提高基因表达水平的新的DNA片段

摘要

本发明提供一种能使基因高效表达的新的DNA片段。本发明的DNA片段包含SEQ ID NO∶1的第1－第152位附近的碱基到第259－第374位附近的碱基之间的碱基序列,且能使基因表达水平增高。

说明书

相关申请

本申请要求日本专利申请1999年第232815号的优先权，其内容引入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及一种新的DNA片段，其能显著增强基因的表达。

背景技术

近年来，在植物中盛行用遗传工程技术进行分子育种。在植物体内利用遗传工程技术表达外源基因时，导入到植物中的基因未必都能高水平的表达，通常是得到的表达水平比预期低得许多。此外，在植物体内进行物质生产时，其重要条件就是导入高效表达基因，因而开发基因高效表达的技术是非常重要的。

促进外源基因表达的技术之一就是利用具有促进基因表达的碱基序列的DNA片段。这样的DNA片段有5′非翻译前导序列或内含子序列。例如，曾有报道，将玉米Shrunken-1基因的第一外显子(5′非翻译前导序列)(Maas等Plant Mol.Biol.16，199-207，1991)及蓖麻的过氧化氢酶基因的第一内含子(平成3年专利公报第103182号)插入外源基因的上游，使该外源基因得到表达从而促进外源基因的表达。另有报道，来自植物的若干个5′非翻译前导序列或内含子序列有促进基因表达的作用(Koziel等PlantMol.Biol.32，393-405，1996)。

内含子序列这种促进基因表达的作用受相邻的外显子序列长度的影响。例如，玉米的乙醇脱氢酶1基因的第6个内含子其5′端附近有一个76bp外显子，在3′端附近有一个53bp外显子时能达到最大的表达效果(Mascarenhas等Plant Mol.Biol.15，913-920，1990)。

此外，由内含子序列导致的基因表达增加作用还受启动子的种类或植物物种、结构基因的碱基序列等很多因素的影响(Koziel等Plant Mol.Biol.32，393-405，1996)。并非所有的5′非翻译前导序列及内含子序列都能促进基因的表达。因此非常需要进一步鉴定与利用更多种有更强基因表达作用的5′非翻译前导序列或内含子序列。

发明概要

本发明的一个目的是提供一种能明显提高基因表达的新的DNA片段。

本发明的另一目的是利用所述新的DNA片段，对宿主基因提供一种能明显提高外源基因表达的方法。

附图说明

图1表示用于分析启动子表达的载体的构建过程。图中B：BamHI，Bg：Bgl II，H：HindIII，Sc：Sac I，S1：Sal I。

图2是分析213启动子的GUS表达部位的结果。横轴表示检查了GUS表达的转化体的各种器官，纵轴表示在相应器官内显示表达的转化体数目。图中各自表示为：

黑色：表达最强，斜线：表达一般～表达很弱，灰色：表达最弱

白色：无表达

L：叶、R：根、P：雌蕊、A：花药、Lo：浆片、P&L：内/外稃、

BS：小穗基部

图3表示无需ATG的片段的制备过程。

图4表示用于瞬时检测的质粒的结构。

发明详述

本发明人经过深入研究终于发现一种DNA片段或其部分不论是否含有内含子均强烈促进基因表达，所述DNA片段包含水稻花器一种优势表达基因(RPC213基因；SEQ ID NO：3)的转录起始点附近到紧邻第3个ATG之前的序列(SEQ ID NO：1)。

以下详细阐述本发明。

本发明的DNA片段在RPC213基因启动子表达的分析中显示有增大该基因表达的作用，例如将本发明DNA片段插入花椰菜花叶病毒35S RNA启动子和β-葡糖醛酸酶(GUS)基因之间，并将它导入到玉米原生质体表达系统中，对比插入有该DNA片段与没有插入该DNA片段的表达系统，其结果证实插入了该DNA片段的基因具有显著增加GUS活性的作用。其作用对水稻花器没有特异性，它在很多植物细胞中都具有普遍性。另外，RPC213基因可作为一种优势表达基因从水稻品种IR24的花器里分离，如随后实施例1所述。

本发明的第1种序列为如序列表中SEQ ID NO：1所示的、从RPC213基因转录起始点到紧邻第3个ATG之前的基因序列。此序列由374bp构成，包含一个81bp的内含子。将该序列插入到所述表达系统中的启动子和待表达的基因之间，证实其基因表达增强作用要比没有插入的高出90倍以上。该序列相当于从SEQ ID NO：4的第4996至5369位的碱基序列，它是RPC213基因克隆[RPG106；参照后述实施例2中的E)]的碱基序列。

第2种序列为如序列表中SEQ ID NO：7所示已修饰的基因序列。此序列与来源于RPC213基因的SEQ ID NO：1几乎相同，但位于不同读码框的2个ATG中的T(胸腺嘧啶)置换为A(腺嘌呤)。因此，内含子从该序列中切除之后ATG就不存在于序列之中，基因的翻译不会从RPC213的起点ATG起始。经证实所述序列在该表达系统中的基因表达增强作用非常高，以至达到60倍左右。

第3种序列为SEQ ID NO：5所示的已修饰基因序列。此序列由325bp构成，它缺失了SEQ ID NO：1中5′端的34bp、3′端的15bp，且序列中唯一的ATG(RPC213的第2个ATG)中的T(胸腺嘧啶)置换为A(腺嘌呤)。序列中包含81bp的内含子。该序列相当于SEQ ID NO：4的第5030到第5354位的碱基序列。该序列被确认具有增大基因表达的作用，为高达11倍左右。此序列切除内含子后不含ATG，基因的翻译也就不会从RPC213的ATG起始。

