/或防腐剂，和/或蛋白酶抑制剂组成。

在本发明的另一种实施方式中，药物组合物(单制剂形式的)基本上是由因子VIIa和因子XIII以及至少选择性使用的药学上可接受的赋形剂或载体，和/或稳定剂，和/或去污剂，和/或中性盐，和/或抗氧化剂，和/或防腐剂，和/或蛋白酶抑制剂，和/或TFPI抑制剂组成。

在本发明的另一种实施方式中，药物组合物(单制剂形式时)基本上是由因子VIIa和因子XIII以及至少选择性使用的药学上可接受的赋形剂或载体，和/或稳定剂，和/或去污剂，和/或中性盐，和/或抗氧化剂，和/或防腐剂，和/或蛋白酶抑制剂，和/或TFPI抑制剂，和/或因子VIII组成。

在本发明的另一种实施方式中，药物组合物(试剂盒形式时)由基本上是由因子VIIa和至少选择性使用的药学上可接受的赋形剂或载体，和/或稳定剂，和/或去污剂，和/或中性盐，和/或抗氧化剂，和/或防腐剂，和/或蛋白酶抑制剂构成的第一种单位剂型；和主要由因子XIII和至少选择性使用的药学上可接受的赋形剂或载体，和/或稳定剂，和/或去污剂，和/或中性盐，和/或抗氧化剂，和/或防腐剂，和/或蛋白酶抑制剂构成的第二种单位剂型组成。

在本发明的另一种实施方式中，药物组合物(试剂盒形式时)由基本上是由因子VIIa和至少选择性使用的药学上可接受的赋形剂或载体，和/或稳定剂，和/或去污剂，和/或中性盐，和/或抗氧化剂，和/或防腐剂，和/或蛋白酶抑制剂，和/或TFPI抑制剂构成的第一种单位剂型；和基本上是由因子XIII和至少选择性使用的药学上可接受的赋形剂或载体，和/或稳定剂，和/或去污剂，和/或中性盐，和/或抗氧化剂，和/或防腐剂，和/或蛋白酶抑制剂，和/或TFPI抑制剂，和/或因子VIII构成的第二种单位剂型组成。

在另一种实施方式中，主体是人；在另外一种实施方式中，主体的凝血酶产生受到减损；在一种实施方式中，主体血浆中的血纤蛋白原的浓度降低(例如多次输血的主体)。

在本发明的另一个方面中，组合物还包含因子VIII。在一种实施方式中，因子VIII是一种活化的因子VIII(因子VIIIa)。在另外一种实施方式中，因子VIII是一种重组的因子VIIIa。在另一种实施方式中，因子VIII是重组的人类因子VIIIa。

在另一个方面中，组合物还包含一种血纤蛋白溶解体系的抑制剂，例如抑肽酶、ε-氨基己酸或氨甲环酸。

附图列示

图1显示在微量滴定孔中，在用含有20nM Hepes、150mM NaCl和5mM CaCl₂，pH7.4的缓冲液把含有柠檬酸盐的正常人血浆(NHP)中稀释到1/10(总体积为250μl)，在大约2500-3000秒时得到的血块的自发性形成。通过在一台Specramax^TM 340(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)中在600nm处光密度的增大来监测血纤蛋白凝块的形成。图1显示10nM从NovoNordisk A/S Bagsvaerd，Denmark得到的重组因子VIIa(rFVIIa)把凝血时间缩短到1600秒(n＝2)。当把30nM从American Diagnosticainc，Greenwich，CT得到的因子XIII(FXIII)与10nM rFVIIa(n＝3)一起加入时，凝血时间得到了进一步的缩短。在FXIII存在下形成的凝块比没有FXIII存在时形成的凝块更透明(更低的最大OD)，表明加入FXIII产生了含有更薄纤维的网眼更细的血纤蛋白凝胶结构。

图2显示添加FXIII(30nM)延长了在rFVIIa和组织纤溶酶原活化剂(tPA)存在下形成的凝块的血纤蛋白凝块的溶解时间。在有或没有30nM XIII存在下，通过向225μl含有从Novo Nordisk A/S Bagsvserd，Denmark得到的50nM rFVIIa和0.5nM重组tPA的20nM Hepes，150mM NaCl，5mM CaCl₂，pH7.4中加入25μl NHP来诱发血块的形成。通过一台Spectramax_340在600nm处以OD_600nm的增大以及之后轨迹向基线的返回来监测血块的形成以及之后由tPA-介导的纤溶酶原活化所诱发的血块溶解。图2显示，在这些条件下，由于FXIII的存在，血块的溶解时间被明显地延长了。

图3显示rFVIIa和FXIII对最大的血块牢固度(MCF)和血块对t-PA介导的溶解的抵抗力的影响。在加入rFVIIa和/或FXIII之前得到的MCF是25mm，溶解一半的血块所需要的时间为12.3分钟(图3)。加入逐渐增大的浓度的FXIII(0-40nM)没有改变MCF；然而，观察到溶解一半血块的时间随剂量而延长，最佳在30nM FXIII时(溶解一半血块的时间：14.3分钟，图3)。同样地，加入rFVIIa(1nM)导致对血块的保护，使其免受t-PA-介导的血纤蛋白溶解(溶解一半血块的时间：16.4分钟)，而对MCF没有任何影响(图3)。然而，在一起加入rFVIIa(1nM)和FXIII(30nM)时，观察到MCF的增大(29mm)以及深度的免受血纤蛋白溶解的保护作用(溶解一半血块的时间：27.1分钟)(图3)。这些结果综合起来证明，向血浆中加入rFVIIa和FXIII，以协同方式改善了机械强度和对t-PA-介导的血纤蛋白溶解的抵抗力。

