一种治疗结核病和其他细胞内感染疾病的疫苗及其制备方法

摘要

本发明涉及一种抵抗结核病和其它细胞内病原体的疫苗的制备方法，该疫苗是针对细胞内病原体，尤其是结核分支杆菌和沙门氏菌病原体。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抵抗结核病和其他细胞内病原体的疫苗的制备方法，该疫苗是针对细胞内病原体，尤其是结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和沙门氏菌(Salmonella)病原体。本发明的用途是开发一种抵抗细胞内病原体的疫苗，该病原体是结核病，布鲁氏菌病，利什曼病，leisteriosis，麻风病，疟疾，伤寒，锥虫病，链球菌属和HIV感染的病原体。本发明的主题，即病原体结核分支杆菌(M.tuberculosis)，是一种结核病的病原体。本发明中，使结核分支杆菌在同种异基因和同基因的巨噬细胞和巨噬细胞细胞系内生长。然后巨噬细胞-结核分支杆菌复合体被射线照射，杀死巨噬细胞和分支杆菌。

发明背景

结核病是一种慢性感染性疾病，每年约3百万人接连死于该病。每年约有8百万人感染并且人数逐年增加，约有世界人口三分之一的人数感染结核分支杆菌。艾滋病(AIDS)的出现活化了百万计的潜伏期个体中的结核病，导致发病率和死亡率的急剧上升。因此结核分支杆菌是所有感染物中发病率最高的原因。仅有的疫苗BCG既不可预测又高度异变。BCG疫苗令人质疑的效果使研究单位急欲发展一种结核分支杆菌的有效疫苗(Bloom，B.R.等人，免疫学综述年评(Annu.Rev.Immund.)10：1992：453)。在过去的数十年里BCG在全球范围内作为疫苗大量使用。几百万儿童和新生儿都接受了BCG疫苗。但是，虽然BCG疫苗已大范围的使用，结核病不仅在发展中国家而且在工业化的国家中仍然是传播最快的疾病。而且，目前BCG疫苗的保护功效是不可预测并且是高度可异变的，在所有目前使用的疫苗中它仍是最有争议的疫苗。在对比试验中它令人质疑的效果使得对其作为疫苗的关注增加(Bloom和Fine，Tuberculosis In B.Bloom(ed.)，1994：531，Bloom，B.R.等人，免疫学综述年评10：1992：453)。而且，Madras的大量临床试验显示接种BCG-和未免疫接种的个体中具有类似的保护程度，暗示BCG诱导零保护(Ind.J.Med.Res.1980：72(增刊)：1-74)。这样很明显看到接种BCG并不能预防传染。

