用于哺乳动物基因表达的人杂合宿主细胞

摘要

人/人杂合细胞可通过人胚胎肾细胞(293S)和改良非洲淋巴瘤细胞(2B8)的融合制备。融合细胞可用作重组表达哺乳动物基因的宿主细胞。使用这些称作HKB的人肾－和B－细胞杂合克隆进行哺乳动物基因表达的优势包括(ⅰ)细胞是免疫球蛋白表达阴性的,(ⅱ)细胞在摇瓶或发酵罐中的无血浆蛋白的培养基(添加或不添加重组胰岛素)中作为悬浮培养物容易培养,(ⅲ)细胞极易为DNA转染,以及(ⅳ)细胞分泌高水平异源重组蛋白,如重组单克隆抗体、可溶性ICAM－1、rIL－4和rFVIII。

说明书

相关申请：Cho和Chan的称作MSB-7254(美国系列号09/209,915)的申请“具有EB病毒末端重复序列的载体”和Cho等的称作MSB-7255(美国系列号09/309,916)的申请“因子VIII的表达系统”包含相关主题。两个申请在1998年12月10提交。

发明背景

领域：本发明总体上涉及用于生产生物活性蛋白的遗传工程化的哺乳动物细胞系。具体而言，本发明涉及由人胚胎肾(293S)细胞和非洲淋巴瘤细胞融合而来的人杂合细胞克隆。这些人杂合细胞可用于生产异源蛋白。

背景：迄今为止，多数治疗性重组蛋白由非人哺乳动物细胞生产。一些实例是：

具有可扩增的选择标记二氢叶酸还原酶(Kaufman et al.，1982，Mol.Biol.159：601-621；Gasser et al.，1982，Proc Natl Acad Sci USA 79：6522-6526)的中国仓鼠卵巢(CHO)(dhfr)细胞(Urlaub et al.，1980，Proc NatlAcad Sci USA 77：4216-4220)已被用于生产治疗性重组蛋白。

已知有多种重组治疗性蛋白在哺乳动物细胞中生产，如重组因子VIII(rFVIII)(Kaufman et al.，1988，J Biol Chem 163：6352-6362)、组织纤溶酶原激活物(tPA)(Goeddel等的美国专利4,766,075，1988)、促红细胞生成素(EPO)(1987年授予Lin的美国专利4,703,008)和单克隆抗体(mAbs)(Boss等的美国专利4,816,397，1989)。

幼仓鼠肾(BHK21)细胞在G418选择和氨甲喋呤(MTX)扩增G418抗性细胞后被用于生产rFVIII(Capon等的美国专利4,965,199，1990)。

小鼠骨髓瘤(NSO)细胞被用于生产工程化的人抗TNF抗体(EHAT)(Boss等的美国专利4,816,397，1989)。但是，这种细胞系生产的蛋白具有小鼠特异性碳水化合物谱，这对人用是不利的。

一种人细胞系Namalwa(非洲淋巴瘤来源的)被Wellcome ResearchLaboratory用来生产α干扰素，Tokyo Research Laboratories使用其生产原脲激酶(Satoh et al.，1996，Cytotechnology 18：167-185，1996)、组织纤溶酶原激活物(t-PA)(Khan et al.，1995，Biochem Soc Trans 23：S99)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Okamoto et al.，1991，Arch BiochemBiophys 286：562-568)、干扰素和淋巴毒素(Hosoi et al.，1991，Cytotechnology 5：17-34)以及粒细胞集落刺激因子(Hosoi et al.，1991，Cytotechnology 7：25-32)。但是，这些细胞很难用DNA转染。

Walls等(1989，Gene 81：139-149)报导了在人胚胎肾细胞(293S细胞)中使用dhfr/MTX共扩增策略表达功能性蛋白C。已知293细胞(Stillman et al.，1985，Mol.Cell.Biol.5：2051-2060)在悬浮液中形成大聚集物，特别是在高钙浓度下(＞100μM)，高钙浓度会导致更大的聚集物和更低的细胞活力(Peshwa et al.，1993，Biotech and Bioeng41：179-187)。此处引用的所有参考文献本文引为参考。

发明概述

现已建立了容易通过电转化或阳离子脂质体转染并容易改造适于在悬浮培养物中生长的杂合人细胞克隆。异源蛋白可以使用在人细胞环境中低水平(50-100nM)MTX扩增来表达。此外，该细胞容易改造适于在无血清培养基中生长。

