一种手性－反－第一菊酸的酶拆分制造方法

摘要

一种手性R(+)－反－第一菊酸的酶拆分制造方法,以消旋的(±)－第一菊酸酯为原料,以酯酶为催化剂,催化(±)－第一菊酸酯不对称水解反应;其特征在于:加入特定的添加物改变酶反应的微环境,特定添加物选自寡糖、多糖、非离子型表面活性剂之一种或多种,每种添加物在反应体系中的浓度在0.001～0.2%范围内。本发明对目的物手性第一菊酸的选择性高,而且在生产上可以方便地实施。

说明书

本发明涉及手性R(+)-反-第一菊酸，特别提供了一种用酶拆分方法制造手性R(+)-反-第一菊酸的技术。

第一菊酸(又称菊酸，英文名称Chrysanthemic acid)是合成拟除虫菊酯农药的酸部分组成的重要中间化合物。第一菊酸，即2，2-二甲基3-(2-甲基-1-丙烯基)环丙烷羧酸，如(I)所示

因它的环丙烷环上存在两个手性碳原子，因此有R(+)和S(-)两种构型，还有顺式和反式两种异构，共有四种异构体。作为拟除虫菊酯农药的酸部组成，不同异构体的第一菊酸，其杀虫效力表现出显著的差异。其中手性R(+)第一菊酸是有效体，而手性S(-)第一菊酸是无效体；对顺式和反式结构，一般而言，R(+)-反-菊酸效力最高，而R(+)-顺-菊酸则次之。当今，合成高效、低毒有益于环境保护的手性农药已成为重要的发展趋势。因此在工业上制造R(+)第一菊酸，是生产手性拟除虫菊酯农药的重要中间体，具有较高价值。

目前，虽然化学拆分法可以制造手性R(+)第一菊酸，但是需要使用价格很高的光学活性试剂，而且工艺流程比较繁杂。由手性催化剂催化环丙烷化虽然可以得到R(+)-反-第一菊酸，但尚难达到很高的光学活性。因此研究开发方便经济的生物催化剂拆分法制造R(+)-反-第一菊酸成为一个新的重要途径。

以生物催化剂动力学拆分法制造R(+)-反-第一菊酸，已报道的文献有：1.猪肝酯酶拆分法(M.Schneider et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Eg.，23：64(1984))。2.球形节杆菌(Arthobacter globiformis)及其酯酶拆分方法(SMitsuda et al.，Agric.Biol.Chem.，55，2865(1991))。

