烟草钙调素依赖型蛋白激酶基因、蛋白和制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种烟草钙调素依赖型蛋白激酶基因、蛋白和制备方法和应用，其特征在于先提取烟草mRNA，建立的烟草cDNA文库，再利用MCK1(从玉米中分离到的钙调素依赖蛋白激酶基因)为探针筛选筛选，得阳性克隆测序得到基因全序列。将基因克隆到P

说明书

                      技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种烟草钙调素依赖型蛋激酶基因和其编码的蛋白及此基因和蛋白的制备方法。同时本发明还涉及这种钙调素依赖型蛋白激酶基因在烟草中的用途。

                      技术背景

在植物发育过程中，Ca²⁺通过同其靶蛋白相互作用起着非常重要的作用，两个研究的比较多的植物Ca²⁺靶蛋白是钙依赖型蛋白激酶(CDPKs)及钙调素(CaM)。目前已对多种CDPKs进行了生化和分子生物学分析，并已探讨出它在植物生理和发育过程中的多种功能。同样对CaM的研究亦显示它参与植物发育和环境应答反应，然而有关植物中CaM结合蛋白功能的研究却很少，特别是钙调素依赖型蛋白激酶，简称CaMKs的功能研究还是空白。Ca MKs由Ca²⁺和CaM进行双重调节，以其独特的结构而有别于CDPKs。在酵母和哺乳动物中的研究显示CaMKs是CaM介导的信号传导的关键组份，在这些有机体中CaMKs已得到鉴定并被证明参与介导许多细胞活动过程，包括基因的转录，细胞周期，神经记忆，碳水化合物代谢，细胞骨架功能等。但是在本发明申请之前，没有人公开或发表过植物钙调素依赖型蛋白激酶基因在植物中的用途。

                        发明内容

本发明的目的在于提供了一种烟草钙调素依赖型蛋白激酶基因及其编码的蛋白质。该基因最先从烟草悬浮细胞中分离出来，后来证明玉米，水稻，拟南芥等植物中都有该基因的存在。其特征是：该基因主要具有编码蛋白激酶催化区的核苷酸序列和编码钙调素结合区的序列，且基因全序列为SEQ IDNO：1，该蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明的另一个目的在于提供了制备这种新的钙调素依赖型蛋白激酶基因及其编码的蛋白质的方法。

实际上，烟草钙调素信号型蛋白激酶在烟草中的应用。 

为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施：制备基因具体步骤：1.提取烟草mRNA，用Straregenc公司ZAP-cDNA Synthesis kit按出厂商建议建立的烟草cDNA文库。2.利用MCK1(从玉米中分离到的钙调素依赖蛋白激酶基因)为探针筛选，文库用含MCK1p550筛选，阳性克隆测序得到基因的部分序列。3.再设计特异引物将基因的5’端和3’端测通，这样就得到了基因的全序列。制备蛋白具体步骤：1.Bac to Bac杆状病毒表达载体的构件，目的基因克隆到P^FASTHTb供体质粒。2.用碱法提取重组杆粒DNA，重组杆粒DNA转化Sf9细胞，收获重组病毒。3.融合病毒感染细胞72h后，室温收获细胞，纯化融合蛋白。

本发明还提供了一种载体，它包括钙调素依赖型蛋白激酶基因或其变异体，表达载体的一个重要特征是含有适当的启动子和翻译控制件。多种表达载体可以从商业途径获得，常用的载体包括但不限于质粒，噬菌体，病毒等，但最常见的首选质粒。

在本发明的另一个方面，提供了一种可在植物中表达的宿主菌，本发明优先的是农杆菌，更优选的是农杆菌LBA4404。本发明也提供了一种将所述载体导入植物细胞的方法，如基因枪注射法，细菌导入法。本发明优选农杆菌导入法，如农杆菌LBA4404烟草叶盘导入法。

在本发明中，提供了一种含钙调素依赖蛋白激酶基因的载体转化的植株。在本发明中，上述植株选自烟草。

在本发明的另一个方面，提供了产生能表达钙调素依赖蛋白激酶基因转化烟草的方法，其特征在于：该方法包括下列步骤1)钙调素依赖蛋白激酶基因连接到可表达调控序列上，形成可转化或表达的载体；2)将步骤1)中制备的载体转入植株；3)筛选阳性植株。更具体的，本发明提供了一种产生能表达钙调素依赖蛋白激酶基因转化烟草的方法，其特征在于：该方法包括下列步骤1)克隆的钙调素依赖蛋白激酶基因连接到质粒PMD上，形成可转化或表达的载体；2)将步骤1)中制备的载体转入农杆菌，再导入植株；3)筛选阳性植株。