同样，涉及到BCG疫苗安全使用总是产生许多问题：

引起BCG接种疫苗质疑的重大事故发生在1929年。在德国Lubeck，251名儿童接受了当地研究所制备的BCG疫苗，有72名儿童死亡。接下来的调查显示，该研究所同时培养了毒性结核分支杆菌的培养物，给这些儿童使用的BCG疫苗批次中偶然受到了这些结核分支杆菌中的一株的污染(Lubeck.1935.DieSauglingstuberkulose in Lubeck.Springer，柏林)。对于HIV感染的个体中BCG的安全性又被提出新问题。有报道说在接受BCG疫苗的儿童中有一小部分传播BCG病的案例，接下来发现是HIV血清反应阳性(Von Reyn等，Lancet 1987：ii：669-672；Braun，等Pediatr.Infect.Dis.J.1992：11：220-227；Weltman，等，AIDS 7：1993：149)。WHO目前建议终止BCG疫苗在显示其免疫缺陷信号的儿重中使用(世界卫生组织1992，扩充免疫程序。程序报告。世界卫生组织，日内瓦，  世界卫生组织Weekly Epidemiol.Rec.62：1987：53)。基于13个展望研究和10个对比案例研究，由Dahlstom和Difts(Scand J Rspir Dis Suppl.65：1968：35)进行的大量志愿者试验和对BCG预防结核病的中间分析已于最近完成(Colditz等，美国医学学会杂志(J.Amer.Med.Assoc.)271：1994：698-702)。尽管结论是平均来说BCG在防止结核病上有平均约50％的保护性，生物性和可起作用性的平均有效性，基本上，这种宽范围结果本身就很有争论。在AIDS出现之前，在很多富裕的国家，结核病的发病率在至少一个世纪内呈下降趋势。这在荷兰(该国从未接种BCG疫苗)和斯堪的纳维亚联合王国(该国在1950年实行BCG疫苗全国接种)之间的对比中可得到说明。这些国家所报道的结核病下降是类似的(Styblo，K.Selected Papers R.Netherland Tuberc.Assoc.24：1991：136；Sutherland，Bull.Int.Union.57：1981：17)。所以将下降的原因仅归因为BCG接种是不合理的。BCG的功效是基于如下假设：BCG对于儿童中的初级感染和长期存在的感染中的内源重激活是有效的，但是对于外生感染却没有效果(ten Dam.H.G.现代结核病研究(Adv.Tuberc.Res.)21：1984：79。ten Dam，H.G.和A.Pio.Tubercle 63：1988：226)。流行病学数据显示，与肺部疾病相比，BCG疫苗接种对于系统疾病，尤其是对儿童中栗粒性结核和结核病脑膜炎，保护作用更强或更持久(Rodrigues等Int.J epidemiol.22：1993：1154)。Lurie的研究指出，分离自BCG免疫和未免疫兔肺中的结核分支杆菌CFU数量显示在生物体达到的和能够在肺和其他组织中生长的数量方面没有差别。另一项观察是分支杆菌在细胞内的定位结果。电子显微镜结果揭示，经过体外巨噬细胞感染后，BCG基本完全在吞噬溶酶体内，而毒性结核分支杆菌(H37Rv菌株)可以从吞噬溶酶体中逃逸，然后进入细胞质(McDonough等，免疫感染(Infect.Immun.)61：1993：2763)。这可能是相关的，因为是抗原呈递细胞内体区室中的抗原与II类MHC决定簇一起被呈递给CD4⁺T辅助细胞，而胞质抗原是与I类主要组织相容性复合体(MHC)决定簇一起被呈递给CD8⁺细胞毒性T细胞(CTL)的。如果这些体外的发现是普遍的，就可以解释为什么结核分支杆菌在其消除方面比BCG更依赖于I类MHC限制性CTL，暗示BCG也许并不能有效刺激I类MHC限制性CTL(Stover等，自然(Nature)351：1991：456)。在Rich，1951(结核病发病机理，第2版，第1028页，Charles C Thomas，出版者，Springfield，III)，Canetti，1955(人肺损伤中的结核分支杆菌，226页，Springer，纽约)和Lurie，1964(结核病抗性，天然和获得性防御的实验研究，391页，哈佛大学出版社，剑桥出版社，剑桥，Mass)的文章中，指出感染了结核分支杆菌后的恢复，比BCG更能实现对进一步结核病的保护。

对结核分支杆菌感染的有效的抗性需要裂解不能限制它们感染的巨噬细胞或实质细胞的特异性CD8⁺CTL，和能产生IL-2，IFN-γ，TNF-α以及其它与激活巨噬细胞相关的淋巴因子的特异性CD4⁺T细胞二者的参与。另一项现有技术EPO223218A(Stangvoss，Christinance)公开了同基因巨噬细胞，其中申请人使用同种异基因但完全不同的巨噬细胞。这篇引用的文献涉及直接激活T细胞，因此必须符合MHC限制性的规则，因为不同的个体具有不同的HLA，而本发明的理论基础是：经历了细胞凋亡的细胞被树突细胞吞入。树突细胞吞入凋亡细胞，而不管其MHC限制性如何。引用的该文献使用活的巨噬细胞(未灭菌的)，而本发明使用γ照射的疫苗(灭菌的)。所以，该引用的文献并不相关。

考虑到BCG疫苗的这些缺陷，申请人利用疫苗可作为经过照射的制剂使用，可以在AIDS病患者和无免疫应答儿童中接种而不必担心这一事实。现在BCG是用作减毒制剂，在上述对象中不推荐使用，因为可导致BCG病的传播。 WHO目前建议在明显显示出免疫缺陷病症的儿童中停止使用BCG疫苗(世界卫生组织1992.扩充的免疫计划，计划报告。世界卫生组织，日内瓦，世界卫生组织。Weekly Epidemiol.Rec.1987：62：53-54)。