猪肝酯酶拆分法，使用活力高的酶，得到了R(+)-第一菊酸的光学活性(纯度)达70％，但是，猪肝酯酶价格偏高，供生产使用有一定的限制，需通过酶固定化来解决。

球形节秆菌酯酶拆分法，水解率4.0％时，第一菊酸的R(+)-反/R(+)-顺＝100，但是，此菌种难以得到，而且未经诱变或基因工程改造的菌株，活力比较低。

本发明的目的在于提供一种手性R(+)-反-第一菊酸的酶拆分制造方法，该方法对目的物手性第一菊酸的选择性高，而且在生产上可以方便地实施。

本发明提供了一种手性R(+)-反-第一菊酸的酶拆分制造方法，以消旋的(±)-第一菊酸酯为原料，以酯酶为催化剂，催化(±)-第一菊酸酯不对称水解反应；其特征在于：

(1)(±)-第一菊酸酯中顺式与反式异构体比例在10～90/90～10范围之间，在反应溶液中(±)-第一菊酸酯浓度在0.1～40％范围中；

(2)酯酶由新鲜猪肝或其他哺乳动物如马.狗.兔等肝脏或某些细菌或酵母菌提取，活力不低于0.1u/mg，酯酶的用量为底物第一菊酸酯的0.1～10％；

(3)加入特定的添加物改变酶反应的微环境，特定添加物选自寡糖、多糖、非离子型表面活性剂之一种或多种，每种添加物在反应体系中的浓度在0.001～0.2％范围内。

(4)反应介质为无机盐缓冲溶液、有机盐缓冲溶液、蒸馏水、脱离子水之一种；

(5)水解反应在搅拌或振荡下进行，水解反应温度在20～70℃范围内，水解反应时间6～96小时，控制反应溶液pH在3～11范围内。

本发明所用的原料为消旋的第一菊酸酯，如(II)所示

R为C₁-C₄烷基及孟基，其顺式与反式比例在10～90/90～10范围内。

本发明所用的酯酶(EC.3.1.1.1)是由新鲜的哺乳动物(如猪、马、狗、兔等)的肝脏提取的酯酶粗提物，如日本天野酶公司的产品，美国Sigma化学公司的产品和本实验室的提取物，或由细菌和酵母菌提取的酯酶粗提物。酯酶活力在0.1-20u(国际单位)/mg范围内。酯酶可以固态或液态形态使用，可以吸附或共价键合方法固定于无机或有机载体上使用，固定化酶便于酶回收反复使用。

本发明所用的特定添加物为寡糖及多糖类化合物(如乳糖、蔗糖、麦芽糖、棉子糖、葡聚糖、琼脂糖、糊精等)和非离子型表面活性剂(如蓖麻油聚氧乙烯、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、失水梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯等)。

本发明中消旋第一菊酸酯的浓度范围最好为1～10％；添加物的浓度范围0.01～0.1％；猪肝酯酶的用量最好为底物第一菊酸酯的0.5～5％；水解反应温度最好为30～50℃，水解反应过程中反应介质的pH最好为6～8。

一般地说为改进酶的功能，如提高酶反应速度和对映体及非对映体选择性，有二种途径：改变酶反应的微环境或定位改变酶的某些氨基酸残基(蛋白质工程或基因工程方法)。酯酶为一种糖蛋白，加入寡糖及多糖化合物，可能经过化学诱导作用，提高了酯酶的对映体和非对映体的选择性。本发明方法所用的特定的改变酶反应微环境的添加物，可以明显地加快酯酶催化水解第一菊酸酯的水解速度，同时可以提高对映体及非对映体的空间选择性。水解反应速度可加快一倍以上，R(+)-反-第一菊酸在四种异构体中的含量可提高5-20％。而且，这种通过添加物改变酶反应微环境以提高酶的功能的方法，比之通过化学键合改变酶的某些氨基酸残基以提高酶的功能的方法要简便得多，更适合工业上应用。总之本发明基于酶催化水解动力学拆分法，使用特定的添加剂改变酶反应的微环境，提高催化水解反应速度和手性第一菊酸的光学活性，为制造手性R(+)-反-第一菊酸提供了一种方便经济的方法。

下面通过实施例详述本发明。

水解反应生成的第一菊酸与未水解的第一菊酸酯的含量用高压液相色谱法测定。产物第一菊酸的四种异构体含量用气相色谱法测定。

实施例1：

取10ml，0.1M，PH＝8.0的NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲溶液置入一三角瓶中，加入消旋的第一菊酸乙酯(顺式/反式＝10/90)1.00g(5.04mM)，非离子型表面活性剂tween80，50mg，猪肝酯酶(Sigma化学公司粗酶，活力20u/mg)10mg，于40℃下振荡(～200转/分)反应48小时，加浓盐酸至PH＜2.0，用4-甲基-2-戊酮萃取(10ml，2次)。萃取液用HPCL法(C₁₈柱，6.4×200mm，甲醇/水＝1：1，PH＝3.0，1ml/min，254nm)，测定反应生成的第一菊酸和未水解的第一菊酸乙酯的含量，由之计算水解率为25.71％。之后，向萃取液中加入等体积1NNaOH水溶液，摇动分相，使水解生成的第一菊酸形成钠盐进入水相，第一菊酸乙酯留在有机相中。水相再用36％盐酸酸化，调到PH＜2.0再用4-甲基-2-戊酮萃取第一菊酸。真空除去萃取溶剂(回收)，得第一菊酸240mg，对水解率25.71％应得的第一菊酸计，收率为93.35％。第一菊酸的四个异构体含量用GC法测定(10％QF-1柱，5m，氢火焰鉴测器)。取第一菊酸样品50mg，加等克分子的氯化亚砜、吡啶和(-)-孟醇的甲苯溶液，于100℃回流1小时衍生化后，进行测定，得到R(+)-反-第一菊酸80.09％，S(-)-反-第一菊酸19.91％，没检测出S(-)和R(+)的顺式第一菊酸。