这些细胞是人胚胎肾(293S)细胞和非洲淋巴瘤细胞融合的产物。概况参见图1。这些称为HKB的杂合克隆携带有来自HH514-16的缺陷EBV基因组，HH514-16是来自非洲淋巴瘤细胞P3HR1的细胞系(Hinuma et al.，1967，J Virol 1：1045-1051)。P3HR1细胞携带非永生化的EBV。HH514-16是携带非永生化EBV的P3HR1的克隆(Hinuma etal.，1967，J Virol 1：1045-1051)。HH514-16在克隆过程中失去了激动DNA，即潜伏破坏DNA(Rabson et al.，1 983，Proc Natl Acad Sci USA87：3660-3664)。因此，HKB克隆的EBV是非永生化的病毒，保持在潜伏状态。

HKB是适合重组生产治疗性蛋白的人杂合宿主细胞。这些宿主细胞通过分别具有不同优势特征的不同亲本细胞系的杂交获得。具有每一亲本细胞系的优势特征的宿主细胞由杂交产生的细胞获得。

宿主细胞可以经遗传工程改造来高水平表达多种蛋白。可通过工程化的宿主细胞生产的蛋白包括但不限于可溶性ICAM-1、重组白介素-4(IL-4)、tPA、EPO、rFVIII和BDD-FVIII(B结构域缺失的因子VIII变体)和这些蛋白的衍生物。因子VIII的结构域排列为A1-A2-B-A3-C1-C2，作为一个2351氨基酸的单链多肽合成，在转位进入内质网腔时，19氨基酸的信号肽被切除。由于因子VIII是高度糖基化的，高水平表达(＞0.2 pg/c/d)因子VIII难以实现(Lind et al.，1995，Eur J Biochem.232：19-27；Kaufman et al.，1989，Mol Cell Biol.9：1233-1242)。在哺乳动物细胞中表达因子VIII通常比使用类似载体和途径表达其它基因要低2-3个数量级。因子VIII的生产细胞系的生产率为0.5-，1U/c/d(0.1-0.2pg/c/d)。

现已证实，因子VIII的B结构域是前凝血剂活性不可或缺的。几个研究小组报导，使用截短的因子VIII变体获得了哺乳动物中因子VIII的更高的表达(Lind et al.，1995，Eur J Biochem 232：19-27；Tajima et al.，1990，Proc 6th Int Symp H.T.p.51-63；Almstedt的美国专利5,661,008，1997)。但是，因子VIII变体从一个稳定细胞克隆的表达水平仍低于1pg/c/d。也已经发现，尽管内源免疫球蛋白(Ig)没有表达，工程化宿主细胞的重组Ig表达较高。HKB11细胞生产的蛋白具有人特异性糖基化模式。因此，该克隆是生产基因工程Ig和其它蛋白的最佳宿主细胞。

在本文中，非洲淋巴瘤来源的细胞是指非洲淋巴瘤细胞的一种细胞，来源于非洲淋巴瘤细胞，来源于非洲淋巴瘤来源的其它细胞，或是一种上述任一种细胞有丝分裂产生的细胞。“来源于”在此包括但不限于正常有丝分裂和转染、细胞融合或其它用来改变细胞或制备具有新特性的细胞的遗传工程或细胞生物学技术等过程。同样，人胚胎肾细胞来源的细胞是指人胚胎肾细胞的一种细胞，来源于人胚胎肾细胞，来源于人胚胎肾细胞来源的另一种细胞，或是一种上述任一种细胞有丝分裂产生的细胞。同样，293S来源的细胞是指293S细胞的一种细胞，来源于293S细胞，来源于293S来源的另一种细胞，或是一种上述任一种细胞有丝分裂产生的细胞。2B8来源的细胞是指2B8细胞的一种细胞，来源于2B8细胞，来源于2B8来源的另一种细胞，或是一种上述任一种细胞有丝分裂产生的细胞。异源蛋白是指一种细胞经过程改造后产生的蛋白。

                   附图简述

图1显示HKB细胞来源的概况。

图2显示文中提及的表达载体的物理图谱。所有质粒基于pBR322骨架构建，含有dhfr表达单位。所有编码目标蛋白的基因处于CMV增强子/启动子(CMVe/p)的调控之下；5′内含子(MIS或CIS)位于基因的5′端，但BZLF1除外。Poly A信号区标记为pA。两个质粒pSH157和pCIS25DTR均含有EBV-TR序列(402bp)。