另一项观察是分支杆菌在细胞内的定位结果。BCG基本完全在巨噬细胞的吞噬溶酶体内，而毒性结核分支杆菌可以从吞噬溶酶体中逃逸，并进入细胞质(McDonough，K.A.，Y.Kress和B.R.Bloom等，免疫感染61：1993：2763-2773)。抗原呈递细胞内体区室中的抗原与II类MHC决定簇一起被呈递给CD4⁺T辅助细胞，而细胞质抗原与I类主要组织相容性复合体(MHC)决定簇一起被呈递给CD8⁺细胞毒性T细胞。结核分支杆菌的消除更依赖于I类MHC限制性CTL，BCG并不能有效刺激I类MHC限制性CTL(Stover等，自然351：1991：456)。本疫苗包含生长于巨噬细胞中的结核分支杆菌的经照射制剂。据报道，被结核分支杆菌感染的巨噬细胞能有效的产生CTL(Stover等，自然351：1991：456)。进一步的，还有报道指出，照射过的细胞经历细胞凋亡，并可被树突细胞吞噬(Albert，M.L等，自然392：1998：86)，这导致抗原特异性CD4⁺和CD8⁺T细胞应答的产生。这个细胞凋亡依赖途径可能不仅在免疫接种研究中有前景，而且对于治疗性操作免疫系统以体内诱导针对各种抗原(包括肿瘤)的T辅助细胞和CTL应答以及调节有利的免疫应答可能也是有利的。

Rich(结核病的发病机理，第2版，1028页，Charles C Thomas，Publisher，Springfield，III)，Canetti，1955(人肺损伤中的结核分支杆菌，226页，Springer，纽约)和Lurie，1964(结核病的抗性，天然和获得性防御中的实验研究，391页，哈佛大学出版社，剑桥出版社，剑桥，Mass)指出，感染了结核分支杆菌后的恢复，比BCG能提供更强的保护以抗将来的结核病。根据上文内容，候选疫苗优于现有的BCG疫苗，因为它含有在巨噬细胞天然环境下生长的结核分支杆菌，该巨噬细胞分泌诱导保护性免疫应答的独特抗原并产生CD4⁺T辅助细胞和CD8⁺CTL。对抗结核分支杆菌感染的有效效果需要裂解不能限制它们感染的巨噬细胞或实质细胞的特异性CD8⁺CTL，和能产生IL-2，IFN-γ，TNF-α，以及其它与激活巨噬细胞相关的淋巴因子的特异性CD4⁺T细胞二者的参与。

本方法的基本原理是培育一种针对结核病和其它细胞内疾病的疫苗，经过照射、携有结核分支杆菌的MHC匹配的(同基因的)和不匹配的(同种异基因的)巨噬细胞经历细胞凋亡，树突细胞吞噬这些巨噬细胞并且在其表面呈递抗原(分支杆菌-蛋白质和同种异基因巨噬细胞肽)，然后诱导原初T细胞分化成效应CD4⁺Th1细胞。这些树突细胞也激活CD8⁺T细胞，产生细胞介导的免疫。系统中的同种异基因巨噬细胞产生同种异基因反应，结果导致生成大量细胞因子如IL-2，IL-12，IFN-γ等等，这些细胞因子可刺激Th1应答和细胞介导的免疫应答。已知Th1型应答提供针对结核病的保护。因此本方法的主要用途是生产抵抗结核病的有效的特异性疫苗。

发明目的

本发明的主要目的是研制一种疫苗以抵抗结核病和其它细胞内疾病，如麻风病，利什曼病，伤寒，锥虫病，疟疾，布鲁氏菌病，leisteriosis，艾滋病，链球菌感染和癌症。

本发明的另一目的是在同基因和同种异基因的巨噬细胞内培养病原体，并使其在细胞内分泌抗原。

还有另一目的是开发一种方法，其中病原体被已知的药物杀死，然后在使用前进一步经过γ射线照射；已知γ射线照射过的细胞是要经过细胞凋亡，并被树突细胞吞噬，树突细胞是Th1细胞和CD8⁺细胞毒细胞的有效激活子。

另一目的是研究一种既可对抗同基因巨噬细胞吞噬的病原体(即结核分支杆菌，麻风分支杆菌，利什曼虫属，沙门氏属，锥虫属，疟疾，布鲁氏菌属，leisteria，HIV，链球菌属)(举例来说，SMTV，S＝同基因，M＝巨噬细胞，T＝结核病，V＝疫苗)，又可对抗同种异基因的巨噬细胞吞噬的病原体(例如AMTV，A＝同种异基因，M＝巨噬细胞，T＝结核病，V＝疫苗)，来产生保护性的免疫应答的疫苗。

本发明的另一目的是提供一种疫苗，该疫苗是建立在在同种异基因细胞内吞噬的病原体可以引发免疫应答，而与遗传背景无关的基础之上的，即是说，该疫苗是混杂的疫苗，因此，它在人体内有效，而不受遗传多样性的影响。