在本发明中，①用两种引物即T6E5/T6F3作引物组合，以NtCaMK1作为模板DNA，通过PCR方式合成全长的NtCaMK1简称NtCaMK1。限制性内切酶BamH1消化的DNA片段克隆到质粒PMD中，其插入片段经DNA测序鉴定。pNtCaMK1f含有的编码NtCaMK1全长599氨基酸的序列。②将含有钙调素依赖蛋白激酶基因的载体转染农杆菌LBA4404，培养农杆菌于YM液体培养基，并将无菌苗在农杆菌菌液中浸泡。③在加Kan的选择培养基筛选阳性克隆。

本发明的与现有技术相比，具有以下优点和效果：该基因在烟草中的应用，制备一种能高效表达钙调素依赖型蛋白激酶的植株。该转基因植物表现晚开花性状，并能延长生长周期。植株无菌苗选自烟草，通过选择培养基最后筛选到钙调素依赖蛋白激酶高表达的植株，植株表现出晚开花性状，这样延长了植物生长周期，有利植物营养物质的积累。

本发明中所用的术语“转基因植物”是指含有导入的基因并能够稳定地或瞬时地表达所导入的基因并产生具有特定的生物学性状的植物。

本发明中的“植物细胞”是指植物的各种末成熟胚，或愈伤组织，或悬浮细胞，或原生质体。这些植物细胞在适当的条件下均能再生成植物。

克隆本发明中所述的钙调素依赖型蛋白激酶基因的方法是本领域中所常采用的方法。可利用探针技术从烟草悬浮细胞的cDNA文库中筛选出。提取mRNA的方法也有多种成熟的技术，试剂盒可从商业途径获得，而构建cDNA文库也是常用的分子生物学技术。构建本发明中所述的载体和将载体转染入植株也是本领域中所常采用的方法。其中所涉及的质粒，转染用媒体和试剂可从商业途径获得。

                            附图说明

图1植物表达载体

Kan，Str分别为卡那抗性和链霉素抗性，35S为启动子，基因NtCaMK为克隆基因插在35S启动子之后。图2Southern结果

1-5样为转基因植株，6为对照野生植株，结果显示转基因植株基因导入位点不同。图3PCR结果

1-9样为转基因植株，10为对照野生植株，结果显示转基因植株1，4，5，6，9成功导入基因。图4 Northern结果

2-6样为转基因植株，1为对照野生植株，结果显示转基因植株基因表达量大于野生植株。

                         具体实施方式通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)，或Draper，J等人(Blackwell科学出版社，1988)所述的条件，或按照制造厂商所建改的条件。实施例1(基因的克隆及测序)利用MCK1(本实验室从玉米中分离到的钙调素依赖蛋白激酶基因)为探针筛选烟草cDNA文库，分离到一MCK1同源序列，经测序得到NtCaMK1。1提取烟草mRNA。RNA的提取(TRIZOL TM Kit提取RNA)液氮研磨100mg材料。A.加1mlTRIZOL，室温放置5min。B.加入200ul氯仿，剧烈振荡30s，室温放置2min。C.12000g，15min，4摄氏度。取上清至新管中，加入500ul异丙醇，混匀，室温放置15min。D.12000g，15min，4摄氏度。去上清，加入1ml70％乙醇。E.7500g，7min，4摄氏度。去上清，空气干燥。F.DEPC-H2O溶解。2用Strategene公司ZAP-cDNA Synthesis kit按出厂商建议建立烟草cDNA文库。3文库用含MCK1p550筛选，阳性克隆测序。4得到基因的部分序列，再设计特异引物将基因的5’端和3’端测通，这样就得到了基因的全序列。

实施例2(载体构件)

本实验使用三种引物，分别为：T6E5：CGGATCCTGAAGTGGAC TTTGACTGGCCG；T6F3：CGGATCCTTATCGATGATGTCTTGTGCTTGAAC；T6P3：CGGATCCTTATAAAACAGGATTTTCCGTCCTTAACC。分别以T6E5/T6F3和T6E5/T6P3作为引物组合，以NtCaMK1作为模板DNA，通过PCR方式(94摄氏度53min，94摄氏度1min，65摄氏度50s，72摄氏度1min30s，30cycles，72摄氏度10min)合成NtCaMK1的全长(NtCaMK1r)和去3’端的NtCaMK1(NtCaMK1t)。限制性内切酶BamH1消化的DNA片段克隆到质粒PMD中，其插入片段经DNA测序鉴定。pNtCaMK1f含有的编码NtCaMK1全长599氨基酸的序列，pNtCaMK1t的序列仅编码NtCaMK1的N端443个氨基酸残基。实施例3(Bac to Bac杆状病毒表达载体的构件，目的基因克隆到P^FASTHTb供体质粒)1.提取质粒。(煮沸法)