发明详述

本发明提供包含因子VIIa和因子XIII的组合的组合物。本发明还提供包含因子VIIa和因子XIII的组合作为惟一的活性组份的组合物。组合物可以是单一的组合物形式或者可以是多组份的试剂盒形式。本发明的组合物可用作具有治疗和预防作用的促凝血剂和血纤蛋白凝块的稳定剂，并且能快速地在哺乳动物包括灵长类例如人类中形成血纤蛋白凝块。

无论何时，本说明书中提到的第一或第二或第三种单剂量都不指示优选的给药顺序，而仅仅是为了方便。

本发明还提供一种治疗(包括预防性治疗或预防)主体包括人类的流血事件(例如由创伤或外科手术引起的流血事件)或者缺乏或带有缺陷型血液凝固因子FIX或FVIII或血小板的主体的方法。

现在已经发现，因子VIIa和因子XIII的组合是一种具有优势的产品，能确保固体的、稳定的止血栓的快速形成。

凝血酶的充分形成对于固体的、稳定的止血栓的形成是必要的。这种止血栓的血纤蛋白结构既依赖于形成的凝血酶的数量，也依赖于最初的凝血酶的形成速率。当凝血酶的产生存在减损时，就形成了具有高渗透性的多孔的血纤蛋白栓。通常存在于血纤蛋白表面上的血纤蛋白溶解酶易于溶解这种血纤蛋白栓。稳定的血纤蛋白栓的形成还取决于因子XIIIa的存在，该因子能被凝血酶活化并因此也取决于充足的凝血酶的生成。而且，近来所述的凝血酶活化的血纤蛋白溶解抑制剂TAFI的活化需要有相当高数量的凝血酶。因此，在没有充足的凝血酶形成的情况下，TAFI不会被活化而导致止血栓的形成，这比通常情况下更容易被正常的血纤蛋白溶解活性所溶解。

通过增加凝血酶的产生，因子VIIa为充分活化因子XIII提供了基础，而因子XIII的充分活化对于形成充分稳定的止血栓从而保持止血是至关重要的。在血小板数量较低、血小板数量减少的情况下，通过服用额外的外源性因子VIIa可以加快凝血酶的生产。但是，总的凝血酶的产生与因子VIIa不是标准化的(normalized)，即使在因子VIIa浓度很高的情况下也是如此。

通过把因子VIIa和因子XIII，特别是因子XIII的α-链(a2-二聚体)组合使用，有利于因子XIII的充分活化，增强了因子VIIa的止血作用。

而且，对于血浆中血纤蛋白原的浓度较低的主体(由于多次创伤或大面积外科手术而导致的多次输血的主体)，不会发生因子XIII的充分活化。通过服用因子VIIa和因子XIII的组合，可以达到更为有效的的止血。

增大血纤蛋白止血栓的稳定性的另一种方法是确保有充足的因子XIIIa(活化的因子XIII)存在。

患有血小板减少症的主体其凝血酶的生产受到减损，并且血纤蛋白栓的稳定作用有缺陷，导致止血栓倾向于在成熟前溶解。而且受到大的创伤或器官损伤影响的主体以及由此导致的频繁输血的主体其血小板的数量以及血纤蛋白原、因子VIII和其它凝血蛋白的水平常常较低。这些主体就会出现凝血酶的产生受损(或降低)。另外，主体的较低的血纤蛋白原水平又对因子XIII的活化产生负面影响。因此，这些主体具有缺陷型或不太有效的形成血纤蛋白栓的止血机制，纤维蛋白酶易于在成熟前被蛋白溶解酶溶解，在以大面积创伤和器官损伤为特征的部位也大量地释放这种溶解酶。

为了便于在主体中形成充分稳定的足够数量的血栓以维持止血，服用了本发明的组合物。该组合物对血小板数量较低的主体和血浆中血纤蛋白原和/或其它凝血蛋白的水平较低的主体是特别有利的。

在因子XIII的存在下，较低浓度的因子VIIa可以足以保证充分的止血。

如上所述，因子XIII以四聚体的酶原形式存在于血浆中，四聚体的酶原由两个α-亚基和两个β-亚基构成(表示为a2b2)，但是发现它在其它组织(例如血小板)中以a2-二聚体形式存在。无论是这些酶原形式，还是活化的因子XIII(因子XIIIa)以及保留了其特征性的交联活性的因子XIII的基因工程变体都可以用在本发明中。在一种实施方式中，因子XIII是人类因子XIII；在另一种实施方式中，因子XIII是人类的a2-二聚体；在另外一种实施方式中，因子XIII是活化的人类因子XIIIa。