发明概述

本发明涉及一种抵抗结核病和其他细胞内病原体的疫苗的制备方法。该疫苗是针对细胞内病原体，尤其是结核分支杆菌和沙门氏菌病原体。

发明详述

本发明的新颖性在于巨噬细胞内分支杆菌分泌的保护性抗原可以无需从巨噬细胞分离，即可作为疫苗使用。

疫苗在射线照射后使用，已知照射过的细胞会经历细胞凋亡。经历凋亡的细胞被树突细胞吞噬。树突细胞激活原初T细胞分化为Th1细胞和细胞毒性细胞。已知这些细胞对于抵抗细胞内感染和癌症的保护性免疫起主要作用。

系统内的同种异基因巨噬细胞产生同种异基因反应，由此产生大量细胞因子如IL-2，IL-12，IFN-γ等等，这些细胞因子可刺激Th1应答和细胞介导的免疫应答。疫苗构建所用的同种异基因细胞能引起与遗传背景无关的免疫应答，即是说，它作为混杂的疫苗起作用。因此，它可在人体内使用，而与遗传多样性无关。

本发明的目的是提供一种对抗结核病，沙门氏菌属和其他细胞内感染的疫苗。结核分支杆菌和鼠伤害沙门氏菌在同种异基因(AMTV)和同基因的(SMTV)巨噬细胞内培养，然后用γ射线照射，杀死细胞，用作疫苗。在体内，AMTV被树突细胞(γ射线照射导致细胞凋亡，树突细胞吞没凋亡细胞)优先吞噬，会激活对分支杆菌有反应性的原初T细胞。用于免疫的同种异基因巨噬细胞作为佐剂起作用，引起同种异基因反应性的T细胞，该T细胞产生大量的IL-2，IFN-γ，IL-12。这些细胞因子对于原初T细胞的生长和分化成CD4⁺和CD8⁺效应细胞T细胞至关重要。树突细胞Th1和细胞毒T细胞(CTL)的优选抗原呈递细胞(APC)。Th1和CD8⁺CTL是产生有效的，保护性的，抗结核分支杆菌免疫力的主要细胞。给对结核病有抵抗力和无抵抗力的小鼠品系接种该疫苗。

附图说明

图1代表同种异基因巨噬细胞结核病(AMTV)的作用图表。

同种异基因巨噬细胞结核病(AMTV)的作用主要原理已按图1所示。将结核分支杆菌在MHC不匹配的(同种异基因的)和同基因的巨噬细胞内培养。然后将该制剂经γ射线照射，用作疫苗。在体内AMTV被树突细胞优先吞噬(已知γ射线照射导致细胞凋亡，树突细胞吞没凋亡细胞)，然后激活对分支杆菌有反应性的原初T细胞。但是，带有分支杆菌的巨噬细胞不能直接激活原初T细胞。免疫所用的同种异基因巨噬细胞会引起同种异基因反应性的T细胞，该T细胞产生大量的IL-2，IFN-γ，IL-12。这些细胞因子对于原初T细胞的生长和分化成CD4⁺和CD8⁺效应细胞T细胞是至关重要。对于Th1和细胞毒性T细胞(CTL)来说，树突细胞是优选的抗原呈递细胞(APC)。它们刺激原初T细胞分化为抗原反应性的Th1和细胞毒T淋巴细胞。而且，树突细胞捕获外来抗原(在此为分支杆菌抗原)，并作为储藏库，在系统中缓慢释放该抗原以激活T细胞和维持记忆细胞。同种异基因反应性T细胞分泌的IL-2，IFN-γ，IL-12会引起分支杆菌反应性的Th1和细胞毒T细胞的克隆性增殖。Th1和CD8⁺CTL在产生有效的，保护性的抗结核分支杆菌免疫力中至关重要。给对结核病有抵抗力和无抵抗力的小鼠接种该疫苗。

