在丝状真菌中发挥作用的调控序列和表达体系

摘要

本发明提供在属于无孢纲(Agonomycetes)的丝状真菌、特别是在无孢菌类(Mycelia sterilia)中能够与内源基因的表达协同发挥作用的启动子和终止子。上述启动子含有序列号1所示的核苷酸序列或其同系物。上述终止子含有序列号2所示的核苷酸序列或其同系物。本发明还提供在丝状真菌中高效表达目的蛋白的表达载体,能够高效生产目的蛋白的转化丝状真菌,以及由转化丝状真菌生产目的蛋白的方法。

说明书

                      技术领域

本发明涉及在丝状真菌中发挥作用的启动子和终止子，含有它们的表达载体，以及用该载体转化的宿主。

                     背景技术

丝状真菌PF1022菌株(无孢菌类，Mycelia sterilia)(FERM BP-2671)产生具有驱虫活性的24员环状缩肽PF1022物质。该菌株由于不能形成有性和无性的生殖器，分类上归于无孢纲(Agonomycetes)(特开平3-35796)。

通过将连接了抗药性基因和来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的高淀粉酶基因的质粒导入PF1022菌株，可以获得PF1022菌株的转化体(WO97/00944号)。

而WO97/00944号公报所示的来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的高淀粉酶基因的调控DNA序列是来自异源菌株的调控DNA序列。而且无孢菌类(Mycelia sterilia)其遗传学上的特性不十分清楚，适于表达载体体系的条件也不清楚。因此，有关使用来自异源菌株的调控序列的转化体是否能与存在于PF1022菌株的基因表达进行协同表达调控还不清楚。另外，由于PF1022菌株属于无孢纲，因此对曲霉(Aspergillus)属以外的木霉(Trichoderma)属、镰刀霉(fusarium)属以及链孢霉(Neurospora)属等中使用的以往的调控DNA序列是否适于表达调控同样不清楚。

由此，希望确立能够在无孢菌类中稳定发挥作用的调控序列以及表达载体体系，以及在利用它们的、在无孢菌类中生产有用物质的生产技术。

                       发明概述

本发明的目的在于，提供在属于无孢纲的丝状真菌、特别是在无孢菌类(Mycelia sterilia)中能够与内源基因的表达协同发挥作用的调控序列。

本发明的第二个目的在于，提供在属于无孢纲的丝状真菌、特别是在无孢菌类(Mycelia sterilia)中高效表达目的蛋白的表达载体。

本发明的第三个目的在于，提供能够高效生产目的蛋白的、转化的属于无孢纲的丝状真菌、特别是无孢菌类(Mycelia sterilia)。

本发明的第四个目的在于，提供在属于无孢纲的丝状真菌、特别是在无孢菌类(Mycelia sterilia)中制造目的蛋白的方法。

本发明人等在分离、鉴定可在PF1022菌株中高效表达的基因(Abp1基因)及其调控DNA序列方面获得了成功。

另外，本发明人在使用获得的调控DNA序列，构建基因表达用的表达载体，并将其导入PF1022物质生产菌，获得转化体，使连接在启动子下游的目的基因在不损害其功能的同时进行有效表达方面也获得了成功。