(1)10000rpm，离心45秒，收集细菌培养物。(培养物在37℃下培养20-24小时，以期获得足够的DNA。)

(2)加入340ulSTET，振荡重悬细菌沉淀。再加入32ul的10mg/ml的溶菌酶，混匀。

(3)将微量离心管置于100℃水中45-60秒(50秒)，之后，快速置于冰水中冷却。在4℃，12000rpm，离心30分钟。

(4)用牙签将沉淀移走，加入170ul，7.5M乙酸铵和550ul，-20℃预冷的异丙醇。混匀后立即进行第五步。

(5)4℃，12000rpm，离心30分。用70％的-20℃预冷乙醇洗涤DNA沉淀1-2次。将DNA沉淀重悬于100ul水中。加入10mg/mlRNase，使终浓度达10ug/ml，37℃水浴30分钟。-20℃保存。2.载体的线性化。

(1)用等体积酚∶氯仿抽提载体质粒P^FASTHTb∶10000rpm，4℃，条件下离心5分钟，将上清转移至另一离心管中。

(2)取质粒20ul，加入已有105ul水的0.5ul微量离心管中。

(3)加入15ulBufferNE(已加有BSA)。

(4)加入10ulBammHI，混匀，离心至管底。37℃，酶切4-6小时或者过夜。

(5)加入0.1M EDTA(PH8.0)15ul至终浓度为10mM，终止反应。

(6)电泳检查。

(7)将线性化的载体145ul加入1/10体积的乙酸钠(3M，pH7.0)，再加入2.5倍体积无水乙醇，-20℃条件下过夜沉淀DNA。3.线性化载体的去磷酸化。

(1)将过夜沉淀在12000rpm，离心5分钟。室温于燥后溶于75ul水中。电泳检查。

(2)取70ul线性化的载体，加入8ul 10×Buffer，加入2ul细菌碱性磷酸酶(CAP)，37℃条件下温育30分钟。

(3)再加入2ul CAP，37℃条件下温育30分钟。

(4)加入4ul 0.1M EDTA(pH8.0)，使终浓度为5mM，65℃温育1小时，终止反应。

(5)用酚∶氯仿抽提

(6)上清中加入0.1倍体积的乙酸钠(pH7.0)，充分混匀，再加入2.5倍体积的乙醇，混匀后在-20℃过夜沉淀DNA。

(7)4℃，12000rpm，离心10分钟，回收DNA。

(8)用预冷的70％乙醇洗涤沉淀。

(9)用15ul水溶解DNA，-20℃保存。4.目的基因的获得。

(1)用煮沸法从DH5α中提取带有TIEF，TIEP，目的基因片断的pET32质粒。电泳检查。

(2)用BamHI酶切。反应总体积为50ul

                 pET质粒(带有目的基因)          30ul

                 水                             11ul

                     1×NE Buffer     5ul

                     BamHl            4μl

                     37℃，过夜.

(3)电泳检查酶切结果。

(4)从胶中回收目的基因。

a.将酶切后的质粒全部点在0.8％胶中，电泳。

b.将带有目的基因的凝胶在长波紫外条件下快速用刀片切下。称

  量。

c.加入3倍体积的Buffer QX1(100mg-100ul)。

d.50℃温育10分钟。期间每2-3分钟摇动离心管，以促进凝胶的

  溶化。

e.再加入1倍体积的异丙醇，混匀。

f.将QIAquick离心管放在2ml的收集管上，将上述混合物加在

  QIAquick离心管中，离心1分钟。

g.去掉收集管中的液体，将QIAquick离心管重新放在收集管上。

h.加入0.75ml Buffer PE，离心1分钟。

i.去掉收集管中的液体，再次离心，10000×g(-13000rpm)，1分钟。

j.将QIAquick离心管置于1.5ml离心管上，加12ul水，静止1分

  钟后，离心1分钟。

k.电泳检查回收情况。5.将目的基因连接到P^FAST HTh上。(总反应体积为12ul)