同种异基因巨噬细胞结核病(AMTV)的作用原理已经通过在MHC不匹配(同种异基因)的巨噬细胞和同基因的巨噬细胞内培养结核分支杆菌得到说明。将制备物用γ射线照射，用作疫苗。在体内AMTV优先被树突细胞吞噬(已知γ射线照射导致细胞经历凋亡，树突细胞吞没凋亡细胞)，然后会激活对分支杆菌有反应性的原初T细胞。但是，带有分支杆菌的巨噬细胞不能直接激活原初T细胞。免疫所用的同种异基因巨噬细胞会引起同种异基因反应性的T细胞，该T细胞产生大量的IL-2，IFN-γ，IL-12。这些细胞因子对于原初T细胞的生长和分化成CD4⁺和CD8⁺效应细胞T细胞至关重要。树突细胞是Th1和细胞毒T细胞(CTL)的优选抗原呈递细胞(APC)。它们刺激原初T细胞分化为抗原反应性的Th1和细胞毒T淋巴细胞。而且，树突细胞捕获外来抗原(在此为分支杆菌抗原)，并作为储藏库，在激活T细胞和维持细胞记忆的系统中缓慢释放抗原。同种异基因反应性T细胞分泌的IL-2，IFN-γ，IL-12会引起分支杆菌反应性的Th1和细胞毒T细胞的克隆性增殖。Th1和CTL在产生有效的，保护性的抗结核分支杆菌免疫力中至关重要(Albert，M.L.等，自然392：1998：86；Wang，B等，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：1993：4156)。给对结核病有抵抗力和无抵抗力的小鼠接种AMTV和SMTV。通过用活结核分支杆菌感染小鼠并监测在肺部，脾脏和肝脏内细菌的死亡率和存活计数来监测疫苗的效力。用10⁵-10⁶存活的结核分支杆菌H37Rv攻击之后免疫接种的(4-12周)小鼠。在额外的3-4周内，分离出感染小鼠的肺部，脾脏和肝脏，连续稀释法稀释器官匀浆液，在琼脂板上接种，建立这些器官中存活的结核分支杆菌数量。还通过测量IFN-γ，和IL-4的量监测免疫接种动物中Th1和Th2细胞的产生。对小鼠爪垫接种该疫苗，通过测量爪垫的厚度监测诱导延迟型过敏性反应的情况。

根据本发明，可提供一种针对结核病和其它细胞内病原体的新疫苗，以及该疫苗的制备方法。结核病疫苗(SMTV和AMTV)，包括在MHC-匹配的和不匹配的巨噬细胞内培养的结核分支杆菌。制剂经过射线照射，然后用作疫苗。

由于该疫苗符合产生针对结核分支杆菌的期望免疫应答必需的全部要求，可预见到该制剂会对抗结核病起到有效作用。

疫苗AMTV是以混杂的方式起作用，因为它并不遵循MHC限制的原则，而是基于同种异基因-刺激作用和树突细胞对外来凋亡细胞的吞入。而SMTV疫苗是以MHC限制方式起作用的。

受感染的细胞经过充分生长，在异烟肼处理和γ照射后储存。经存活计数法检测该制剂中存活的分支杆菌。在疫苗中没有存活菌。对小鼠进行腹膜内或皮下免疫接种，然后用存活的结核分支杆菌H37Rv攻击。检测在肺部，脾脏和肝脏内存留的结核分支杆菌活力。用该疫苗免疫动物，经免疫荧光试验证实树突细胞对凋亡细胞的摄取。用SMTV和AMTV免疫接种动物，研究原初CD4⁺Th细胞的增殖和分化成Th1和Th2亚型效应细胞的情况。使用同基因巨噬细胞内吞噬的结核分支杆菌作为对照。用标准Cr⁵¹-释放试验检测SMTV和AMTV产生CD8⁺细胞毒T细胞的能力。

为检验同种异基因刺激的假说，对Balb/c(IA^d)和C57BL/6(IA^b)小鼠系用丝裂霉素C处理过的同种异基因和同基因APC捕捉的卵清蛋白免疫。为排除在二级应答中产生同种异基因应答的可能性，改变同种异基因-APC的单元型。实验动物用CBA/6(IA^k)小鼠APC捕获的卵清蛋白进行第二次加强免疫接种。观察CD4⁺和CD8⁺T细胞的复杂激活作用。观察到抗原特异性T细胞增殖和优势Th1应答，正如主要有IL-2和IFN-γ以及IgG2a-同种型的产生所证实的。观察到同种异基因应答中IL-2的大量产生，指示用丝裂霉素C处理的同种异基因APC捕获的抗原免疫接种经历了细胞凋亡。凋亡的细胞被树突细胞吞入，引起分支杆菌特异性和同种异基因反应性的T细胞应答。同种异基因T细胞占总T细胞的10％以上，并且已知其诱导IL-2的大量分泌。同种异基因T细胞产生的IL-2即会引起抗原特异性T细胞的增殖。