本发明的启动子是含有选自以下序列构成的组的核苷酸序列的启动子，以及具有启动子活性的该核苷酸序列片段。

(a)序列号1的核苷酸序列，

(b)与序列号1的核苷酸序列至少具有70％的同源性，而且具有启动子活性的核苷酸序列，

(c)序列号1的核苷酸序列的修饰体，该序列具有1个以上选自置换、缺失、附加和插入的修饰，而且具有启动子活性，

(d)在严格条件下与序列号1的核苷酸序列杂交，而且具有启动子活性的核苷酸序列。

本发明的终止子是含有选自以下序列构成的组的核苷酸序列的终止子，以及具有终止子活性的该核苷酸序列片段。

(e)序列号2的核苷酸序列，

(f)与序列号2的核苷酸序列至少具有70％的同源性，而且具有终止子活性的核苷酸序列，

(g)序列号2的核苷酸序列的修饰体，该序列具有1个以上选自置换、缺失、附加和插入的修饰，而且具有终止子活性，

(h)在严格条件下与序列号2的核苷酸序列杂交，而且具有终止子活性的核苷酸序列。

本发明的表达载体是含有上述启动子或其片段和上述终止子或其片段两者或任一方的表达载体。

本发明的转化宿主是用上述表达载体转化的宿主。

本发明的目的物质的制造方法，包括培养上述转化宿主，然后从培养物中提取目的蛋白质的步骤。

                 附图的简单说明

图1表示含有Abp1基因的6kb的Hind III片段的限制酶图谱。

图2表示pABPd的结构及其限制酶图谱。

                发明的具体实施方案微生物保藏

PF1022菌株于1989年1月24日委托通商产业省工业技术院生命工程工业技术研究所(日本国茨城县筑波市东1丁目1-3号)保藏，保藏编号为FERM BP-2671。调控序列

本发明提供在PF1022生产菌中发挥作用的调控序列，即，启动子和终止子。

在序列(b)中，与序列号1的核苷酸序列的同源性优选至少为80％，更优选至少为90％，最优选至少为95％。

在序列(f)中，与序列号2的核苷酸序列的同源性优选至少为80％，更优选至少为90％，最优选至少为95％。

在序列(c)和(g)中，修饰的核苷酸数目例如可以为1～数十个。

在序列(c)和(g)中，存在多个修饰时，导入的修饰的种类可以相同也可以不同。

在序列(d)和(h)中，“严格条件”是指杂交后膜的洗涤操作在高温、低盐浓度溶液中进行，例如0.5×SSC浓度(1×SSC：15mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠)、于60℃、15分钟的洗涤条件，优选在0.5×SSC浓度、0.1％SDS溶液中，于60℃、15分钟的洗涤条件。

具有启动子活性的片段，其长度至少为600碱基对，优选至少为800碱基对，更优选至少为1000碱基对，最优选至少为1200碱基对。

具有终止子活性的片段，其长度至少为400碱基对，优选至少为600碱基对，更优选至少为800碱基对，最优选至少为1000碱基对。

就序列(b)、(c)、(d)以及具有启动子活性的片段是否“具有启动子活性”，例如可以通过构建实施例3所述的表达载体，如实施例4所述的那样将异源基因在宿主中表达，并通过检测异源蛋白的生成来进行评价。

就序列(f)、(g)、(h)以及具有终止子活性的片段是否“具有终止子活性”，例如可以通过构建实施例3所述的表达载体，如实施例4所述的那样将异源基因在宿主中表达，并通过检测异源蛋白的生成来进行评价。

本发明的启动子和终止子可以在无孢纲的丝状真菌、特别是菌丝体类(Mycelia)微生物，更具体来说可以在无孢菌类(Myceliasterilia)微生物中发挥作用。

本发明的启动子和终止子可以在PF1022生产菌中发挥作用。作为PF1022生产菌，例如生产PF1022物质的、分类上归于无孢纲的丝状真菌。

本发明的启动子和终止子例如可以通过以下操作获得。

从产生PF1022物质时的细胞分离PF1022株的mRNA，以它作为模板，合成cDNA。对其进行随机筛选，进行碱基序列解析，对表达频率高的基因，即，来自Abp1基因的cDNA进行分离。

从PF1022株提取基因组DNA，用适当的限制酶酶切后，使用噬菌体载体或质粒载体，构建由PF1022物质生产菌的基因组DNA组成的文库。

用编码Abp1基因的翻译区作为探针，从来自PF1022株的上述基因组DNA文库克隆全长Abp1基因。对纯化的基因组DNA和上述cDNA碱基序列进行比较研究，确定该基因的启动子和终止子部位，作为启动子和终止子。表达载体