图3显示瞬时转染分析中用于基因表达的宿主细胞系的比较。转染在相同条件下进行：同样数量的293S、2B8和HKB11细胞以等量的质粒DNA使用相同的转染剂转染。转染后2天收集组织培养液。蛋白生产水平通过ELISA(IgG和ICAM-1；表示为ng蛋白/10⁶细胞/2日)和Coatest^分析试剂盒(rFVIII，表示为毫单位/10⁷/2日)确定。

                  具体实施方案

材料与方法

HH514-16由Dr.George Miller(Yale University)惠赠。293S细胞获自Dr.Brad Zerler(Molecular Therapeutic Institute，West Heaven，CT)。293S细胞是经改造适于生长在悬浮培养物中的293S细胞(ATCCCRL-1573)(Stillman et al.，1985，Mol Cell Biol 5：2051-2060)。

质粒

本文中使用的所有表达载体基本上是具有功能性dhfr基因表达片段的基于pBR322的质粒。表达载体的物理图谱见图2。质粒pSH157和pCIS25DTR也具有EB病毒的末端重复序列(EBV-TR)。关于EBV-TR序列，参见Cho和Chan的称作MSB-7254的申请“提高药物选择比例的EB病毒末端重复序列”。载体pSH131已经保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号为ATCC 98879，它可用来产生选定蛋白的表达载体，如Cho和Chan所述(MSB-7254，上文)。

ELISA

为测定tICAM-1分泌，将ICAM-1的单克隆抗体C92.5(McClellandet al.，1991，Proc Natl Acad Sci USA 88：7993-7997)吸附在圆底微量板上。用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐水(PBS)溶液处理封闭培养板，然后与含有tICAM-1的样品温育。平板然后用洗涤缓冲液(PBS加0.005％Tween 20)洗涤，再与抗tICAM-1的另一个表位的第二种单克隆抗体生物素化C78.5(McClelland et al.，1991，上文)温育。洗涤后，平板与HRP-链亲和素温育。平板再用洗涤缓冲液洗涤，与四甲基联苯胺(TMB)反应，用1N盐酸终止反应。通过450/570nm读OD值并与纯化tICAM-1的标准曲线比较确定tICAM-1浓度。

为了测定免疫球蛋白(Ig)分泌，用抗Ig抗体包被平板，用生物素化抗Ig抗体作为检测抗体。已知浓度的Ig分子被用作标准。其它方面保持不变。

为了测定白介素-4(IL-4)分泌，用抗IL-4抗体包被平板，用生物素化抗IL-4抗体作为检测抗体。纯化的IL-4分子被用作标准。

测定rFVIII分泌的试验

rFVIII分子用CoatestVIII：C/4试剂盒(Chromogenix，Molndal，Sweden)的试剂定量。被称为MEGA1的美国标准的抗嗜血因子(因子VIII)  (Office of Biologics Research and Review，Bethesda，MD)被用作测定在Select Heat Blocks(VWR Scientific，San Francisco，CA)上预先加热到37℃的EIA/RIA A/2平板(Corning，Corning，NY)的标准。将因子IXa、因子X、磷脂和氯化钙加入各个样品中，温育10分钟以激活因子X。然后加入生色底物(S2222)，温育10分钟以释放生色团pNA。该反应通过加入50％乙酸终止。然后在SPCETRAmax250分光光度计微量板读数仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上于405/450纳米测定比色吸收值，数据通过Molecular Devices提供的SOFTmaxPRO软件计算。

HAT敏感和G418抗性非洲淋巴瘤细胞系的衍生

为了获得HAT敏感细胞，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)缺陷细胞系(Szybalska et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48：2026-2034，1962；Littlefield，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 50：568-576，1963)通过Siadak等(美国专利4,834,975，1989)介绍的标准方法建立。

不含EBV激动DNA(Rabson et al.，1983，Proc Natl Acad Sci USA87：3660-3664)的HH514-16细胞(获自Dr.G.Miller，Yale University)用RPMI-1640悬浮培养基(Life Science，Gaithersburg，MD)中的300μg/ml甲磺酸乙酯(MSE)(Sigma，St.Louis，MO)处理24小时，培养基中补加有15％胎牛血清(FBS)(Hyclone，Logan，UT)。用培养基洗涤细胞后，细胞在含有6-巯基鸟嘌呤(6-TG)(Sigma)(5μg/ml)的培养基中铺平板，以选择HGPRT阴性细胞。在6个月的选择期间，6TG的浓度从5μg/ml增加到30μg/ml。然后测试细胞对含有HAT的培养基的敏感性。单细胞克隆(SCC)由HAT敏感群体A5的有限稀释克隆(96孔板中每孔一个细胞)获得。一个SCC即A5/1D7用pSV2neo转染以得到G418抗性细胞，pSV2neo含有在pBR载体中SV40启动子控制下的neo基因。一个被称为2B8的G418(1.5mg/ml)抗性SCC(保藏于美国典型培养物保藏中心，保藏号CRL-12569)用于融合。

