黄金矿藏勘探的微生物检测方法

摘要

本发明公开了一种黄金矿藏勘探的微生物检测方法,该方法先将蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)孢子免疫注射家兔5次,制成第一抗体;用第一抗体免疫注射雄性山羊5次,制成第二抗体;然后将第二抗体作为检测黄金矿物样品的主要指示物,检测矿物样品是否含有黄金及含金的品位。可在野外同时对多份矿物样品进行定性、定量及快速、方便地检测,对人畜无害,且不污染环境。

说明书

技术领域：

本发明涉及用生物方法进行地质矿藏勘探，尤其涉及用生物方法进行金属矿藏的勘探，更具体涉及黄金矿藏勘探的微生物检测方法。

背景技术：

目前，黄金矿藏的勘探方法主要是从野外采集大量的岩石、土壤等标本，回实验室后，经过一系列的化学和物理方法处理，再进行检测分析。因采集的标本无法在野外现场进行处理、检测、判断，所以，带回实验室的标本中有不少是无效的，这大大地增加了地质勘探工作者的无效劳动，造成人力、物力和财力的浪费，且用化学方法进行处理将造成一定程度的环境污染。

发明内容：

本发明的目的是提供黄金矿藏勘探的微生物检测方法，该方法可在野外同时对多份矿物样品进行定性、定量及快速、方便地检测，对人畜无害，且不污染环境。

为了实现上述目的，本发明先将蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)孢子免疫注射家兔5次，制成第一抗体；用第一抗体免疫注射雄性山羊5次，制成第二抗体；然后将第二抗体作为检测黄金矿物样品的主要指示物，检测矿物样品是否含有黄金及含金的品位。

黄金矿藏勘探微生物检测方法按下列步骤顺序进行：

a、将蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)孢子在肉汤培养基中培养96小时，离心、去上清，用生理盐水洗沉淀，去上清，如此反复2～3次，沉淀的蜡状芽孢杆菌孢子用超声波破碎器处理，用生理盐水稀释成40mg/ml，按1∶1加福氏完全佐剂；

b、用上述物质免疫注射3～5斤的家兔，第一次用量0.5毫升/只，以后每隔三天注射，用量1毫升/只，5次后，从兔耳静脉抽血，检测抗体效价为1∶320～640时，取兔血，分离抗血清；

c、用50％硫酸铵洗脱一次，取抗血清沉淀，加等量生理盐水，再加入200毫升饱和的硫酸铵，4℃下放置30分钟，离心、去上清；

d、再用40％硫酸铵洗，用c的同样方法，将提取的球蛋白洗脱二次；

e、加入30毫升盐水，再加入20毫升饱和硫酸铵至成40％饱和度，4℃放置30分钟，离心、去上清，此过程重复一次；

f、将球蛋白装入处理过的透析袋中，放置盐水中透析，直到盐水用奈氏佐剂测不出NH₄⁺为止(第一抗体)；

g、从透析袋中取第一抗体按1∶1加入福氏完全佐剂免疫注射雄性山羊，第一次用量1毫升，每隔三天注射一次，每次用量1.5毫升/只，在第五次注射48小时后，从心脏取血检测抗体效价，当抗体效价为1∶320～640时，从山羊的颈动脉取血，4℃无菌保存8～12小时，离心、去沉淀；

h、取200毫升上清液血清加等量生理盐水，再加入200毫升饱和的硫酸铵，4℃下放置30分钟，离心，去上清，取羊血清球蛋白加生理盐水，再加入200毫升饱和的硫酸铵，4℃下放置30分钟，离心、去上清，用40％硫酸铵洗脱二次；

I、将提取的羊球蛋白加30毫升盐水，再加入20毫升饱和硫酸铵至成40％饱和度，在4℃放置30分钟，离心、去上清，此过程重复一次；

j、将提取的羊球蛋白装入处理过的透析袋中，放置盐水中透析，使硫酸铵逐渐向膜处渗出，直到盐水用奈氏佐剂测不出NH₄⁺为止；

k、将透析过的羊球蛋白过柱层析，洗脱收集峰样；

l、将收集的羊球蛋白装在透析袋中，用蒸馏水透析8～12小时，取出透析袋，在袋外加100％固体蔗糖，待蔗糖浸湿后去掉，再加100％固体蔗糖，反复4～10次，即为纯化的羊球蛋白(第二抗体)；

m、用酶联免疫吸附法检测，用酶联检测仪在492nm波长测定各反应孔的OD值，凡检测抗体P/N值小于1.5的为阴性，超过1.5的为阳性，如果检测结果是阳性的，证明样品含黄金，若前n个孔的结果为阳性，则黄金品位的数量级为10^-3+n克Au/吨样品。

与现有的矿物样品检测方法相比：本发明的方法具有安全，灵敏、准确、并可定性，定量，具有较高的实用价值。用本发明的方法检测116份样品，阳性反应有107份，1份为灰色区，7份为阴性，检测结果与物化方法的检测结果完全吻合。