本发明提供含有可在PF1022物质生产菌中发挥作用的调控序列的表达载体。

本发明的表达载体的构建程序和方法可以使用基因工程领域中惯用的程序和方法。

作为可用于本发明的表达载体，例如整合在宿主染色体DNA的载体，以及以质粒状态存在于宿主细胞内的具有可自主复制的自主复制序列的载体，如pUC系列(pUC18或pUC118等)、pBluescript系列(pBluescript II KS+等)以及pBR322等质粒。在宿主细胞内存在的基因的拷贝数可以是1个，也可以有多个。

根据本发明的第一种实施方案，本发明的载体含有本发明的启动子和/或终止子，根据需要还可含有基因筛选标记和/或其它调控序列。因此，含有本发明的启动子或终止子两者或者任一方的表达载体都包括在本发明的范围之内。

至少含有本发明的启动子的表达载体，终止子可以是本发明终止子以外的终止子。

至少含有本发明的终止子的表达载体，启动子可以是本发明启动子以外的启动子。

基因筛选标记的导入可以通过以下操作进行，例如利用PCR方法将适当的限制酶切位点导入本发明的调控序列中，将其插入质粒载体后，连接上抗药性基因和/或营养缺陷型基因等筛选标记物基因。

基因筛选标记物可以根据转化体的筛选方法适当地选择，例如可以使用抗药性基因或营养缺陷型基因。作为抗药性基因，例如越霉素、苯菌灵、寡霉素、潮霉素、G418、博莱霉素、bialaphos、杀稻瘟菌素S、腐草霉素、phosphinothricin、氨苄青霉素、卡那霉素等药物的抗药性基因。作为营养缺陷型基因，例如amdS、pyrG、argB、trpC、niaD、TRP1、LEU2、URA3等基因。

根据本发明的第二种实施方案，本发明的表达载体还可以含有与调控序列连接的、编码目的蛋白的核苷酸序列，且该蛋白基因的表达可受到上述调控序列的调控。

与调控序列的连接，例如可以按照常规方法，将目的蛋白的编码基因(目的基因)的翻译区按照正确方向插入到启动子的下游。此时，也可以将目的基因与编码其它蛋白质的翻译区的外源基因连接，并以融合蛋白形式表达。本说明书中的“目的基因”是指作为表达对象的任何基因，可以是异源基因，也可以是同源基因。目的基因例如可以是选自PF1022物质生产相关基因组的基因。转化体和目的蛋白的生产

本发明还提供用上述表达载体转化的宿主。

可用于本发明的宿主只要是可用作基因重组宿主的微生物，就没有特别限定，例如丝状真菌，优选属于无孢纲的丝状真菌，更优选属于菌丝体类(Mycelia)的微生物，最优选属于无孢菌类(Myceliasterilia)的微生物。可用于本发明的宿主还可以是PF1022物质生产菌，优选生产PF1022物质的丝状真菌，更优选生产PF1022物质的PF1022菌株(FERM BP-2671)。

将基因表达用的重组载体导入宿主，可以按照常规方法进行。作为导入方法，例如电穿孔法、聚乙二醇法、土壤杆菌法、锂盐法或氯化钙法等，可根据宿主细胞选择有效的方法。使用PF1022物质生产菌作为宿主时，优选使用聚乙二醇法。

本发明提供包括培养上述转化体步骤在内的目的蛋白的制造方法。

转化体的培养按照常规方法，选择合适的培养基、培养条件来进行。作为培养基可以使用惯用的成分，例如作为碳源可以使用葡萄糖、蔗糖、纤维素、麦芽糖、糊精、淀粉、甘油、糖蜜、动植物油等。另外，作为氮源可以使用大豆粉、小麦胚芽、药物介质(pharma media)、玉米浸渍液、棉子渣、牛肉汤、蛋白胨、聚胨、麦芽提取物、酵母提取物、硫酸铵、硝酸钠、尿素等。根据需要还可添加能够生成钠、钾、钙、镁、钴、氯、磷酸根、磷酸根以及其它离子的无机盐类，例如可添加氯化钾、碳酸钙、磷酸氢二钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、硫酸锌、硫酸锰、硫酸铜。另外，根据需要也可以添加硫胺素(硫胺素盐酸盐等)等各种维生素，谷氨酸(谷氨酸钠等)、天冬酰胺(DL-天冬酰胺等)等氨基酸，核苷酸等微量营养素，抗生素等筛选药物。另外，可以适当添加有助于细菌发育、促进环状缩肽生产的有机物和无机物。