实施例2：

取猪肝酯酶液(日本天野制药公司产品，85u/ml)1ml，tween80 50mg，右旋糖苷100mg加入到10ml，0.1MNaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲溶液(pH8.0)中，摇匀，加入消旋的第一菊酸乙酯(顺式/反式＝10/90)1.0g(5.05mM)，于40℃，振荡(～200转/分)反应48小时。按实施例1所述方法，测定水解率9.64％，得第一菊酸88mg，对此水解率下应得之第一菊酸(96.4mg)计，收率91.29％；测定第一菊酸结晶的四种异构体的含量为：R(+)-反-第一菊酸75.35％，S(-)-反-第一菊酸24.65％，R(+)和S(-)-顺-第一菊酸0％。

实施例3：

取猪肝酯酶(Sigma化学公司粗酶，20u/mg)10mg，乳糖50mg，加入到10ml 0.1MNaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲溶液(pH8.0)中，摇匀后，加入消旋的第一菊酸乙酯(顺式/反式＝10/90)1.0g(5.05mM)，于40℃，振荡(～200转/分)反应48小时。按实施例1所述的方法，测定水解率为13.83％，得第一菊酸结晶128mg，对此水解率下应得第一菊酸量计，收率为92.55％；测定第一菊酸的四个异构体的含量为：R(+)-反-第一菊酸72.28％，S(-)-反-第一菊酸27.72％，R(+)和S(-)-顺-第一菊酸0％。

实施例4：

取细菌酯酶(来源于Candida lipolytica菌，Fluka化学公司产品，0.1u/mg)10mg，Tween80 50mg，加入到10m10.1MNaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲溶液(pH8.0)中，摇匀后，加入消旋的第一菊酸乙酯(顺式/反式＝10/90)1.0g(5.05mM)，于40℃，振荡(～200转/分)反应48小时。按实施例1所述的方法，测定水解率为10.11％，得第一菊酸结晶81mg，对此水解率下应得第一菊酸量计，收率为80.19；测定第一菊酸的四个异构体的含量为：R(+)-反-第一菊酸80.38％，S(-)-反-第一菊酸19.62％，R(+)和S(-)-顺-第一菊酸0％。

比较例1：

取10ml，0.1MNaH₂PO₄～Na₂HPO₄缓冲溶液(pH8.0)置入一三角瓶中，加入消旋的第一菊酸乙酯(顺式/反式＝10/90)1.0g(5.05mM)，摇匀，再加入猪肝酯酶(Sigma化学公司粗酶，活力20u/mg)10mg，于40℃下振荡(～200转/分)反应48小时。按实施例1所述的方法，测定水解率为9.77％，得第一菊酸90mg，对此水解率下应得之第一菊酸量计，收率为92.12％。测定第一菊酸的四个异构体的含量为：R(+)-反-第一菊酸68.22％，S(-)-反-第一菊酸31.78％，R(+)和S(-)-顺-二氯菊酸0％。

比较例2：

取猪肝酯酶液(天野制药公司，85u/ml)1ml，加入到10ml 0.1MNaH₂PO₄～Na₂HPO₄缓冲溶液(pH8.0)中，加入消旋的第一菊酸乙酯(顺式/反式＝10/90)1.0g(5.05mM)，于40℃下振荡(～200转/分)反应48小时。按实施例1所述的方法，测定水解率为4.88％，得第一菊酸结晶42mg，对此水解率下应得第一菊酸量计，收率为86.07％。测定第一菊酸的四个异构体的含量为：R(+)-反-第一菊酸52.20％，S(-)-反-第一菊酸47.50％，R(+)和S(-)-顺-第一菊酸0.30％。