                      实施例1

细胞融合和单细胞克隆的衍生

细胞融合主要按照Kenentt(1979，Meth Enzymol 58：5-359)所述的聚乙二醇(PEG)融合法进行。处于对数生长期的293S和2B8细胞各5,000,000用无钙离子和镁离子的PBS洗涤(Life Technologies，Rockville，MD)，接种到用花生凝集素(Sigma，5μg/ml)预处理的6孔板的一个孔中。装载有细胞的6孔板在Beckman J-6M/E离心机(Beckman，PaloAlto，CA)中于400g离心6分钟。从细胞中除去PBS后，细胞用2ml 40％(w/v)PEG(Sigma)处理1分钟。作为对照的一个孔不用PEG处理。细胞用5ml含5％DMSO的PBS洗涤3次，然后用PBS洗涤3次。细胞与补加有15％FBS的新鲜培养基温育25分钟。使用含G418(1mg/ml)和HAT(Life Technology)并补加有15％FBS的新鲜培养基将细胞接种到96孔板(1.2×10⁶细胞/板)。细胞每周两次使用选择培养基饲喂。在该实施例中，初次选择时，293S细胞具有对含HAT培养基不敏感的所需特征，类似的是，2B8细胞具有抗G418的所需特征。

尽管融合细胞在选择条件下生长，混合细胞不在相同条件下生长。选择后3周，起始群体转移到较大的单元中。为了获得SCC，将稳定生长的20个群体混合，使用选择培养基进行有限稀释克隆(一孔一细胞)。使用显微镜仔细观察单个克隆，从15×96孔板中选择出了19个SCC。来源于融合试验的SCC被称为HKB细胞(人肾和B细胞杂合细胞)。从转染试验中选择7个SCC。进一步测试这7个SCC稳定生产各种蛋白的情况。7个SCC中的一个HKB11被选作生产异源蛋白的优选哺乳动物细胞宿主。概况参见图1。

                    实施例2

HKB克隆的鉴定

尽管所有杂合细胞均在选择条件下选择，杂合状态通过计数细胞中的染色体数目确证。确实，所有HKB具有90-110的染色体数目。这些数目类似于293S和2B8染色体数目(分别为64和47，根据ATCC数据)的总和。293S(Stillman et al.，1985，Mol Cell Biol 5：2051-2060)是适应悬浮培养的293(ATCC CRL-1573)。

通过使用甲醇固定细胞的直接免疫荧光试验测定所有杂合细胞克隆的内源Ig(μ和κ)表达，以确定哪些细胞克隆分泌内源Ig。在较长期的重复试验中，根据免疫荧光试验(表1)和ELISA(数据未示出)观察到这些细胞μ和κ链表达是阴性的。

表1  Ig基因表达的检测

    细胞    基因表达   重链(μ)   轻链(κ)    293S    阴性    阴性    2B8    阳性    阳性    HKB    阴性    阴性

表1显示3类细胞免疫荧光试验观察到的结果。细胞重悬于PBS中，制成玻璃涂片。细胞干燥后，在冷(-20℃)甲醇中固定涂片5分钟。细胞用FITC-抗人κ和抗人μ链(1∶20稀释)(Zymed Laboratories，Inc.，So.Fan Francisco，CA)在湿盒中37℃染色45分钟。用PBS洗涂片10分钟后，涂片用PBS/甘油(1∶1)以盖玻片封固。细胞在荧光显微镜下观察(Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY)。

α(2-6)唾液酸转移酶的人特异性模式唾液酸连键使用FITC辍合的西洋接骨木凝集素(SNA)(Sigma，St.Louis，MO)通过HKB细胞的FACS分析证实。通过寡糖足迹法(数据未示出)分析，HKB细胞分泌的蛋白(克隆1G2)显示α(2-3)和α(2-6)连键唾液酸的糖基化模式。这表明由293S和2B8细胞融合得到的HKB细胞保持了人特异性糖基化酶。