              水                 3.3ul

          10×Buffer             1.2ul

           目的基因              5ul

         线性化的载体            1.5ul

        T4 DNA连接酶             1ul

   混合后于室温放置20分钟，然后置于15℃-16℃，过夜。6.DH5α感受态细胞的制备。

(1)将细菌培养至OD600为0.45-0.55，后置于冰上2小时。

(2)4℃，3000rpm，离心5分钟。

(3)将沉淀重悬于25ml 100mM用冰预冷的CaCl2中，置于冰上30分钟。

(4)4℃，3000rpm，离心5分钟。

(5)将沉淀重悬于5ml用冰预冷的0.1M CaCl2溶液中。加入1.6ml 80％甘油至

   终浓度为20％。

(6)分装后用液氮冷冻至固态后，-70℃保存。7.连接反应的产物转化DH5α感受态细胞。

(1)将感受态细胞置于冰上。

(2)加入连接反应混合物5ul，将混合物置于冰上30分装。

(3)42℃，水浴45秒。

(4)在置于冰上2分钟。

(5)在超净台上上加入800ul LB培养基，37℃，摇床培养1小时。

(6)将培养物倒于加有Amp的LB培养板上，在超净台上吹干，之后，37℃，过夜培养。8.筛选带有目的基因的质粒的菌落。

(1)取单个菌落20-40个，用灭菌牙签接种LB/Amp平板上并做标记，37℃，过夜培养。

(2)用牙签挑取菌落，置于25ul水中。再入25ul新配置的溶液中。(100ul1N NaoH；100ul  10％ SDS；20ul 500mM EDTA pH8.0；200ul 0.2％溴酚兰；100ul甘油；480ul水。每1ml)。

(3)混匀，室温放置5分钟。

(4)将混合物点样到1％的凝胶上，电泳。    

(5)将筛选出来的带有目的基因的质粒的菌落重新划线培养。37℃，过夜。9.用限制性酶内切酶酶切分析，筛选带有正向连接的目的基因的质粒。

       水          15ul

   10×Buffer      2ul

     内切酶        1-2ul

    质粒DNA        3μl

    37℃，温育4小时，电泳检查。10.转化DH10Bac感受态细胞，并用蓝/白斑方法筛选转化菌株。   A.DH10Bac感受态细胞的制备。(方法同DH5α感受态细胞的制备相同，略。)   B.用煮沸法提取带有目的基因的质粒，并用其转化DH10Bac感受态细胞。

     a.将感受态细胞置于冰上，加5ul重组质粒，轻敲管壁以混匀。

     b.混合物在冰上放置30分钟。

     c.42℃水浴45秒后，置于冰水中2分钟。

     d.加入800ulLB培养基，37℃，摇床培养4小时以上。

     e.用LB培养基稀释培养物至1/10，1/100，1/1000。之后，各取200ul

     接种于Luria Agar培养板(LB培养基中加入所需的抗生素，再涂布IPTG

     和X-gal)上。37℃，培养至少24小时以上。

     f.4℃放置数小时，使蓝色充分显现。

     g.重复E和F两步，再次验证蓝/白斑筛选的结果。11.用碱法提取重组杆粒DNA

     a.取培养24小时的培养物1.5ml，14000×g，离心1分钟。

     b.用巴斯得吸管吸去上清，将沉淀重悬于0.3ml溶液I中。再加入

     0.3ml溶液II，轻轻混匀。室温放置5分钟。

     c.缓慢加入0.3ml 3M pH5.5的乙酸钾(4℃)，边加边摇动。置于冰上

     5-10分钟。之后，14000×g离心10分钟。

     d.小心移取上清到装有800ul异丙醇的离心管中。轻轻混匀。置于冰

    上5-10分钟。(或者于-20℃过夜)

     e.14000×g，室温条件下离心15分钟。

     f.弃上清后，加入500ul 70％乙醇，洗涤沉淀。14000×g，室温条件下离

     心5分钟。

     g.尽可能移去上清(小心操作)。室温干燥5-10分钟，溶于40ulTE，

     分装保存在-20℃。12.重组杆粒DNA转化Sf9细胞

     a.培养的细胞长至铺满80％左右。

     b.准备下述溶液：

    溶液A：用无血清的昆虫细胞培养基100ul稀释10ul(具体体

积由重组杆粒的浓度决定)重组杆粒DNA。

        溶液B：用100ul无血清的昆虫细胞培养基稀释6ulCELLFECTIN

试剂。

    c.将两种溶液混合后室温放置15-45分钟。(30分钟)