所以，在本发明中，在靶向于树突细胞的新送递系统基础上，在巨噬细胞系即J77.4或同种异基因和同基因的巨噬细胞中培养结核分支杆菌，研制一种有效的结核病疫苗。被感染的巨噬细胞用异烟肼处理，并射线照射，然后用于免疫接种，研究对于结核分支杆菌的保护作用。

同种异基因巨噬细胞结核病(AMTV)作用过程的主要原理通过培养在MHC不匹配(同种异基因)和同基因的巨噬细胞中生长的结核分支杆菌说明。该制剂用γ射线照射，用作疫苗。在体内AMTV优选的被树突细胞吞入(已知γ射线照射导致细胞经历细胞凋亡，树突细胞吞入凋亡的细胞)，然后激活分支杆菌反应性原初T细胞。但是，带有分支杆菌的巨噬细胞不能直接激活原初T细胞。免疫所用同种异基因巨噬细胞会激发产生大量IL-2，IFN-γ，IL-12的同种异基因反应性T细胞。这些细胞因子对于原初T细胞的生长和分化成CD4⁺和CD8⁺效应细胞T细胞十分重要。树突细胞是Th1和细胞毒T细胞(CTL)的优选抗原呈递细胞(APC)。它们刺激原初T细胞分化为抗原反应性的Th1和细胞毒T淋巴细胞。而且，树突细胞捕获外来抗原(在此为分支杆菌抗原)，并作为储藏库，在系统中缓慢释放抗原激活T细胞和维持细胞记忆。同种异基因反应性T细胞分泌的IL-2，IFN-γ，IL-12会引起分支杆菌反应性的Th1和细胞毒T细胞的克隆性增殖。Th1和CTL在产生有效的，保护性的结核分支杆菌免疫力中至关重要(Albert，M.L.等，自然392：1998：86；Wang，B等，美国科学院院刊90：1993：4156)。给对结核病有抵抗力和无抵抗力的小鼠品系接种AMTV和SMTV。通过用活的结核分支杆菌感染小鼠以及监测它们的死亡率和在肺部，脾脏和肝脏内细菌的存活计数来监测疫苗的效果。用10⁵-10⁶存活的结核分支杆菌H37Rv攻击经过免疫接种(4-12周)的小鼠。在额外的3-4周内，分离出感染小鼠的肺部，脾脏和肝脏，连续稀释法稀释器官匀浆液，在琼脂板上接种，确定这些器官中存活的结核分支杆菌数量。还通过测量IFN-γ，和IL-4监测经免疫接种的动物中Th1和Th2细胞的产生。对小鼠爪垫接种该疫苗，通过测量爪垫的厚度监测诱导延迟型过敏性反应的情况。

相应的，本发明还提供一种疫苗以抵抗结核病和选自下组的其它细胞内病原体：麻风分支杆菌(Mycobacterium leprae)，利什曼原虫，沙门氏菌，锥虫，疟原虫，布鲁氏菌，leisteria，HIV，链球菌和癌症。本发明还包括制造所述疫苗的方法，包括以下步骤：

i)培养病原体，该病原体选自由下述组成之组：结核分支杆菌，麻风分支杆菌，利什曼虫，沙门氏菌，锥虫，疟原虫，布鲁氏菌，leisteria，HIV，链球菌属，

ii)培养同基因(同菌株)，同种异基因(不同菌株)和异种的(不同物种如绵羊和山羊)巨噬细胞和选自J774A，P388D1，RAW，BMC-2，THP-1等的巨噬细胞系，