为了测试这些杂合细胞是否具有表达外源基因的能力，细胞用ICAM-1和IgG(抗TNF抗体)表达载体转染。为了测试IgG的分泌，HKB细胞(5×10⁶细胞)通过电转化以10μg提供重链(γ)和轻链(κ)的功能性表达的质粒DNA转染。为了测试可溶性ICAM-1的分泌水平，HKB细胞(5×10⁶细胞)通过电转化以10μg提供可溶性ICAM-l的功能性表达的质粒DNA转染。通过ELISA确定IgG或ICAM-1的分泌水平。所有19个SCC在瞬时转染试验中分泌相对高水平的ICAM-1(100-500ng/ml/ad)和IgG(30-200ng/ml/2d)(表2)。这些数据表明，这些杂合细胞支持转染Ig基因的表达，尽管内源Ig基因表达终止。

表2.克隆早期获得的HKB克隆IgG和可溶性ICAM分泌瞬时转染试验，数值是蛋白的分泌水平(ng/ml/2d)

    HKB克隆    IgG  可溶性ICAM-1    1    ～150    ～500    2    ～30    ～30    3    ～20    ～50    4    ～80    ～200    5    ～100    ～500    6    ～50    ～300    7    ～40    ～200    8    ～30      nd    9    ～80      nd    10    ～80    ～100    11    ～200      nd    12    ～100      nd    13    ～80    ～150    14    ～80      nd    15    ～30    ～200    16    ～80    ～200    17    ～160    ～500    18    ～80    ～200    19    ～80    ～100

            nd＝未试验

EB病毒(EBV)在2B8细胞中以附加体形式存在。所有SCC的EBNA-1表达阳性(数据未示出)，这表明它们是EBV阳性的。但是，尚不清楚在杂合细胞中是否还存在完整EBV基因组。因此，杂合细胞中EBV基因组的状态通过用EBV基因组片段BZLF1转染细胞来测定，BZLF1是潜伏破坏反式激活基因。HKB细胞(5×10⁶细胞)用允许BZLF1功能性表达的10μg质粒DNA(pSH121)转染。EBV衣壳抗原(EBV-VCA)使用含有抗EBV-VCA滴度和FITC辍合的抗人IgG的人血清通过间接免疫荧光进行检测。免疫荧光的技术细节如上所述。如表3所示，模拟转染细胞的EBV衣壳抗原(EBV-VCA)表达是阴性的，这表明其中EBV复制是阴性的。但是，少量转染细胞的抗原表达是阳性的。这些数据表明杂合细胞携带潜伏形式的EBV基因组。

表3.BZLF1转染的EBV复制诱导

    病毒衣壳抗原表达(％)    HKB克隆    模拟转染    BZLF1    HKB1    阴性    0.20％    HKB5    阴性    1-2％    HKB7    阴性    0.20％    HKB11    阴性    0.20％    HKB13    阴性    0.50％    HKB17    阴性    0.20％    HKB19    阴性    1-2％

在摇瓶中通过依次2倍稀释FBS使杂合细胞适应无血清培养基。2周后，细胞生长在无FBS的培养基中。细胞在摇瓶中长成小聚集物。与293S细胞不同，杂合细胞容易适应无血清悬浮培养。添加有转铁蛋白和胰岛素的无血清和无白蛋白培养基中，杂合细胞可以使用摇瓶作为悬浮培养物维持1年以上。

为了比较转染基因产物的水平，一个克隆HKB11与亲本细胞293S和2B8用pSM98(可溶性ICAM-1)、pSH125(抗TNF IgG)和pCISF8(rFVIII)转染。如图3所示，HKB11细胞中ICAM-1和IgG的分泌水平大大高于293S细胞(约10倍)。2B8的2种蛋白分泌水平不可检测。HKB11细胞中rFVIII的分泌水平类似于293S细胞。这些数据表明HKB11细胞的转染效率明显高于亲本细胞。