    d.将细胞培养物中的培养基吸走后，用2ml不含有抗体的无血清培养

基洗涤细胞。

    e.在lipid-DNA转染混合物中加入0.8ml无血清培养基。之后，将其覆

盖在细胞培养物上。

    f.27℃培养细胞5小时。

    g.移走转染混合物，并加入2ml无血清培养基洗涤细胞数次，再加入含

抗体和血清的Grace’s昆虫细胞培养基5ml。27℃培养72-96小时。13.收获重组病毒

      将上述培养72小时的细胞培养基转移至离心管中，500×g离心5分钟，

  将含有病毒的上清液转移至另一离心管中。

       4℃短期保存。实施例4(融合蛋白的表达：融合病毒感染细胞72h后，室温收获细胞)融合蛋白的纯化：1.准备层析柱。

A.将层析柱固定在支持物上。

B.取1ml Ni-NTA基质于离心管中，1500g离心5分钟。

C.移走上清，加入1倍体积的wash buffer(phosphate buffer D：50mM乙

  酸钾pH6.0，300mM Kcl，10mM β-巯基乙醇，10％ glycerol)。

D.将混合物倒入柱中。

E.用5-10倍体积的wash buffer在4℃条件下，以0.5ml/min的速度淋

  洗层析柱。2.准备细胞抽提物。

A.将细胞于500×g条件下离心5分钟。

B.细胞可以保存-80℃下，或者直接进行下述步骤。

C.用5倍体积的lysis buffer重悬细胞(1g∶1倍体积)(50mM

    Tris-Hcl，pH8.0；10mM β-巯基乙醇；1mm PMSF；1％ NP-4；4℃)