使用液体培养基时，培养方法可以采用需氧条件下的培养法、振荡培养法、通气搅拌培养法或深部培养法。培养基的pH例如为pH6～pH8左右。培养温度为通常条件，例如14℃～40℃，优选26℃～37℃，培养天数为2天～25天左右。

本发明的目的蛋白的制造方法中，可以从转化细胞的培养物中获得作为目的基因表达产物的蛋白质。可以从培养物中提取目的蛋白(磨碎处理、加压破碎等)，进行回收(过滤、离心分离)、以及进行纯化(盐析法、溶剂沉淀法等)。另外在这些过程中，根据需要可以添加苯甲基磺酰氟(PMSF)、苯甲脒或亮肽素等蛋白酶抑制剂。

                        实施例

以下结合实施例详细说明本发明，但本发明并不限定于这些实施例。实施例1：通过cDNA的随机测序寻找高表达基因

为了寻找在PF1022物质生产菌中高效表达的基因，对来自PF1022物质生产菌的cDNA随机进行克隆，比较它们的DNA序列，对可大量表达的基因进行分离、鉴定。(1)来自PF1022物质生产菌的cDNA的制备

PF1022菌株(FERM BP-2671)用生产培养基(葡萄糖2.0％、淀粉5.0％、小麦胚芽0.8％、大豆饼1.3％、肉提取物0.38％、氯化钠0.13％、以及碳酸钙0.15％，灭菌前pH为7.0；参照WO97/00944号实施例4)，于26℃、培养4天，通过离心分离(3000rpm、10分钟)回收菌体。用纯化水洗涤菌体，于-80℃冷冻后，液氮存在下用搅拌机(日本精机公司制AM-3)粉碎菌体。然后悬浮于变性溶液(4M硫氰酸胍、25mM柠檬酸三钠、0.5％N-月桂基肌氨酸钠、0.1M巯基乙醇)，于室温搅拌5分钟后，用2M乙酸钠(pH4.5)中和，加TE饱和酚，再进行搅拌。向其中加氯仿-异戊醇(24∶1)，搅拌后，通过离心分离分离出用酚变性的菌体成分。回收上层(水相)，用异丙醇使核酸沉淀。将该沉淀溶解于TE(10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA)，并使核酸浓度为1mg/ml，用2.5M氯化锂进行沉淀(5℃、2小时)。通过离心回收沉淀，用70％乙醇洗涤后，再溶解于TE中，作为总RNA组分。

使用mRNA纯化试剂盒(Amersharm Pharmacia公司制)从总RNA组分中纯化mRNA。再以该mRNA为模板，用TimeSaver cDNA合成试剂盒(Amersharm Pharmacia公司制)合成cDNA。(2)cDNA的随机测序

实施例1(1)制备的cDNA经EcoRI酶切后，使用DNA连接试剂盒Ver.2(宝酒造公司制)与碱性磷酸酶处理的pUC18连接。将其导入大肠杆菌JM109株，于含有氨苄青霉素的LB培养基中(1％聚胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠)培养转化的各种菌落。用Flexi Prep试剂盒(Amersharm Pharmacia公司制)从这些转化体中纯化质粒。

将制备的上述40种质粒用ALF DNA测序仪II(AmersharmPharmacia公司制)进行测序，解读插入片段的DNA序列。测序胶使用Long Ranger(FMC公司制)，测序反应使用AutoRead测序试剂盒(Amersharm Pharmacia公司制)。

结果表明，10种克隆具有相同的DNA碱基序列。将克隆的基因命名为Abp1，从基因组DNA中对该基因的启动子和终止子进行克隆。(3)PF1022物质生产菌的基因组DNA的分离