本发明中所用的因子XIII和因子VIIa可以从血液中纯化而得到或者通过重组方法生产。很显然，实施本发明的方法不依赖于纯化的因子XIII和因子VIIa是怎么得到的，因此，考虑把本发明覆盖到适用于本发明的因子XIII和因子VIIa的任何制剂的用途。优选人类因子VIIa和人类因子XIII。保留了其特征性的与止血有关的活性的因子VIIa和因子XIII的基因工程变体也可以用于本发明中。保留了其特征性的与止血有关的活性的因子VIIa或因子VIIa-或因子XIII变体的片断也可以用在本发明中。因子VIIa的与止血有关的活性例如可以使用本发明的说明书中描述的因子VIIa活性试验进行测定。因子XIII的与止血有关的活性例如可以使用本发明的说明书中描述的因子XIII活性试验进行测定。

基本上具有与野生型因子VIIa相同或更好的生物学活性的因子VII的变体的非限定性的例子包括但是不限于丹麦专利申请号PA2000 00734、PA2000 01360、PA2000 01361和PA2001 00477中所说的那些。非限定性的例子包括[L305V]-FVIIa、[L305V/M306D/D309S]-FVIIa、[L3051]-FVIIa、[L305T]-FVIIa、[F374P]-FVIIa、[V158T/M298Q]-FVIIa、[V158D/E296V/M298Q]-FVIIa和[K337A]-FVIIa。

在本发明的上下文中，以其常规意义使用了代表氨基酸的三-字母或单-字母符号，如表1中所示。除非清楚地说明，这里提到的氨基酸是L-氨基酸。应当明白，第一个字母，例如K337的中的第一个字母代表天然存在于野生型因子VII的所示位置的氨基酸，并且，例如[K337A]-FVIIa表示FVII-变体，其中单-字母码K所代表的天然存在于所示位置的氨基酸被单-字母码A所代表的氨基酸替换。

表1：氨基酸的缩写：

    氨基酸    三-字母码    单-字母码    甘氨酸    脯氨酸    丙氨酸    缬氨酸    亮氨酸    异亮氨酸    蛋氨酸    半胱氨酸    苯丙氨酸    酪氨酸    色氨酸    组氨酸    赖氨酸    精氨酸    谷胺酰胺    天门冬酰胺    Gly    Pro    Ala    Val    Leu    Ile    Met    Cys    Phe    Tyr    Trp    His    Lys    Arg    Gln    Asn    G    P    A    V    I    L    M    C    F    Y    W    H    K    R    Q    N    谷氨酸    天门冬氨酸    Glu    Asp    E    D

术语＂因子VIIa＂或＂FVIIa＂可以相互交换使用。术语因子VIIa包括酶原因子VII(单链因子VII)。术语＂因子XIII＂或＂FXIII＂可以相互交换使用。术语＂因子VIII＂或＂FVIII＂可以相互交换使用。

很显然，对于本领域技术人员来说，可以在对于因子VIIa或因子XIII-分子的功能关键的区域外围进行替换，并且依然会得到具有活性的多肽。因此，对于因子VIIa或因子XIII-多肽来说必要的氨基酸残基并因此不经替换的氨基酸残基，可以按照本领域中已知的方法，例如点突变(site-directedmutagensis)或丙氨酸扫描突变(参见例如Cunningham and Wells，1989，Science 244：1081-1085)，把这些氨基酸鉴别出来。在后一种技术中，在分子的每一个带正电荷的残基上引入突变，把所得的突变体分子作为凝血剂进行试验，分别试验交联活性以鉴别对分子的活性的至关重要的氨基酸残基。还可以通过诸如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术测得的三维结构进行分析，测定底物-酶的相互作用位点(参见例如de Vos et al.，1992，Science 255：306 312；Smith et al.，1992，Journal of Molecular Biology224：899-904；Wlodaver et al.，1992，FEBS Letters 309：59-64)。

把突变引入核酸序列中，把一种核苷酸(nucleotide)换成另一种核苷酸可以通过点突变，使用本领域中已知的任何方法完成。特别有用的是使用超螺旋化的带有感兴趣的插入子的双股DNA载体和带有所要的突变子的两个合成引物。通过Pfu DNA聚合酶，各自与载体的相对链互补的核苷酸引物在温度循环期间扩展。加入引物后，产生一种含有错开的缺口的变异的质粒。在温度循环之后，用专用于把DNA甲基化和半甲基化的Dpnl处理产物以消解母体DNA模板，并且为含有突变的合成的DNA进行选择。还可以使用本领域已知的用于产生、鉴别和分离变异体的其它方法，例如基因改组或噬菌体展示技术。

术语＂因子VIII＂或＂FVIII＂包括活化的因子VIII(表示为因子VIIIa)、保留了其特征性的凝血活性的因子VIII的变体和截短体。在一种实施方式中，因子VIII是人类因子VIII。

术语＂TFPI抑制剂＂是指能够抑制TFPI(组织因子途径抑制剂)的抗凝血活性的化合物。该术语包括EP558 529、WO 96/28153和US5,622,988中所公开的化合物。＂TFPI＂和＂EPI＂(外部途径抑制剂)可以相互交换使用。

