瑞氏木霉纤维二糖水解酶(CBHⅠ)丝状真菌表达体系的构建

摘要

结晶纤维素的降解是提高纤维素利用效率的关键之一。瑞氏木霉可以分泌产生高效降解结晶纤维素的酶系，其中纤维二糖水解酶(CBH I)约占其胞外分泌总蛋白的60％。CBH I能够从结晶纤维素的还原端连续催化形成纤维二糖，是高效降解结晶纤维素的重要的酶组分。但现有纤维素酶作用于天然纤维素高分子底物时，酶解效率较低，难以满足工业化转化的需要。随着基因工程和蛋白质工程的发展，利用定点突变等方法研究纤维素酶的催化关键氨基酸及催化机制，分析酶解效率的限制性因素，可以为提高纤维素的酶解效率提供理论基础。
　　 瑞氏木霉纤维二糖水解酶双结构域的结构组成，在分泌过程中的翻译后修饰及其复杂的折叠过程被认为是纤维二糖水解酶异源表达困难的主要原因。研究表明，大肠杆菌和酵母菌都不是纤维二糖水解酶表达的合适宿主。在大肠杆菌中缺乏必要的翻译后修饰，表达容易形成包涵体。而在酵母中存在过度糖基化问题，表达的纤维二糖水解酶的活性较低。哺乳动物表达系统存在重组蛋白表达量低，培养时间长及成本昂贵等问题。纤维素酶特别是纤维二糖水解酶的高效异源表达一直是制约其结构/功能关系深入研究的瓶颈。丝状真菌具有很高的蛋白分泌能力，具有高效的蛋白折叠分泌体系。因此，丝状真菌可能是包括纤维二糖水解酶在内的纤维素酶良好的表达宿主。
　　 本文通过在黑曲霉和瑞氏木霉中重组表达纤维二糖水解酶(CBH I)，从而尝试建立重要纤维素酶组分的高效丝状真菌表达体系。本文首先构建了黑曲霉高效转化体系，研究了影响黑曲霉原生质体制备的裂解酶，培养方式及菌龄等因素。结果表明，Lysing Enzyme可以用来有效地制备瑞氏木霉原生质体，但是对黑曲霉的细胞壁几乎没有裂解作用。Cellulase的作用同样很微弱，而Snailase可以裂解黑曲霉产生少量原生质体(～104/ml)。Lywallzyme可以裂解黑曲霉细胞壁，释放大量原生质体(～107/ml)。利用Lywallzyne和Snailase混合酶系统制备黑曲霉原生质体效果最佳。黑曲霉液体培养极易形成菌丝球，不利于原生质体的制备。高速振荡培养(300 rpm)和静置培养都可以得到较为松散的菌丝，但是高速振荡培养制备原生质体的效果较静置培养效果好。菌龄是影响原生质体制备的重要因素。研究发现，菌龄为14h制备原生质体数量最多，而菌龄为16h制备的原生质体再生数量最多。幼嫩的菌丝得到原生质体数量较多，但是原生质体较脆弱，再生能力较低，16h制备原生质体效果最佳。综合以上实验，确定黑曲霉原生质体制备的最佳条件为：在渗透压稳定剂(l M山梨酵，10 mMKH2P04-K2HP04 pH5.8)存在下，10 mg/ml Lywanzyme+10 mg/ml Snailase在30℃下作用于300 rpm震荡培养16h的菌丝2h，原生质体的制备效率可达107～108个/ml。我们进一步利用PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法将质粒pAB4-1（含pyrG基因）成功转化黑曲霉MGG029得到转化子，转化率为200个/ug DNA。
　　 在成功构建黑曲霉转化系统的基础上，通过融合PCR的方法将CBH I基因置于黑曲霉强启动子-葡萄糖淀粉酶(glaA)启动子的下游，构建了CBH I在黑曲霉中的表达质粒pAN56-CBH，进一步将黑曲霉pyrG的表达盒连接到pAN56-CBH上获得质粒pAN56-CBH-pyrG，以便于黑曲霉的转化。通过PEG-CaC12介导的原生质体转化方法将CBH I的表达载体pAN56-CBH-pyrG转入黑曲霉MGG029，得到约200株转化子。转化子经过western blot筛选验证得到了CBH I表达的转化子。对重组表达的CBH I进行了初步纯化，其分子量约在58-80kDa之间，以pNPC及Avicel pH101为底物测定酶活表明重组表达的CBHI有活性。
　　 瑞氏木霉和黑曲霉分泌蛋白的糖基化形式有差异，在黑曲霉中表达瑞氏木霉CBH I出现的过度糖基化修饰可能对CBH I的性质会有影响。因此我们还尝试进一步构建瑞氏木霉表达体系。利用组成型启动子丙酮酸激酶启动子(pki)和cbh2终止子构建了在瑞氏木霉中的组成型表达载体pRLMex-CBH I-pyr4，利用PEG-CaC12介导的方法转化尿苷缺陷型的瑞氏木霉宿主TU6。瑞氏木霉转化子经过单孢分离后，PCR验证表明已经整合了重组的cbhl基因。