                      实施例3

稳定分泌异源蛋白的HKB克隆的衍生

在基因扩增系统(dhfr/MTX)中测试杂合克隆的稳定蛋白表达。细胞首先用合适的表达载体转染，然后将转染细胞(通常每个96孔板上10⁶细胞)接种到无次黄嘌呤和胸腺嘧啶但添加了FBS和MTX(50nm)的选择培养基中进行选择/扩增。对平板进行第一轮筛选后，选择高分泌孔细胞，转移到6孔板上。6孔板上的细胞以含有更高浓度MTX(100、200和400 nM)的培养基进一步扩增。对6孔板上的起始群体进行进一步筛选以衍生最后的群体。最后，这些群体用来克隆单细胞衍生的克隆。如表4所示，HKB11细胞最适合用来产生高水平异源人蛋白。用于生产ICAM-1、Ig和IL-4衍生物时，HKB11细胞同CHO细胞一样优良(数据未示出)。但是，HKB克隆生长较CHO克隆更快，容易适应悬浮培养和无血清条件。用于生产BDD-FVIII时，HKB11克隆显示出较CHO克隆高10倍的产率。上述结果表明，HKB11细胞是用于表达治疗性人蛋白的最佳人细胞宿主。

表4.HKB克隆的异源蛋白生产蛋白    细胞宿主    MTX扩增    特异性产率ICAM-1    HKB11      100nM      10pg/c/d¹Ig       HKB13       50nM      12pg/c/dBDD-FVIII HKB11      400nM      5-10uU/c/d²IL-4SA  HKB11      100nM      5pg/c/d³

1.HKB克隆的ICAM-1生产水平类似于293S细胞。分泌ICAM-1的HKB克隆容易适应悬浮培养，而293S克隆难以适应悬浮培养。

2.BDD-FVIII分泌水平高于以相同表达载体转染的CHO细胞衍生的克隆约10倍

3.使用HKB11转染后6个月可以产生克数级IL-4SA(T13D/R121E)，而使用相同表达载体和类似方法在相同试验中采用CHO细胞所需时间要多几个月。

上述方法衍生的细胞系包括(i)在100nM MTX中扩增后以pSM98转染的HKB11细胞衍生的可溶性ICAM-1分泌克隆(10pg/细胞/日)，(ii)在50nM MTX中扩增和无MTX有限稀释克隆后以pSS125转柒的HKB13细胞衍生的单克隆抗体(抗TNF)分泌单细胞克隆(12pg/细胞/日)，(iii)在400nM MTX中扩增和无MTX有限稀释克隆后以pCIS25DTR转染的HKB11细胞衍生的截短的rFVIII(BDD-FVIII)分泌单细胞克隆(5-10μU/c/d，无血清条件下)，(iv)MTX扩增后以pSH157转染的HKB11细胞衍生的IL-4衍生物(IL-4选择性激动剂IL-4SA；两个位置氨基酸突变，即T13D和R121E)分泌克隆(5pg/c/d)。IL-4SA分泌HKB克隆1G2用来相对快速生产少量蛋白(克数级)。上述表达载体的物理图谱参见图2。

                        讨论

本文所述杂合人细胞系表现出其亲本细胞系具有的有利特征。HKB细胞系是通过人胚胎肾细胞(或来源于人胚胎肾细胞的细胞)与非洲淋巴瘤细胞(或来源于非洲淋巴瘤细胞的细胞)的融合产生的，它可用于发展表达异源蛋白的细胞系。

建立293S和2B8杂合细胞系的最初目的是解决293S细胞的聚集问题，它们在悬浮培养时容易结块(不利的特征)。由杂合过程得到的HKB细胞在T形瓶中培养时长成单层。但是，这些细胞以悬浮方式培养时以悬浮细胞形式生长(不形成大的聚集物)。HKB细胞容易转染，转染效率大大高于293S细胞。

尽管在产生稳定细胞系的大多数情况下需要的转化或杂交事件可能导致改变的糖基化模式(Yamashita，1989，J Biol Chem 264：2415-2423)，但发现体细胞杂合细胞系HKB11具有典型的人糖基化酶，例如α(2-3)和α(2-6)唾液酸转移酶。而且，转染HKB细胞生产的蛋白具有α(2-3)和α(2-6)唾液酸连键的正常人糖基化模式。

总而言之，HKB是具有各个亲本细胞系的有利特征的杂合人细胞，即在悬浮培养时无聚集(同2B8细胞)，容易转染和有利的分泌特征(同293S细胞)。优选的杂合人细胞系HKB11同293S细胞一样，免疫球蛋白基因表达是阴性的。这一性状在重组生产人细胞的单克隆抗体时是有利的。发现人细胞融合产生了具有有利特征的细胞的事实会促进使用293S和B细胞来源的其它细胞系如Namalwa和6F11进行人细胞融合的进一步研究，从而由不同亲本细胞系融合得到的杂合细胞中获得性状的新组合。

上述实施例旨在说明本发明，本领域技术人员很容易设想到其它改变形式。因此，本发明范围仅由权利要求书限定。