D.上下颠倒1分钟。

E.10000×g离心10分钟，将上清移至另一离心管中。3.提纯蛋白质。

A.将上清加到层析柱上。

B.用10倍体积的Buffer A(20mM Tris-Hcl pH8.5；500mM Kcl；20mM

  imidazole；10mM β-巯基乙醇；10％甘油4℃)淋洗层析柱。

C.用2倍体积的Buffer B(20mM Tris-Hcl pH8.5；1M Kcl；10mM β-

  巯基乙醇；10％甘油4℃)淋洗层析柱。

D.用2倍体积的Buffer A淋洗层析柱。

E.用5-10倍体积的Buffer C(20mM Tria-Hcl pH8.5；100mm Kcl；100mM

  imidazole；10mM β-巯基乙醇；10％甘油4℃)洗脱蛋白质。

F.收集蛋白质。

如果使用磷酸缓冲液：

A.上样。

B.用10倍体积的Buffer D(50mM乙酸钾pH6.0；300mm

Kcl；100mMimidazole；10mM β-巯基乙醇；10％甘油)淋洗层析柱。

C.用5-10倍体积的Buffer E(50mM乙酸钾pH6.0；300mM Kcl；100mM

imidazole；10mMβ-巯基乙醇；10％甘油)洗脱蛋白质。D.收集。实施例5(植株的转化与筛选)烟草的农杆菌转化A.无菌苗的准备：种子经70％乙醇30sec，ddH₂O洗，5％NaClO浸泡30min，ddH₂O洗5次后，平铺于MS于培养基(PH5.8)中，琼脂浓度0.8％。烟草无菌苗备用。B.烟草叶盘转化：接种LBA4404(含pBl121/NtCaMK1)于固体培养基YM上，两天后挑取单菌落于50mlYM液体培养基中培养。取无菌苗叶片，保留中脉，切成大小的叶盘，于菌液中浸泡10。叶上表皮朝下，置于共培养基上，每皿6-7片，共培养2-3天。C.共培养结束后，用液体MS培养基洗叶片两次，再用加Carb的液体MS培养基洗一次。叶盘转移至选择培养基上。每隔15天继代1次。D.待再生芽长至1cm时切取小芽移至生根培养基上，用加Carb与Kan的固体MS培养基筛选。E.苗生根后，移栽入蛭石。10天后移栽下上钵。实施例6(转化植株的核酸分析-PCR鉴定)(1)用于PCR的转化植株总DNA的提取A.70％乙醇擦洗叶片，称取大约100mgB.加入600ul抽提缓冲液(0.2M Tris-Cl，0.25 MnaCl，25mMEDTA，0.5％SDS，pH7.5)，室温快速研磨。C.1.5ml Ependorff管中涡旋混匀5~10sD.12000rpm，25min，室温。取上清，加等体积异丙醇，上下颠倒混匀。-20摄氏度，沉淀过夜。E.12000rpm，15min，室温。去异丙醇，倒置于纸巾上。加入70％乙醇200ul泡洗DNA沉淀。F.12000rpm，15min，室温。去乙醇。倒置于纸巾上，待乙醇挥发干净。G.加TE(pH7.5)100ul容解粗提DNA沉淀。用分光光度计测定或电泳估测其浓度。H.以总DNA为模板，进行PCR。(2)PCR程序PCR反应混合液的配比同质粒PCR鉴定，反应的时间和温度作如下：94摄氏度53min94摄氏度1min，65摄氏度50s，72摄氏度1min30s，30 cycles72摄氏度10min结果如图3示实施例7(转化植株的核酸分析-Northen杂交)(1)RNA的提取(TRIZOL TM Kit提取RNA)液氮研磨100mg材料。A.加1ml TRIZOL，室温放置5min。B.加入200ul氯仿，剧烈振荡30s，室温放置2min。C.12000g，15min，4摄氏度。取上清至新管中，加入500ul异丙醇，混匀，室温放置15min。D.12000g，15min，4摄氏度。去上清，加入1ml70％乙醇。E.7500g，7min，4摄氏度，去上清，空气干燥。F.DEPC-H2O溶解。(2)RNA电泳1.2％琼脂糖电泳(3)Northen杂交DNA探针的32P标记A.于第一个1.5ml EP管中按下列顺序加样配制反应混合液：10XPCR Reaction Buffer               2.0ulMgCl2(25mM)                          1.2ulPrimer1(10uM)                        0.2ulPrimer2(10uM)                        0.2uldNTP(dATP，dGTP，dTTP each 1.5mM)    2.0ul32P-dCTP(60u Ci)                     6.0ul65摄氏度3min，置于室温。B.于第二个管中加入DNA模板3.0ul(128ng)加入7.5ul，混匀，煮沸3min，置于冰上。C.将2ul用冰预冷的稀释Taq DNA Polymerase(1U/ul)和dNTP及引物混合物迅速加入到变性的模板DNA中，总反应体积21ul。D.混合物置42摄氏度反应30min。E.加入4ul0.5M EDTA(pH8.0)于探针反应混合液中终止反应。放射性标记的探针过Sephades R-25M柱中纯化。该柱子事先用STE溶液(980ul TE pH7.5+20ul 5.0M NaCl)平衡。分管收集用STE溶液洗脱的探针，合并2管放射性比活性最高的洗脱液作为杂交用探针。在加入杂交液之前煮沸10min，立即置于冰上。(4)预杂交含有RNA的尼龙膜，先用3XSSC(10XSSC：1.5M NaCl和0.15M柠檬酸钠，pH7.0)湿润，将膜正面朝上，置于杂交管中。鲑鱼精子DNA(ssDNA)100ul(10mg/ml)煮沸5min，置于冰上10min，加入到10ml预杂交液(同杂交液成分相同，为0.5MNa2P04 pH7.4，7％SDS)中，65摄氏度预杂交2~3小时。(5)杂交将探针加入新换的10ml杂交液中，65摄氏度过夜。(6)洗膜1XSSC，0.1％ SDS，65摄氏度，15~30min，2次。0.1XSSC，0.1％SDS，65摄氏度，15~30min，2次。(7)放射自显影将膜用保险膜包裹，用盖革计数器检测膜上的放射性水平，置暗室中进行X光片的放射性自显影。X光片的放射自显影结果如图4示