目录

文摘

英文文摘

缩写词(Abbreviation)

第一章 绪论

1.1 纤维素的微生物降解与纤维素酶

1.1.1 纤维素的性质与结构

1.1.2 纤维素的微生物降解

1.1.3 纤维素酶系组成、性质及降解机制

1.1.4 纤维素酶的转录调控

1.1.5 纤维素酶的应用前景

1.2 瑞氏木霉纤维二糖水解酶

1.2.1 纤维二糖水解酶的结构和功能研究

1.2.2 瑞氏木霉纤维二糖水解酶的表达研究

1.3 丝状真菌转化系统与外源蛋白表达研究进展

1.3.1 丝状真菌转化系统

1.3.2 丝状真菌蛋白表达策略探讨

1.4 本论文研究目的及意义

第二章 黑曲霉原生质体的制备与转化

2.1 实验材料

2.1.1 菌种和质粒

2.1.2 培养基

2.1.3 主要试剂

2.2 实验方法

2.2.1. 菌种保藏技术

2.2.2 孢子悬液制备

2.2.3 引物设计

2.2.4 PCR扩增

2.2.5 原生质体制备及转化

2.2.6 培养方式及菌龄的选择

2.2.7 再生数计算

2.2.8 真菌基因组的提取

2.3 实验结果

2.3.1 不同裂解酶及浓度对黑曲霉原生质体形成的影响

2.3.2 菌丝培养方法及菌龄的选择

2.3.3 黑曲霉原生质体形成过程观察

2.3.4 黑曲霉原生质体的转化

2.4 讨论

本章总结

第三章 黑曲霉中表达CBH I载体的构建

3.1 实验材料

3.1.1 菌种和质粒

3.1.2 培养基

3.1.3 主要试剂

3.2 实验方法

3.2.1. 菌种保藏技术

3.2.2 大肠杆菌感受态制备

3.2.3 大肠杆菌DH5a转化

3.2.4 质粒提取

3.2.5 引物设计

3.2.6 PCR扩增

3.2.7 限制性内切酶酶切

3.2.8 PCR及酶切DNA片段的回收

3.2.9 连接反应

3.210 重组质粒的筛选与鉴定

3.211 琼脂糖凝胶电泳技术

3.3 实验结果

3.3.1 葡萄糖淀粉酶glaA启动子的PCR扩增

3.3.2 cbhl基因的扩增

3.3.3 CBH I -HA-His平末端克隆到pUCl9

3.3.4 glaA启动子与cbhl基因的融合

3.3.5 融合片段(glaA-pr-CBH I)与pAN56-2载体的连接

3.3.6 pyrG表达盒与pAN56-CBH的连接

3.4 讨论

本章小结

第四章 重组转化子的鉴定与重组CBH I的初步纯化

4.1 实验材料

4.1.1 菌种和质粒

4.1.2 培养基

4.1.3 主要试剂

4.2 实验方法

4.2.1. 菌种保藏技术

4.2.2 孢子悬液制备

4.2.3 黑曲霉原生质体的制备及转化

4.2.4 黑曲霉染色体DNA的提取

4.2.5 PCR体系和反应程序同2.2.4

4.2.6 蛋白样品浓缩

4.2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS.PAGE)

4.2.8 黑曲霉转化子的复筛、单孢分离及鉴定

4.2.9 Western Blot检测

4.2.10 发酵液的获得和预处理

4.2.11 分子筛层析

4.2.12 离子交换柱层析

4.3 实验结果

4.3.1 目的基因整合率及转化子的分析鉴定

4.3.2 重组表达转化子的筛选

4.3.3 转化子的单孢分离和纯化

4.3.4 CBH I的初步纯化

4.4 讨论

本章小结

第五章 CBH I瑞氏木霉表达体系的构建

5.1 实验材料

5.1.1 菌种和质粒

5.1.2 培养基

5.1.3 主要试剂

5.2 实验方法

5.2.1 菌种保藏技术

5.2.2 瑞氏木霉孢子悬液制备

5.2.3 PCR体系和反应程序，限制性内切酶酶切等分子克隆技术

5.2.4 引物设计

5.2.5 瑞氏木霉原生质体的制备及转化

5.2.6 瑞氏木霉染色体DNA的提取

5.2.7 蛋白样品浓缩

5.2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS.PAGE)

5.2.9 瑞氏木霉转化子的复筛、单孢分离及鉴定

5.2.10 Western Blot检测

5.3 实验结果

5.3.1 瑞氏木霉pyrG表达盒的获取和连接

5.3.2 cbhl基因的连接

5.3.3 瑞氏木霉TU6的转化及转化子的鉴定

5.4 讨论

本章小结

总结及展望

参考文献

致谢

学位论文评阅及答辩情况表