在本发明中，＂有效量＂的因子VIIa和＂有效量＂的因子XIII被定义为足以预防或减少流血或失血以便治愈、减轻或部分抑制疾病及其并发症的因子VIIa和因子XIII的数量。

根据本发明，服用的因子VIIa的数量和因子XIII的数量可以在大约1∶100至大约100∶1(μg因子VIIa∶μg因子XIII)的比例范围内变化。

在上下文中，＂凝血酶生产受到减损的主体＂是指不能在活化的血小板表面上产生充足的凝血酶爆发的主体，包括那些凝血酶的生产比具有全部功能的正常止血体系(包括正常数量和功能的凝血因子、血小板和血纤蛋白原)的主体少的主体，包括缺乏FIX和/或FVIII(血友病A和B)或具有缺陷型FIX和/或FVIII或具有抗FIX和/或FVIII的抑制剂的主体；缺乏FXI的主体；血小板数量较低或血小板功能有缺陷的主体(例如血小板减少或Glanzmann血小板功能不全或流血过多的主体)；以及凝血酶原、FX或FVII的水平较低的主体。

血浆中血纤蛋白原的浓度较低的主体(例如因多次创伤或大面积外科手术而而多次输血的主体)还遭受血形成的纤蛋白栓更为疏松和不稳定易于被溶解的痛苦。

术语＂充足的止血作用＂是指在受伤的部位形成一种稳定的固体血纤蛋白凝块或栓，能有效地阻止流血并且不易被血纤蛋白溶解体系溶解。

术语＂因子VIIa的活性＂或＂因子VIIa-活性＂是指产生凝血酶的能力；该术语还包括在没有组织因子的存在下，在活化的血小板表面上产生凝血酶的能力。

术语＂正常的止血体系的增强＂是指产生凝血酶的能力的增强。

这里所用的术语＂流血症(bleeding disorder)＂反映了在流血中显示出来的源于细胞或分子的任何缺陷型(defect)、先天性(congenital)、获得性(acquired)或诱导性(induced)缺陷，例如凝血因子缺陷(例如血友病A和B或缺乏凝血因子XI或VII)、凝血因子抑制剂，血小板功能缺陷、血小板减少或vonWillebrand病。

术语＂流血事件＂的意思包括作为与外科手术和其它形式的组织损伤有关的大问题的无节制的过多的流血。无节制的过多的流血可以发生在基本上具有正常的凝血体系的主体(然而由于流血，这些主体会发展出凝血途径—由于流血的稀释效果，凝血蛋白被稀释，血纤蛋白溶解增大，血小板减少)和具有凝血或流血症的主体中。凝血因子缺乏(血友病A和B，凝固因子XI或VII缺乏)或凝血因子抑制剂可能是流血症的病因。过多流血还发生在具有正常功能的凝血爆发(不缺乏凝血因子或没有抗凝血因子的抑制剂)的主体中，并且可以由血小板功能缺陷、血小板减少或von Willebrand症引起。在这样的情况下，流血或许与由血友病引起的流血类似，因为缺乏止血体系(例如在血友病中)或者具有能引起大的流血的不正常的必要的凝血＂化合物＂(例如血小板或von Willebrand因子蛋白)。  在发生了与外科手术或大的创伤有关的大面积组织损伤的主体中，正常的止血机制可以被瞬时的止血要求所淹没，虽然有基本上(创伤前)正常的止血机制，也会发展成流血。当流血发生在通过外科手术止血的可能性有限的器官，例如大脑、内耳区域和眼睛中时，要取得满意的止血还是一个问题。同样的问题会在对各种器官(肝、肺、肿瘤组织、胃肠道)的活组织检查的过程中以及腹腔镜外科手术中出现。所有这些情况的共同点是难以通过外科手术技术(缝合、夹等)来提供止血，当流血是扩散性的(出血性胃炎和大量的子宫出血)时也是这样。急性的大量出血还可以发生在正在进行抗凝血治疗的主体中，其中由所说的抗凝血治疗诱发了止血缺陷。当抗凝血作用需要被迅速抵销时，这样的主体或许需要外科手术的介入。根本的耻骨后前列腺切除术是一种通常对患有局部前列腺癌症的主体进行的一种操作。手术经常并发显著的有时是大量的失血。在进行前列腺切除术期间发生的相当多的失血主要与牵扯的解剖位置和外科手术止血不容易达到的血管分布密集的各种位点有关，它们会导致大面积的弥散性出血。另一种可能会在不满意的止血情况下发生的情况是在对具有正常的止血机制的主体进行抗凝血治疗以预防血栓栓塞病时。这样的治疗可以包括肝素、其它形式的蛋白多糖、丙酮苄羟香豆素或其它形式的维生素K-拮抗剂以及阿斯匹林和其它血小板聚集抑制剂。