PF1022菌株(FERM BP-2671)的基因组DNA的分离依据(H.Horiuchi et al.，J.Bacteriol.，170，272-278，(1988))所述的方法进行。具体来说，首先将PF1022物质生产菌(FERM BP-2671)用种子培养基(可溶性淀粉2.0％、葡萄糖1.0％、聚胨0.5％、小麦胚芽0.6％、酵母提取物0.3％、大豆饼0.2％、以及碳酸钙0.2％，灭菌前pH为7.0；参照WO97/00944号实施例1)培养2天，通过离心分离(3500rpm，10分钟)回收菌体。然后，将得到的菌体冷冻干燥后，悬浮于TE中，于3％SDS溶液中，在60℃下处理30分钟，之后用TE饱和酚萃取，除去菌体残渣。萃取液用乙醇沉淀后，经核糖核酸酶A(Sigma公司制)和蛋白酶K(和光纯药公司制)处理，再用12％聚乙二醇6000沉淀核酸。该沉淀用TE饱和酚进行萃取、乙醇沉淀，将获得的沉淀溶解在TE中，作为基因组DNA。(4)PF1022物质生产菌的基因组文库的构建

用Sau3AI对实施例1(3)制备的PF1022物质生产菌的基因组DNA进行部分消化。然后用T4连接酶(宝酒造公司制的连接试剂盒Ver.2)将消化后的片段与噬菌体载体、λEMBL3克隆试剂盒(Stratagene公司制)的BamHI臂进行连接。将其用乙醇沉淀后，溶解于TE。用GigapackIII Plus Packaging试剂盒(Stratagene公司制)将全部连接混合物感染大肠杆菌LE392株，使其形成噬菌斑。利用该方法获得的1.3×10⁴个(2.6×10⁴PFU/ml)噬菌体文库克隆Abp1基因。(5)从PF1022物质生产菌的基因组DNA克隆Abp1基因

用PCR法扩增Abp1基因的翻译区，并作为探针。以实施例1(3)制备的基因组DNA为模板，使用8-73U和8-73R组成的合成引物，利用LETS GO PCR试剂盒(Sawady Technolgiy公司制)进行PCR。PCR的反应条件以94℃ 30秒、50℃ 30秒、72℃ 90秒为一个循环，通过进行25个循环来扩增。以下给出了8-73U和8-73R的DNA序列。8-73U：CTCAAACCAGGAACTCTTTC(序列号7)8-73R：GACATGTGGAAACCACATTTTG(序列号8)

用ECL Direct System(Amersharm Pharmacia公司制)对得到的PCR产物进行标记。将实施例1(4)制备的噬菌斑印迹到Hybond N+尼龙转移膜(Amersharm Pharmacia公司制)，碱变性后，用5倍浓度SSC(SSC：15mM柠檬酸三钠、150mM氯化钠)洗涤，干燥并固定DNA。按照试剂盒说明书所述的方法，进行1小时预杂交(42℃)后，加入先前标记的探针，进行16小时杂交(42℃)。按照上述试剂盒说明书所述的方法洗涤探针。洗涤探针后，将尼龙膜在检测溶液中浸渍1分钟，用医用X光片(富士胶片公司制)感光，得到1个阳性克隆。southern解析该克隆，结果表明，至少6kb的Hind III片段与基因组的限制酶片段的长度一致。图1给出了该Hind III片段的限制酶图谱。将Hind III片段亚克隆于pUC119(pRQHin/119)，供下面的实验使用。实施例2：Abp1基因的启动子和终止子DNA序列的测定

用SalI和SmaI消化DNA序列解析用模板pRQHin/119，并与用相同酶消化的pUC18连接，作为DNA序列解析用模板。DNA序列解析同实施例1(2)。然后，与实施例1(2)得到的cDNA碱基序列进行比较，测定Abp1基因的启动子和终止子区，它们的DNA序列分别示于序列表序列号1和序列号2。实施例3：利用Abp1基因的表达调控区构建表达载体