具体实施方式：

首先将蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)孢子在肉汤(LB)培养基中，30℃培养96小时，离心去上清。用生理盐水洗沉淀，去上清，如此反复2～3次，沉淀的蜡状芽孢杆菌孢子用超声波破碎器处理，用生理盐水稀释成40mg/ml，按1∶1加福氏完全佐剂，注射大耳白家兔，家兔重量4斤，第一次免疫注射0.5毫升，以后每隔三天注射，每次1毫升，免疫注射5次后，从兔耳静脉抽血，用双扩散实验检测抗体效价为1∶640时，取兔血分离抗血清。然后用50％硫酸铵洗脱一次，取100毫升抗血清沉淀，加等量生理盐水，再缓慢加入200毫升饱和的硫酸铵，4℃下放置30分钟，每分钟10000转离心10分钟，去上清。用上述同样方法，将提取的球蛋白沉淀用40％硫酸铵洗脱二次。将提取的球蛋白沉淀加30毫升盐水，再边搅拌、缓慢加入20毫升饱和硫酸铵至成40％饱和度，4℃放置30分钟，每分钟10000转离心10分钟，去上清；此过程重复一次。提取的球蛋白沉淀装入处理过的透析袋中，两端扎紧后放置盐水中透析。使硫酸铵逐渐向膜处渗出，3小时换盐水一次，直到盐水用奈氏佐剂测不出NH₄⁺为止(第一抗体)。从透析袋中取出球蛋白沉淀按1∶1的比例加福氏完全佐剂免疫雄性山羊，雄性山羊体重在14公斤，第一次注射1毫升，每隔三天注射一次，每次注射1.5毫升/只，在第五次注射48小时，从心脏取血检测抗体效价，当抗体效价为1∶640时，从山羊的颈动脉取血。4℃无菌保存10小时，4℃下每分钟2000转离心20分钟，去溶血沉淀。取200毫升上清液血清加等量生理盐水，再缓慢加入200毫升饱和的硫酸铵，4℃下放置30分钟，每分钟10000转离心10分钟，去上清，取羊血清球蛋白沉淀再加200毫升生理盐水，再缓慢加入200毫升饱和的硫酸铵，4℃下放置30分钟，每分钟10000转离心10分钟，去上清，羊球蛋白沉淀用40％硫酸铵洗脱二次。将提取的羊球蛋白沉淀加30毫升盐水，再边搅拌、缓慢加入20毫升饱和硫酸铵至成40％饱和度，在4℃放置30分钟，每分钟10000转离心10分钟，去上清，此过程重复一次。提取的羊球蛋白沉淀装入处理过的透析袋中，两端扎紧后放置盐水中透析，使硫酸铵逐渐向膜处渗出，3小时换盐水一次，直到盐水用奈氏佐剂测不出NH₄⁺为止(即为无色透明状)。然后将透析过的羊球蛋白过柱层析，将纤维素(DEAE-Celinlose DE₃₂)用0.1NHCL浸泡30分钟，用蒸馏水洗至中性；然后用0.1NNaOH浸泡30分钟，用蒸馏水洗至中性；如此轮流、反复6次，装柱。用0.005MOL，pH8.0的PB缓冲液以每分钟20滴速度不间断经柱床再从柱下口流出，直到柱内流出液体与下口瓶内PB缓冲液至pH完全一致可加羊球蛋白过柱。用毛吸管加入提纯过的羊球蛋白，量为柱床体积8％。以每分钟20滴的流速开始洗脱收集峰样，将收集的羊球蛋白装在透析袋中，用蒸馏水透析10小时，取出透析袋，在袋外加100％固体蔗糖，待蔗糖浸湿后去掉，再加100％固体蔗糖，反复6次，即为纯化的羊球蛋白(第二抗体)，保存在-70℃下。此第二抗体是本发明用于检测黄金矿物样品的主要指示物。

第二抗体用于检测黄金矿物样品的方法：以微量滴定板作为载体，每个样品用8个孔，用pH9.6NaCO₃-NaHCO₃包被缓冲液将待测蜡状芽孢杆菌孢子抗原倍比稀释，每个孔按倍比稀释加入100微升。阴性对照孔加生理盐水，4℃孵育10小时。用pH值7.4的PBST-20，反复洗涤3次，每次3分钟，沥干后加1％BSA封闭液37℃封闭1小时，再洗脱3次，用保温液(BSA封闭液0.1g；0.05％PBST-20，100ul)稀释的1∶100第二抗体，每孔加入0.1毫升，37℃保温2小时，反复洗涤3次。加入1∶20稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG0.1毫升，室温下保存4小时，反复洗涤3次，再加入0.1毫升邻苯二胺，置暗处显色30分钟，在酶的催化作用下，样品颜色由蓝绿色变成黄色，表明该样品含黄金。每孔加入2MOL的H₂SO₄终止液50微升，静止5分钟，用酶联检测仪在492nm波长测定各反应孔的OD值。检测抗体P/N值为2.1，检测结果为阳性，证明该样品含黄金，前4个孔的结果为阳性，则表明黄金品位的数量级为10克Au/吨样品。