在本发明的一种实施方式中，流血与血友病有关。在另一种实施方式中，流血与抑制剂引起的获得性血友病有关。在另一种实施方式中，流血与血小板减少有关。在另一种实施方式中，流血与von Willebrand症有关。在另一种实施方式中，流血与严重的组织损伤有关。在另一种实施方式中，流血与严重的创伤有关。在另一种实施方式中，流血与外科手术有关。在另一种实施方式中，流血与腹腔镜手术有关。在另一种实施方式中，流血与出血性胃炎有关。在另一种实施方式中，流血是弥散性的子宫出血。在另一种实施方式中，流血发生在具有有限的止血机制可能性的器官中。在另一种实施方式中，流血发生在大脑、内耳部位或眼睛。在另一种实施方式中，流血与进行活组织检查的方法有关。在另一种实施方式中，流血与抗凝血治疗有关。

本发明的组合物还可以包含TFPI-抑制剂。这样的组合物应当优选给患有血友病A或B的主体服用。

本发明的组合物患有包含因子VIII。这样的组合物应当优选给没有因子VIII的抑制剂的主体服用。

在本发明的上下文中，术语＂治疗＂的意思既包括预防预期的流血，例如外科手术中的流血，也包括调节已经发生的流血，例如血友病中或创伤中的流血，目的是抑制或尽可能地减少流血。因此，预防性的服用因子VIIa和因子XIII也被包括在术语＂治疗＂中。

这里所用的术语＂主体(subject)＂是指任何动物，特别是哺乳动物，例如人类，并且在合适的情况下可以与术语＂病人＂互换使用。

缩写：

TF：组织因子

FVII：单链的未活化形式的因子VII

FVIIa：活化形式的因子VII

rFVIIa：活化形式的重组因子VII

FXIII：未活化的酶原形式的因子XIII

FXIIIa：活化形式的因子XIII

rFXIII：重组的FXIII

rFXIIIa：重组的FXIIa

a2：FXIII或rFXIII的α-链或a-链

b2：FXIII或rFXIII的β-链或b-链

FXIIIa2：含有两个a-链的二聚体形式的FXIII

FXIIIa2b2：含有两个a-链和两个b-链的四聚体形式的FXIII

FVIII：未活化的酶原形式的因子VIII

rFVIII：重组的FVIII

FVIIIa：活化形式的因子VIII

rFVIIIa：重组的FVIIIa

TFPI：组织因子途径抑制剂

化合物的制备

适用于本发明的纯化的人类因子VIIa优选通过DNA重组技术制备，例如按照Hagen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：2412-2416，1986中所述的方法或者按照EP 200,421(ZymoGenetics，Inc.)中所述的方法制备。通过重组技术生产的因子VIIa可以是可靠的因子VIIa或被或多或少修饰的因子VIIa，只要是这样的因子VIIa基本上具有与可靠的因子VIIa(野生型因子VIIa)同样的凝血方面的生物学活性。可以通过已知的手段例如点特异性突变，改变给天然的因子VII编码的核酸中的氨基酸密码子或者删去一些氨基酸密码子来对给野生型因子VII编码的核酸序列进行修饰，可以生产这种的经过修饰的因子VIIa。

因子VII还可以通过Broze and Majerus，J.Biol.Chem.255(4)：1242-1247，1980和Hedner and Kisiel，J.Clin.Invest.71：1836-1841，1983中描述的方法生产。这些方法生产出不含可检测数量的其它凝血因子的因子VII。甚至还有一种纯化的因子VIII的制剂可以通过另外加入凝胶过滤作为最后的纯化步骤而得到。然后通过已知方法，例如通过几种不同的血浆蛋白，如因子Xlla、IXa或Xa，把因子VII转变为活化的因子VIIa。另外，如Bjoem et al.(Research Disclosure，269 September 1986，pp.564-565)中所述，通过使因子VII一种离子交换色谱柱，例如Mono Q_(Pharmacia fineChemicals)等，可以把它活化。

本发明中使用的因子XIII可以按照已知方法，例如Cooke and Holbrook(Biochem.J.141：79-84，1974)和Curtis and Lorand(Methods Enzymol.45：177-191，1976)中公开的方法(在此通过参考文献引入)，从血浆制得。因子XIII的a2-二聚体形式可以按照美国专利号3,904,751、3,931,399、4,597,899和4,285,933中公开的方法(在此通过参考文献引入)，从胎盘制得。然而，为了避免使用具有传染疾病危险的从血液或组织得到的产品，优选使用重组的因子XIII。在本领域中，制备重组的因子XIII的方法是已知的，参见例如Davie et al.，EP 268,772、Grundmann et al.，AU-A-69896/87、Bishop et al.，Biochemistry 1990，29：1861-1869、Board et al.，Thromb.Haemost.1990，63：235-240、Jagadeeswaran et al.，Gene 1990，86：279-283和Broeker etal.，FEBS Lett.1989，248：105-110，在此通过参考文献全部引入。在一种实施方式中，因子XIII的a2二聚体是按照同时待审的美国专利申请号07/741,263(在此通过参考文献全文引入)中公开的方法，从酿酒酵母的胞浆制得的。捕获细胞并且进行溶解，制备澄清的溶菌液。通过阴离子交换色谱，在中性至微碱性的pH下，使用衍生的琼脂糖(例如DEAE Fast-Flow Sepharose.TM.(Pharmacia)等)柱对溶菌液进行层析。然后通过浓缩洗脱液并且把pH调节到5.2-5.5(例如通过对丁二酸铵缓冲液进行膜渗滤)，把因子XIII从色谱柱的洗脱液中沉淀出来。然后把沉淀溶解，使用常规的色谱技术例如凝胶过滤和疏水性的相互作用色谱进行进一步纯化。