iii)用病原体感染巨噬细胞和细胞系，

iv)用已知的药物处理感染细胞，然后用伽玛射线照射，得到疫苗，

v)用上述制得的疫苗免疫对疾病有抵抗力和易感染的不同动物，

vi)用存活病原体感染动物，监测它们的死亡率和肺部，脾脏和肝脏中感染物的存活计数，

vii)监测免疫接种的动物中指示细胞介导免疫力产生的CD4⁺ Th1和Th2细胞和CD8⁺细胞毒T细胞的增殖和产生。

本发明进一步提供一种制备抵抗结核病的疫苗的方法，其中所述方法包括以下步骤：

i)培养结核分支杆菌H37Rv，

ii)培养同基因和同种异基因的巨噬细胞和选自J774A，P388D1，RAW，BMC-2，THP-1等的巨噬细胞系，

iii)用结核分支杆菌感染巨噬细胞和细胞系(J774A，P388D1，RAW，BMC-2，THP-1)，

iv)用异烟肼处理感染细胞，然后用伽玛射线照射，得到疫苗，

v)用上述制得的同种异基因巨噬细胞结核病疫苗(AMTV)和同基因巨噬细胞结核病疫苗(SMTV)免疫可抵抗和易感染结核病的小鼠，

vi)用存活的结核分支杆菌感染小鼠，监测它们的死亡率和肺部、脾脏和肝脏中细菌的存活计数，

vii)监测免疫接种的动物中指示细胞介导免疫力的生成的CD4⁺Th1和Th2细胞和CD8⁺细胞毒T细胞的增殖和生成，

viii)对小鼠爪垫接种该疫苗，通过测量爪垫的肿胀监测延迟型过敏性反应的情况，由此检测保护性免疫力。

本发明也提供一种制备抵抗沙门氏菌的疫苗的方法，其中所述方法包括以下步骤：

i)培养鼠伤寒沙门氏菌，

ii)培养同基因和同种异基因的巨噬细胞和选自J774A，P388D1，RAW，BMC-2，THP-1等的巨噬细胞系，

iii)用鼠伤寒沙门氏菌感染巨噬细胞和细胞系(J774A，P388D1，RAW，BMC-2，THP-1)，

iv)用丝裂霉素C和用伽玛射线照射处理感染细胞，得到疫苗，

v)用上述制得的疫苗免疫可抵抗和易感染结核病的小鼠品系，

vi)用活的鼠伤寒沙门氏菌感染小鼠，监测它们的死亡率和肺部、脾脏和肝脏中细菌的存活计数，

vii)监测免疫接种的动物中指示细胞介导免疫力的生成的CD4⁺Th1和Th2细胞和CD8⁺细胞毒T细胞的增殖和产生，

viii)对小鼠爪垫接种该疫苗，通过测量爪垫的肿胀监测延迟型过敏性反应的情况，由此监测保护性免疫力。

本发明提供一种通过在同种异基因和同基因巨噬细胞内捕获结核分支杆菌，沙门氏菌和其它细胞内病原体获得的疫苗，以及提供保护作用以用其抵抗感染物。

本发明由以下实施例说明，但实施例并不限制本发明的范围。

实施例1：制备抵抗结核病和其它细胞内病原体的疫苗的方法

将细胞内病原体，即结核分支杆菌，麻风分支杆菌，利什曼虫，沙门氏菌，锥虫，疟原虫，布鲁氏菌，leisteria，HIV，链球菌，在同基因和同种异基因小鼠的巨噬细胞、以及巨噬细胞系J774，P388D1，RAW，BMC-2，THP-1(ATCC，Rockville)内培养。在37℃/5％CO₂的条件下，感染细胞用异烟肼(20μg/ml)处理48小时，以0.05kGy量射线照射。

i.(a)得到的感染细胞用病原体特异性药物处理，进一步射线照射，用作疫苗，通过用存活细菌感染免疫接种小鼠监测该疫苗的效力。在一定时间间隔后，通过在琼脂板上接种连续稀释的器官匀浆液，计数感染小鼠的肺部、脾脏和肝脏中传染性生物体的存活率，监测该疫苗的效果。类似地，未接种的动物用存活细菌攻击，监测其死亡率和肺部、脾脏和肝脏中细菌的存活计数。

(b)用ELISA测定IFN-γ和IL-4，监测接种动物中CD4⁺Th细胞的增殖和分化成细菌反应性效应细胞细胞毒性T细胞，即Th1和Th2细胞的情况。

(c)Cr⁵¹释放试验监测CD8⁺细胞毒性T细胞。

实施例2：一种生产抵抗结核病的疫苗的方法

在另一实施例中，在同基因和同种异基因小鼠的巨噬细胞，巨噬细胞系J774，P338D1，RAW，BMC-2，THP-1(ATCC，Rockville)中培养来源于CentralJALMA Institute for Leprosy，Agra的结核分支杆菌H37Rv。在37C/5％CO₂的条件下，感染细胞用异烟肼处理(20μg/ml)48小时，以0.05kGy量射线照射。

i.(a)得到的感染细胞用异烟肼处理，然后用伽玛射线照射，用作疫苗，并通过用10⁵-10⁶存活细菌感染经免疫小鼠以检测效力。这种情况下，3-4周后，取出感染小鼠的肺，脾脏，肝脏，将连续稀释的器官匀浆液在琼脂板上接种，以确定这些器官中存活结核分支杆菌的数目。类似的，未接种的动物用存活细菌感染，监测其死亡率和肺部、脾脏、肝脏中细菌的存活计数。