以pRQHin/119为模板，通过PCR法扩增Abp1基因的启动子和终止子区。启动子的扩增使用由ABP-Neco和ABP-Nbam组成的引物，终止子的扩增使用由ABP-Cbam和ABP-Cxba组成的引物，通过PCRSuper Mix High Fidelity(Lifetech Oriental公司制)进行PCR。反应条件以94℃30秒、50℃30秒、72℃90秒为一个循环，反复进行25个循环进行扩增。以下给出了ABP-Neco、ABP-Nbam、ABP-Cbam和ABP-Cxba的DNA序列。ABP-Neco：GGGGAATTCGTGGGTGGTGATATCATGGC(序列号3)ABP-Nbam：GGGGGATCCTTGATGGGTTTTGGG(序列号4)ABP-Cbam：GGGGGATCCTAAACTCCCATCTATAGC(序列号5)ABP-Cxba：GGGTCTAGACGACTCATTGCAGTGAGTGG(序列号6)

各PCR产物用Microspin S-400柱(Amersharm Pharmacia公司制)进行纯化，乙醇沉淀后，启动子用EcoRI和BamHI消化，终止子用BamHI和XbaI消化，依次与用相同酶消化的pBluescript II KS+连接。将其用XbaI消化，插入来自pMKD01(WO 98/03667号)的抗越霉素组件，构建pABPd(图2)。实施例4：利用β-葡萄糖醛酸酶基因确认表达载体的能力

用BamHI对pLC-GUS(K.Yanai，et al.，Biosci.Biotech.Biochem.，60，472-475，(1996))进行酶切，得到作为报告基因的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因翻译区。然后与预先用BamHI消化、碱性磷酸酶处理的pABPd连接，在Abp1启动子下游插入GUS基因，构建pABPd-G。

按照WO 97/00944号的实施例1所述的方法，用pABPd-G转化PF1022物质生产菌(FERM BP-2671)。结果，1μg的DNA大约得到3个转化体。

上述得到的转化体用实施例1(1)的生产培养基进行液体培养，通过离心分离回收菌体。得到的菌体用Mini Bead搅拌器(BiospeckProducts公司制)破碎细胞。将其离心分离，除去菌体残渣，测定上清的GUS活性。活性测定按照(K.Yanai，et al.，Biosci.Biotech.Biochem.，60，472-475，(1996))所述的方法进行。

测定结果如表1所示，可以确认只有pABPd-G转化体表现出显著的GUS活性。即，可以确认该表达载体pABPd在PF1022物质生产菌中能有效地发挥作用。

                表1：转化体的GUS活性

                                          GUS活性

                        表达载体       (A405/μg蛋白)