序列表<110>武汉大学<120>烟草钙调素依赖型蛋白激酶基因、蛋白和制备方法及应用<160>4<210>1<211>2530<212>DNA<213>烟草<400>CGGCACGAGC CTAAGCTGTG CTTTTTGTCC TTTTTTGCAA TTTTAATCTT    50GATTGTTTTC TGTGTTCATA GTAATCAGAT TTTGTTGTGT TAAGAGTGTA    100ATTAATTTTT ATTTTCTTAA GGAGTCATTA GGAGCTAAAG GTTTTTGAAT    150TTTTCAGACG TGTTGACGTC AGGTTTTTTG ATCCAAATGT CTTTAATGTC    200AACAATAACT ACAGTCTTAC CCTATTTTTT GATTTGATTT ATTCTTCTTC    250TTCTTCTTTT ATACTCCGAA ATTTACAAAA TCTGAGTTTT TTTTACTCTG    300GCTTCTGTCT TCAAACTTCC AATTTGGGAC GCGTTTCTGA TTCTCTGTCG    350CCTCTGTTTG GTTTCAATTT TTTTTTTTTG GGTTTGACCG TCACATGAGT    400GGACTTTGAC TGGCCGTGAT CGGACTTTTG ATTGTCGCCG ATGGGGCACT    450GCTGCAGTAA GGGTGTTACC GCCGATAATG ACGGTCACGT CGTCTCCGTT    500GTTGACGGAA ACTCATCCGT CTCCACAAAC AACCGCCCCA AACCATCACC    550GTCACCGGCA CGTCCACAGT CCGTCGGGAA CGGGACGAGT TACACTAACA    600ACAACACGCC AGCTCACTCA TTTACAACCA GTCCTTTTCA GAGCCCATAC    650CCTGCCGGAA TACCTCCCTC CCCGTCTCCG GTCGGAACGG CGAGAAGGAA    700ATTCAAGTGG CCATTTCCAC CGCCGTCGCC GGCGAAGCCT ATATTATCGG    750CGATCCTTAA GCGGCAGGGA ACGACGTCAG CAAAGCCAAA AGAAGGGCCA    800ATACCGGAAG ATGAAGGTGG TGAAGGTGAG AGACAGCTGG ATAAAAGCTT    850TGGTTATCCA AAGAACTTGA CGGCAAAGAT AGAGCTTGGA AAGGAAGTAG  900GTCGAGGGCA TTTTGGACAT ACTTGTTGGG CTAAAGGTAA AAAAGGCGAA   950CTTAAAAATC AACCGGTCGC TGTGAAGATC ATTTCAAAAG CTAAGATGAC   1000_AACAGCTATA TCTATTGAAG ATGTTCGCAG GGAGGTGAAG ATATTGAAGG    1050_CCTTGTCTGG ACATCAGAAT CTTGTCAAGT TTTATGATGC CTTTGAGGAT    1100GCCAACAATG TCTACATAGT AATGGAGTTA TGTGAAGGAG GGGTTCTATT    1150_GGACAGGATT CTATCAAGAG GCGGGAGATA CACAGAGGAG GATGCCAAAA    1200GTATACTGGT TCAAATACTA AATGTTGTCG CCTTTTGTCA TCTTCAAGGT    1250_GTGGTCCACC GTGATCTGAA GCCAGAGAAC TTCGTTTTTA CGAAGAAAGA    1300_AGAGGATGCA CCAATGAAGG TTATTGATTT TGGTCTATCA GACTTCATCA    1350_GACCAGATCA ACGTCTTAAT GATATTGTTG GCAGTGCATA CTATGTTGCA    1400CCTGAAGTAC TTCATAGGTC ATACAGTATT GAAGCAGATA TGTGGAGTAT    1450_TGGTGTGATA ACGTATATCT TATTGTGTGG AAGTAGACGT TTCTGGGCAC    1500_GTACAGAGTC AGGCATTTTT CGATCCGTGT TACGAGCTGA TCCTAATTTT    1550GAGGACTCAC CTTGGCCTTC AGTGTCTGCA GAGGCCAGAG ATTTTGTGAA    1600_AAGGCTTTTG AATAAAGACC ATAGGAAGAG AATGACCGCT TCTCAAGCAT    1650_TGGCTCATCC ATGGTTAAGG ACGGAAAATC CTGTTTTACC TTTAGACATA    1700TTGATCTTTA AATTAGTCAA GTCTTATACT CGAGCCTCAC CCTTGAAACG   1750TGCAGCATTG AAGGCTCTTT CAAAAGCATT GACAGAAGAA GAGTTAATCT    1800ACCTCAGGGC TCAATTCAAT TTATTGGAAC CGAAAGATGG TCGTGTGTCA     1850CTCAACAATT TTAAGATGGC ACTTACTAAA CAAATGACTG ATGGCATGAG     1900GGAGTCAAGA GTTTTTGACA TCTTAAATTT GATGGAACCA TTATCCTATA     1950AACCACTGGA TTTTGAAGAG TTCTGTGCTG CCGCAATTAG TACATATCAG     2000CTTGAGGCTC TTGAAAATTG GGAACAAATT GCTAGTGCCG CTTTTGAGCA     2050TTTTGAGCAA GAAGGAAACC GTGTCATTTC CGTTGAGGAA TTAGCACAGG     2100AAATGAATTT GGGCCCAACT GCTTATGCTT TTCTCAAGGA TTGTATCAGA     2150CCATCTGATA GAAAACTAAG