本领域技术人员将会领会到，为了减少诱发免疫反应的危险，优选给主体使用具有协同作用的蛋白质因子XIII和因子VIIa。非人类因子XIII的制剂及其表征已经被Nakamura et al.(J.Biochem.78：1247-1266，1975)所公开。本发明还包括这样的蛋白质因子XIII和因子VIIa在兽医中的用途。

给药和药物组合物

用于与有目的的插入有关的治疗时，典型地在进行插入前大约24小时以内服用因子VII和因子XIII，之后服药7天或更长的时间。可以采用本发明中所用的多种途径来服用凝血剂。

根据主体的体重、病情和病情的严重程度的不同，因子VII的剂量范围为从大约0.05mg至大约500mg/天，例如对于一个70kg的主体，作为负载和维持剂量，剂量为从大约1mg至大约200mg/天，或者例如从大约10mg至大约175mg/天。

根据主体的体重、病情和病情的严重程度的不同，因子XIII的剂量范围大约为0.05mg-500mg/天，例如对于一个70kg的主体，作为负载和维持剂量，剂量为从大约1mg至大约200mg/天，或者例如从大约10mg至大约175mg/天。

本发明的组合物和试剂盒可用于人医和兽医中，例如用于治疗或预防发生流血事件或患有凝血症的主体。为了用于本发明中，把因子VIIa和因子XIII配制成制剂，选择性地使用药学上可接受的载体配制成制剂。优选地，通过非肠胃给药方式，即静脉内给药、皮下给药或肌肉内给药或者通过连续的或搏动的灌注(pulsatile infusion)发生服用药物组合物。

制剂还可以包含一种或多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲剂、赋形剂等，并且可以被制成液体制剂、粉剂、乳液、控制释放的制剂等。本领域技术人员可以以合适的方式，按照已经被认可的操作方式，例如按照Remington′s Pharmaceutical Sciences，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，1990中公开的方法配制本发明的组合物。用于非肠胃给药的组合物包含因子VII和因子XIII的组合，优选这些因子溶于药学上可接受的载体，优选一种水性载体中。可以使用多种水性载体，例如水、缓冲水溶液、0.4％的盐水、0.3％甘氨酸等。还可以把本发明的因子VII的变体配制成脂质体制剂，用于向受伤部位输送或定位。在例如US4,837,028、US4,501,728和US4,975,282中对脂质体制剂作了一般性的描述。

可以配制静脉灌注用的药物组合物使其包含250ml无菌的格林溶液和10mg因子VIIa和/或因子XIII。制备非肠胃给药用的组合物的实际方法将是已知的或者对于本领域技术人员来说是显而易见的，更详细地描述在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA(1990)中。

简言之，适用于本发明的药物组合物是通过把因子VIIa或因子XIII或因子VIIa与因子XIII(优选是纯化形式的)的组合与合适的助剂和合适的载体或稀释剂混合而制得的。合适的生理上可以接受的载体或稀释剂包括无菌的水和盐水。组合物可以包含药学上可接受的助剂以接近生理条件，例如调节pH的试剂和缓冲剂、调节渗透性的试剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。合适的助剂还包括能够稳定纯化的因子VIIa和/或因子XIII的钙、蛋白质(例如白蛋白)或其它惰性的多肽(例如双甘氨肽)或氨基酸(例如甘氨酸或组氨酸)。其它生理上可以接受的助剂有非还原性的糖、多元醇(例如山梨醇、甘露醇或甘油)、多糖(例如低分子量的环糊精)、去污剂(例如山梨醇酯)和抗氧化剂(例如亚硫酸氢盐和抗坏血酸)。助剂的浓度一般为0.001-4％w/v。药物组合物还可以包含蛋白酶抑制剂例如抑肽酶或氨甲环酸和防腐剂。而且，制剂还可以包含TFPI-抑制剂和/或因子VIII。

可以常规的众所周知的灭菌技术给组合物灭菌。可以在无菌条件下把所得的水溶液包装备用或者过滤，并且冷冻干燥，在给药前把冷冻干燥后的制剂与无菌的水溶液混合。

在这些制剂中，因子VIIa、因子XIII或因子VIIa与因子XIII的组合的浓度可以在很宽的范围内变化，即从低于大约0.5％重量，通常为或至少为大约1％重至高达15或20％重量，并且将主要根据液体的体积、黏度等，按照具体选定的给药方式进行选择。

优选通过注射或灌注，特别是注射方式给药。因此，把因子VIIa和因子XIII配制成适合静脉内给药的制剂，例如是同时含有因子VIIa和因子XIII的一种剂型的溶解的冷冻干燥粉末或液体制剂，或者是含有因子VIIa的一种剂型的溶解的冷冻干燥粉末或液体制剂和含有因子XIII的另一种剂型的溶解的冷冻干燥粉末或液体制剂。