        转化体          pABPd-G            756.9

        转化体          pABPd-G            832.5

        转化体          pABPd              0.0

        宿主            -                  0.0

                               序列表<110>明治制果株式会社(Meiji Seika kaisha，Ltd.)<120>在丝状真菌中发挥作用的调控序列和表达体系<130>127109<150>JP 252851/1999<151>1999-09-07<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1378<212>DNA<213>无孢菌类(Mycelia sterilia)<400>1gtcgacgtgg gtggtgatat catggctgtg gtgtccaaaa ctgtgttagt gactacgaat 60gaggaaagaa acggtggtgt tgtggcagct gaagactgaa gaaggagcca aagataattc 120acaatgcgat acggttgcat caatgcttgt tcaagagagc acgttgcatc tacctggtgt 180tcccctcttc gttgtacaag atcaagtatc ggatgacacc caccccgcaa cggaatcctg 240gagttcaaag agggtgtcgt ctacggcatt taggtataga tggcataggg tttgacgtaa 300gctgaaagct gattacgaga catgagacaa cgaaaataca acggttgtat gcgttcccgt 360gcttactaaa gtgatatcca agagcaacac agccgaaaga aaccgatgct gtctgagggg 420ttcctttaga gtctacatgg taacggtgca tgatagaaac atcaaatggc caatcaagtt 480agtatacctg acgctacatc gctttcttcc ggatcttgcc taaaatatat gtgcctgtcc 540gaactgtcgg tactgcttcg tactaactgt tcttccgttg aagtcctagg acaagcgccg 600cgtttgtaga cctacatgat gccacatctt aaagcaggga tctgagacat tttctaaggc 660atccatatag gcattgggcg ctaagtcggc attgaaggag ataagggggg tgtgaaagtg 720gtgtgtcaaa aggaggtcga ttggctatac cagccgctaa gcaggtgggc tagcagctgt 780ctgcagctgt gaataacgtc acttgcttag gtatgtccac ctaatgtcag cagatgcaaa 840tgctgattgg gttaaaatgg gcatgtagtg taggtgccga aaacacgttt agatctagtt 900aaagggaagc tgaaagctga acctgtcaga aataagcctg ttggaataca acgttgataa 960cccaattcag tcgtcaaggg tgtcctgata tgctggagct tccctgtcgc attgtggggt 1020aactatttca tagtggggca gaatgcaact ctattttcaa ttgaatctaa actattctgg 1080gtaggagttc tcaatggtct tctcgctgtc acttacacac atcatggggg tcaacaacgt 1140atacagcttc atagagagtg cggcattgaa gtagctaccg catcgaaccc ggaagcggtt 1200caagacatgg gcgtacgtag atacatagag tcatagaaac ataaaaggag cttgaagaac 1260cattcaaatc ctaagggtct ctcttctttc tgcatcacat caagaatcat acactcaaac 1320caggaactct ttctatcttc cctatagcaa ttcccaaaac ccatcaatca acctaaca   1378<210>2<211>1089<212>DNA<213>无孢菌类(Mycelia sterilia)<400>2taaactccca tctatagcgg ttggctgaaa agggagagcg gcaggagaga tcagtctttt 60gaccagcttg gagatctgat ctgtgtttca gtctcagtaa cttgtgtgga agttacactt 120ctggtctccc tccttaccag ccctccaggc caaccacaag atgttaggag tttcgctcat 180ttatatggct ctggcgatga gtagcattta tgaggcatgc acgacatggc tctactgctg 240ctctgttggt taggttacct tagctagaca atatcacaat acaaaatgtg gtttccacat 300gtcagctggt tctaccgtag tctgagtgaa atgggtaatt gatatattga gcttgacccc 360gcaatattgt aacagagcca acaatgggtc acctggcccc ccagacatgt ggctatataa 420gctacctgtc tagcaatcag acttactgat agaacgtccc cctatatgtc ataaaataag 480tcactactag aactaccgac agtgtgaaat ccgacagtgt ctggtctgtt gaacatgtca 540tgtctatatg aatgaataag aagaaggtgt gacgggttag tacgaatctg tatgataatc 600aatggtagca gtgatggtaa acagcggatc gggatctagc actgctatgt ctgggtatgt 660aatcctggct atgttcataa gggcgacata gaaagaatac ctcagtgtca gcatacgtaa 720gctctgtaca tttcactgca aatttctgaa caattggaga gcattatgaa atactaaatg 780gaactcctca ttataagtgg aaaacagagc gcccttttat tatgaaacag aagcgtcaag 840aacgtctttc aacgtcatca gaggcgttcc atccagatca tactttccct tgaaccatgt 900tctcgcattc agaatcgtag cgatggaaac cgtccagggt tgcctgtcat tcccttgcgt 960cccttgcaat aaaatcgtat taccattttc tttcgcagcg ccggtcaacg tgagcgacgt 1020gcccacgttg gagtccacaa tgaccagtgg atcgtcatcc acgccactca ctgcaatgag 1080tcgcccggg                                                         1089<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于扩增Abp1基因的引物<400>3ggggaattcg tgggtggtga tatcatggc                                   29<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于扩增Abp1基因的引物<400>4gggggatcct tgatgggttt tggg                                           24<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于扩增Abp1基因的引物<400>5gggggatcct aaactcccat ctatagc                                        27<210>6<211>29<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于扩增Abp1基因的引物<400>6gggtctagac gactcattgc agtgagtgg                                      29<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于扩增Abp1基因的引物<400>7ctcaaaccag gaactctttc                                                  20<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列(Artificial Sequence)<220><223>人工序列的描述：用于扩增Abp1基因的引物<400>8gacatgtgga aaccacattt tg                                               22