TTTCCTTGGG TATACCAAAT ATTTGCATGG     2200TGTGACTATT CGTGGTTCAA GCACAAGACA TCATCGATAA CATGGCTGAT     2250TGGAGCACAC AAGAAGCTCC AAAGGAGAAC AAGAGAGTAC ATTTCTATTC     2300TTTCCTTCTT TTTTCTTGTG CAGAAACAGA AAGTGTTAAA CTATCTGTTG     2350TCAAAGATAT TTCGATTCAT GTTGTGAGGA TACGATCCTT ATTCTTTAGA     2400ATTAGTGATT TGGGTTTTGT ATCGTTGTAA TAGATTTTAT GTTTTTTGGG     2450GGGAAGAAAA CTTCAGGAGA GCGAAACATG CTGATTGTCA TTCTGAAGCT    2500TAAAAAGTTA ATTCCTCTGC AAAAAAAAAA                          2530<210>2<211>599<212>PRT<213>烟草<400>M  G  H  C  C  S  K  G  V  T  A  D  N  D  G  H           16V  V  S  V  V  D  G  N  S  S  V  S  T  N  N  R           32P  K  P  S  P  S  P  A  R  P  Q  S  V  G  N  G           48T  S  Y  T  N  N  N  T  P  A  H  S  F  T  T  S           64P  F  Q  S  P  Y  P  A  G  I  P  P  S  P  S  P           80V  G  T  P  R  R  K  F  R  W  P  F  P  P  P  S           96P  A  K  P  I  L  S  A  I  L  K  R  Q  G  T  T           112S  A  K  P  K  E  G  P  I  P  E  D  E  G  G  E           128G  E  R  Q  L  D  K  S  F  G  Y  P  K  N  L  T           144A  K  I  R  L  G  K  F  V  G  R  G  H  F  G  H           160T  C  W  A  K  G  K  K  G  E  L  K  N  Q  P  V           176A  V  K  I  I  S  K  A  K  M  T  T  A  I  S  I           192E  D  V  R  R  E  V  K  I  L  K  A  L  S  G  H           208Q  N  L  V  K  F  Y  D  A  F  E  D  A  N  N  V           224Y  I  V  M  E  L  C  E  G  G  V  L  L  D  R  I           240L  S  R  G  G  R  Y  T  E  E  D  A  K  S  I  L           256V  Q  I  L  N  V  V  A  F  C  H  L  Q  G  V  V           272H  R  D  L  K  P  E  N  F  L  F  T  K  K  E  E           288D  A  P  M  K  V  I  D  F  G  L  S  D  F  I  R           304P  D  Q  R  L  N  D  I  V  G  S  A  Y  Y  V  A           320P  E  V  L  H  R  S  Y  S  I  E  A  D  M  W  S           336I  G  V  I  T  Y  I  L  L  C  G  S  R  P  F  W         352A  R  T  E  S  G  I  F  R  S  V  L  R  A  D  P         368N  F  E  D  S  P  W  P  S  V  S  A  E  A  R  D         384F  V  K  R  L  L  N  K  D  H  R  K  R  M  T  A         400S  Q  A  L  A  H  P  W  L  R  T  E  N  P  V  L         416P  L  D  I  L  I  F  K  L  V  K  S  Y  T  R  A         432S  P  L  K  R  A  A  L  K  A  L  S  K  A  L  T         448E  E  E  L  I  Y  L  R  A  Q  F  V  L  L  E  P         464K  D  G  R  V  S  L  N  N  F  K  M  A  L  T  K         480Q  M  T  D  A  M  R  E  S  R  V  F  D  I  L  N         496L  M  E  P  L  S  Y  K  P  L  D  F  E  E  F  C         512A  A  A  I  S  T  Y  Q  L  E  A  L  E  N  W  E         528Q  I  A  S  A  A  F  E  H  F  E  Q  E  G  N  R         544V  I  S  V  E  E  L  A  Q  E  M  N  L  G  P  T         560A  Y  A  F  L  K  D  C  I  R  P  S  D  R  K  L         576S  F  L  G  Y  T  K  Y  L  H  G  V  T  I  R  G         592S  S  T  R  H  H  R  *                                 599