局部输送因子VIIa和因子XIII，例如局部服用可以通过例如喷洒、灌注、双气球导管(double balloon catheter)、印模膏(stent)、插入血管的移植片或印模膏、用于给气球导管包衣的水凝胶或其它熟知的方法。用于要求日常维护水平的急救主体时，可以通过使用便携式泵体系来连续地灌注因子VIIa和因子XIII。在任何情况下，药物组合物都应当能提供一定量的足以有效地治疗主体的因子VIIa和因子XIII。

因子VIIa和因子XIII的组合在体外的血块牢固度试验和血纤蛋白溶解试验中表现出了协同作用，而且，因子VIIa和因子XIII的组合在形成稳定的血纤蛋白血块、增大血块的半溶解时间、增大血块的强度和增大对血纤蛋白溶解的抵抗力方面都表现出了协同作用。

可以服用含有因子VIIa和因子XIII的组合来进行预防和/或治疗。在治疗应用中，给患有上述疾病的主体服用一定量的足以治愈、减轻或部分控制疾病及其并发症的组合物。把足以实现这个目的的数量定义为＂有效量＂或＂治疗有效量＂。本领域技术人员将会明白，达到这个目的的有效量将取决于疾病或损伤的严重程度以及主体的重量和总的状况。必须牢记，本发明的物质一般可用于严重的疾病或损伤状况，即威胁生命或可能威胁生命的情况。在这样的情况下，考虑到要最大限度地减少外来物质和人类身体中一般缺乏因子VIIa和因子XIII的免疫原性，通过实施治疗的医生服用相当过量的这些组合物是可能的，并且也感到有必要。

在预防性应用中，给易感主体或其它处于病态或受伤成胁下的主体服用含有因子VIIa和因子XIII的组合物来增强主体自身的凝血能力，把这样的数量定义为“有效预防的剂量”。

单次或多次服用组合物的剂量水平和模式可以由实施治疗的医生选定。每天或每周可以服用组合物一次或多次。这种药物组合物的有效量是能在临床上提供显著的针对流血事件的效果的数量。这样的数量将部分地取决于被治疗的特定疾病、主体的年龄、体重和总的健康状况以及其它对于本领域技术人员来说是很显然的因素。

一般在预期的流血之前或者在流血开始的时候，服用一个单位剂量的组合物。然而，根据给定的剂量和主体的状况，还可以服用多个剂量，优选以2-4-6-12小时的间隔服药。

组合物可以是同时包含合适浓度的因子VIIa和因子XIII的单个的制剂，还可以是由包含因子VIIa的第一种剂型和包含因子XIII的第二种剂型以及选择性使用的一种或多种包含因子VIII和/或TFPI抑制剂的其它单位剂型的试剂盒形式。在这种情况下，因子VIIa和因子XIII应当按顺序服用，优选在相互间隔大约1-2小时内，例如在相互间隔30分钟内，更优选在相互间隔10分钟内，更加优选在相互间隔5分钟内服用。可以首先服用两种单位剂型中的任何一种。

由于本发明涉及通过用可以单独服用的活性组份的组合物进行处理来预防或治疗流血事件或进行凝血治疗，所以本发明还涉及以试剂盒形式来组合单独的药物组合物。试剂盒包括至少两种单独的药物组合物。试剂盒包括用于容纳单独的组合物的容器，例如单个的瓶子或单个的箔包装。典型的试剂盒包括服用单独的组份的说明书。当单独的组份优选以不同的剂型、以不同的药剂间隔服用时或者当组合物的单个组份的剂量需要由实施治疗的医生精确确定时，使用试剂盒形式是特别有利的。

试验

对因子VIIa的活性试验：

用于测试因子VIIa的活性，从而选择合适的因子VIIa的变体的合适的试验作为一种简单的初步的体外试验来进行：

体外水解试验

可以试验天然的(野生型)因子VIIa和因子VIIa变体(以后均称为＂因子VIIa＂)的特定活性，还可以对它们进行平行试验以直接比较它们的特定活性。试验在微量滴定盘(MaxiSorp，Nunc，Denmark)中进行。把最终浓度为1mM的生色底物D-Ile-Pro-Arg-对硝基-N-酰基苯胺(S-2288，Chromogenix，Sweden)加入因子VIIa(最终浓度为100nM)在含有0.1M NaCl，5mM CaCl₂和1mg/ml牛血清白蛋白的50mM pH7.4的Hepes中。在SpectraMax^TM340盘式读数计(Molecular Devices，USA)中连续测定405nm处的吸收。在20分钟的温育期间吸收得到了发展，在减去不含酶的空白孔中的吸收后，用来计算变体与野生型因子VIIa的活性的比值：

比值＝(因子VIIa的变体的A_405nm)/(野生型因子VIIa的A_405nm)

基于此，可以鉴别出活性相当于或高于天然因子VIIa的因子VIIa的变体，例如其中变体的活性与图1中所示的天然因子VII的活性的比值在1.0左右和高于1.0的变体。

还可以使用生理上的底物例如因子X，合适地，在100-1000nM的浓度下测定因子VIIa或因子VIIa变体的活性，其中在加入合适的生色底物(例如S-2765)后，测定产生的因子Xa。此外，活性试验可以在生理温度下进行。