(b)用ELISA测定IFN-γ和IL-4，监测接种动物中T细胞增殖和分化成细菌反应性效应细胞CD8⁺细胞毒性T细胞和CD4⁺Th1和Th2细胞的情况。

(c)通过Cr⁵¹释放试验监测CD8⁺细胞毒性T细胞。

(d)对小鼠爪垫接种该疫苗，通过测量爪垫的厚度监测延迟型过敏性反应的情况。

实施例3：一种抵抗沙门氏菌的疫苗的制备方法

在另一实施例中，在由同基因和同种异基因小鼠获得的巨噬细胞和巨噬细胞系J774，BMC-2和RAW中培养鼠伤寒沙门氏菌(MTCC98)。感染细胞用丝裂霉素C(50μg/ml)和伽玛射线照射(0.05kGy)处理。

i.(a)得到的感染细胞用药物处理，并用伽玛射线照射，用作疫苗，通过用10⁵-10⁶存活细菌感染经免疫小鼠监测疫苗的效力。在21天内观察实验动物的死亡率，取出感染小鼠的肺、脾脏、肝脏，将连续稀释的器官匀浆液在琼脂板上接种，以确定这些器官中存在的活沙门氏菌数目。类似地，未接种的动物用存活细菌感染，监测其死亡率和肺部、脾脏、肝脏中细菌的存活计数。

(b)用ELISA测定IFN-γ和IL-4，监测接种动物中CD4⁺Th细胞的增殖和分化成细菌反应性效应细胞Th1和Th2细胞的情况。

(c)通过Cr⁵¹释放试验监测CD8⁺细胞毒性T细胞。

(d)对小鼠爪垫接种该疫苗，通过测量爪垫的厚度监测延迟型过敏性反应的情况。

优点

本发明的主要优点是：

(i)大约有三分之一的世界人口感染结核分支杆菌。约5-10％只发展成活性结核病而90％的个体发展成了有效的抗结核分支杆菌的免疫力。在宿主巨噬细胞中存在的结核分支杆菌分泌独特的抗原，该抗原是长期保护性免疫力的有效诱导物质。相反的，结核分支杆菌当在体外人工培养基中培养时，分泌的抗原不诱导最适水平的保护，而且产生的免疫力寿命很短。本方法的突出特征在于可利用巨噬细胞中分泌的分支杆菌保护性抗原而无需将它们从巨噬细胞中分离出来。

(ii)在该系统中所用的这些同种异基因巨噬细胞作为独特的系统用于将活性分支杆菌分泌的抗原送递到树突细胞，并作为佐剂引发同种异基因反应性T细胞分泌细胞因子，即IL-2，IL-12，IFN-γ等。IL-2的过量分泌可被分支杆菌反应性保护性T细胞所利用。所以，不需要使用任何佐剂。同种异基因反应性T细胞主要产生IL-2，IFN-γ和IL-12，这些细胞因子负责Th1样免疫应答的产生。Th1对于诱导抵抗结核分支杆菌的保护性免疫力十分重要。

(iii)本发明的优点是被经γ射线照射的分支杆菌感染的巨噬细胞可被树突细胞吞噬。已知经γ射线照射的细胞要经历细胞凋亡。被树突细胞摄入的凋亡细胞诱导CD4⁺Th1和CD8⁺细胞毒T细胞的激活作用。细胞毒T细胞负责杀死感染分支杆菌的巨噬细胞。在如结核病，伤寒，麻风病，利什曼病，艾滋病等疾病中(这些疾病中病原体滞留在巨噬细胞中并在此繁殖)，目的物的溶解是必要的。这些细胞的溶解释放出病原体，使得激活的巨噬细胞能够吞噬细菌并将其消灭。树突细胞高水平的表达B7-1并分泌IL-12，是唯一有效的能激活原初T细胞的APC。而且，树突细胞可使原初T细胞分化成Th1和CD8⁺细胞毒性T细胞。Th1和细胞毒性T细胞对于诱导抵抗结核分支杆菌的保护性免疫力十分重要(Wakeham等，免疫学杂志(J.Immund.)160：1998：6101)。

(iv)本发明的另一优点和独特之处在于树突细胞上的树突俘获外来抗原，并作为储存库工作。该抗原从树突上缓慢释放，负责维持细胞记忆。

(v)AMTV疫庙以MHC不限制的方式工作，因为它基于的是同种异基因刺激和树突细胞吞入凋亡细胞。这种疫苗对于所有人种都有效，而与遗传多样性无关。