还可以在生理浓度(当模拟血友病A时，减去因VIII)时包含所有相关的凝血因子和抑制剂以及活化的血小板(如Monroe et al.(1997)Brit.J.Haematol.99，542-547的第543页中所述，在此通过参考文献引入)的试验中测定因子VIIa或因子VIIa变体生产凝血酶的能力。

对因子XIII的活性试验：

一种测试因子XIII的谷胺酰胺转移酶活性从而选择合适的因子XIII的变体的合适的试验可以简单地例如按照Methods of Enzymology，Vol.45(1976)，Proteolytic Enzymes，Part B，pages177-191(Ed.Lorand，L.)中所述的体外试验进行。

进一步通过下列实施例对本发明作详细说明，然而，不应当把这些实施例解释为对保护范围的限定。说明书前面部分和下列实施例中所公开的特征独自或组合起来都是以其不同的方式实现本发明的材料。

实施例

实施例1

因子XIII增强因子VIIa诱发的血纤蛋白凝块的形成。

在微量滴定孔中，用含有20nM Hepes、150mM NaCl和5mM CaCl₂，pH7.4的缓冲液把含有柠檬酸盐的正常人血浆(NHP)稀释到1/10(总体积为250μl)，通过Specramax^TM340(Molecular Devices，Sunnyvale CA)在600nm处光密度的增大来监测血纤蛋白凝块的形成。

在大约2500-3000秒时得到血块的自发性形成。图1显示10nM重组因子VIIa(rFVIIa)(从Novo Nordisk A/S Bagsvaerd，Denmark得到)把凝血时间缩短到1600秒(n＝2)。当把30nM因子XIII(FXIII)(从American DiagnosticaInc，Greenwich，CT得到)与10nM rFVIIa(n＝3)一起加入时，凝血时间得到了进一步的缩短。在FXIII存在下形成的凝块比没有FXIII存在时形成的凝块更透明(更低的最大OD)，表明加入FXIII产生了含有更薄纤维的网眼更细的血纤蛋白凝胶结构。

实施例2

在因子VIIa-诱发的血块形成期间辅助因子XIII的存在增大了对血纤蛋白溶解降解的抵抗力

与含有相同数量的血纤蛋白并且排列成厚纤维或交联更少的纤维的凝块相比，由薄纤维构成的血纤蛋白凝块的机械强度更大，更难以降解。图2中所示的试验说明，辅助因子FXIII(30nM)延长了在rFVIIa和组织纤溶酶原活化剂(t-PA，American Diagnostica)存在下形成的凝块的血纤蛋白凝块的溶解时间。在有或没有30nM XIII存在下，通过把25μl NHP加入225μl含有50 nM rFVIIa和0.5nM重组tPA的20nM Hepes，150mM NaCl，5mMCaCl₂，pH7.4中来诱发血块的形成。通过一台Spectramax_340在600nm处以OD_600nm的增大以及之后轨迹向基线的返回来监测血块的形成以及之后由tPA-介导的纤溶酶原活化所诱发的血块溶解。图2显示，在这些条件下，由于FXIII的存在，血块的溶解时间被明显地延长了。

实施例3

因子VIIa和因子XIII的组合物增大了血块的最大牢固度，增大了对血纤蛋白溶解的抵抗力

对添加了6nM重组的组织型纤溶酶原活化剂(t-PA，AmericanDiagnostica)的含有柠檬酸盐的正常人血浆进行血栓弹性谱图(Thrombelastograph)测量，分析了单独加入1nM rFVIIa(从Novo Nordisk A/SBagsvaerd，Denmark得到)或者把1nM rFVIIa和各种浓度的因子XIII(FXIII，Haematologic Technologies，HCXIII-0160，Lot N1212，)一起加入时的影响(FXIII对最大的血块牢固度(MCF)和血块对t-PA介导的溶解的抵抗力的影响。通过加入Innovin(最终浓度：稀释2000倍，Dade Behring # 526945)和钙(最终浓度：15mM)在20mM HEPES，150mM NaCI，pH7.4缓冲液中的浓度来启动凝血。

使用测得的血栓弹性谱图分析rFVIIa和FXIII对血块的最大牢固度(MCF)和血块对由t-PA-介导的血纤蛋白溶解的抵抗力的影响。在加入rFVIIa和/或FXIII之前得到的MCF是25mm，溶解一半的血块所需要的时间为12.3分钟(图3)。加入逐渐增大的浓度的FXIII(0-40nM)没有改变MCF；然而，观察到溶解一半血块的时间随剂量而延长，最佳在30nM FXIII时(溶解一半血块的时间：14.3分钟，图3)。同样地，加入rFVIIa(1nM)导致对血块的保护，使其免受t-PA-介导的血纤蛋白溶解(溶解一半血块的时间：16.4分钟)，而对MCF没有任何影响(图3)。然而，在一起加入rFVIIa(1nM)和FXIII(30nM)时，观察到MCF的增大(29mm)以及深度的免受血纤蛋白溶解的保护作用(溶解一半血块的时间：27.1分钟)(图3)。这些结果综合起来证明，向血浆中加入rFVIIa和FXIII，以协同方式改善了机械强度和对t-PA-介导的血纤蛋白溶解的抵抗力。