第4种序列为SEQ ID NO：2所示的序列。此序列是在RPC213基因的81bp内含子序列5′端添加15bp的外显子序列而在3′端添加12bp的外显子，该序列长度为108bp。此序列相当于SEQ ID NO：4的第5147到第5254位的碱基序列。经证实该序列增大基因表达的作用为4倍左右。此序列切除内含子后不含ATG。

第5种序列为序列表中SEQ ID NO：8所示的序列，它是RPC213基因中从转录起始点到紧邻第3个ATG之前的cDNA序列。该序列不含内含子并由293bp构成。该序列相当于从SEQ ID NO：3的第2到第294位的碱基序列，但其中位于不同读码框的2个ATG中的T(胸腺嘧啶)已置换为A(腺嘌呤)。故表达基因的翻译不会从RPC213的ATG起始。并证实该序列的基因表达增强作用很高，为10倍左右。

从这些序列情况来看，植物细胞中内源性RPC213基因从转录起始点到紧邻第3个ATG之前的序列组成的DNA构建体最适于基因表达的调控，尤其转录的调控。从转录起始点到紧邻第3个ATG的DNA中除去内含子虽然表达作用降低(第五发明)，但内含子本身只有约4倍的表达作用，从这点上来看，内含子与不包括内含子的DNA(其从转录起始点到紧邻第3个ATG之间)的一级结构之间对基因表达的增强作用有协同效应。

因此，本发明提供：包含SEQ ID NO：1所示序列或其部分的DNA片段，含或不含内含子的上述片段，通过修饰上述DNA片段并保留增强基因表达之作用可轻易获得的DNA片段(例如包含从第1-151位附近的任一个碱基到第259-374位附近的任一个碱基的序列、含或不含内含子、且能增强基因表达的DNA片段)。

可从水稻分离含SEQ ID NO：1所示序列的DNA片段，如后文实施例所述。或将分别与SEQ ID NO：1所示序列的两端互补的2个寡核苷酸作为引物，以水稻基因组为模板进行PCR反应很容易得到该DNA片段。再者，利用DNA合成仪合成一部分或全部DNA，再通过适当的连接也可以制备该片段。SEQ ID NO：2、5、7或8所示的碱基序列同样按照随后的实施例可以制备，或利用DNA合成仪合成一部分或全部的DNA，再通过适当的连接也可以制备。

我们知道，生理活性DNA的碱基序列发生部分改变时，有时它仍然具有同一生理活性。因此，在SEQ ID NO：1、2、5、7或8所示的碱基序列或其部分序列中有1个或数个核苷酸缺失、置换、插入或添加，只要具有基因表达增强作用，仍属于本发明的范畴。例如，核苷酸的添加、插入、缺失或置换可以通过定点诱变(如Nucl.Acids Res.10，6487-6500，1982)来完成，本文中“1个或数个核苷酸”指可通过定位诱变法添加、插入、缺失或置换的核苷酸的数目。如添加或插入、缺失、置换少于10个核苷酸，优选小于5个核苷酸。例如可利用与单链噬菌体DNA互补的合成寡核苷酸引物进行定位诱变，得到所需变异。即用所述合成寡核苷酸作引物合成与噬菌体互补的链，用得到的DNA双链转化携有噬菌体的宿主细菌。在琼脂平板上培养已转化的细菌，使含有噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。这样，在理论上有50％的新菌落中的噬菌体含有单链变异，其余50％的菌落含有完整序列。在含有上述突变DNA的噬菌斑可以杂交但含有完整序列的噬菌斑不能杂交的温度下，使所得噬菌斑与已用激酶处理过的合成探针杂交。然后挑取与该探针杂交的噬菌斑进行培养并回收DNA。

以除水稻以外的其它植物的基因组为模板，将分别互补于SEQ IDNO：1两个末端的2个寡核苷酸作为引物，经PCR反应，可得到与SEQ IDNO：1所示序列有一定差异，但具有与本发明DNA片段相同的基因表达增强作用的DNA序列。这样的DNA片段一般在严谨条件下可与具有SEQ IDNO：1所示序列的DNA片段杂交。因此这种DNA片段只要能增大基因表达均属于本发明的范畴。本文“严谨条件”指：6×SSC、5×Denhert′s溶液、0.1％SDS、50％甲酰胺，室温～42℃。

本发明DNA片段的作用是增强基因表达。本文中“增强基因表达的作用”指，将本发明的DNA片段整合到启动子和由该启动子所控制的基因的上游、下游、或优选其中央区，比未整合的情况，基因表达的水平至少增强1倍，优选2倍，最好高于3倍。能够增强表达的基因优选外源基因，也可是细胞原有的基因。

为了证实本发明DNA片段增强基因表达的活性，允许使用任何表达系统。如优选随后实施例4叙述的瞬时检测。

本发明进一步提供一种方法，其包括将本发明的DNA片段之一整合至一种DNA构建体，该构建体含有将在宿主细胞中表达的外源基因，然后用该构建体转化该宿主细胞，其对所述外源基因的表达比用不含所述DNA片段之DNA构建体所转化的宿主细胞增加。

宿主细胞实例有真核细胞如动植物细胞或真菌细胞等，而优选植物细胞，尤其优选单子叶植物细胞。

外源基因是能在所用宿主细胞内表达的任何基因，如编码蛋白质的基因，或不编码蛋白质的基因(例如可使反义RNA转录的基因)。

启动子是能在所用宿主细胞内起作用的任何启动子。当以植物细胞为宿主细胞时，优选使用花椰菜花叶病毒35S启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、PPDK启动子、PEPC启动子等。

本发明的DNA片段可以通过以下过程进行整合：将本发明DNA片段与启动子及在启动子控制下的外源基因一起偶联到与所述宿主相容的载体或质粒上，再用此载体或质粒转化宿主细胞。优选所述载体或质粒带有可筛选转化体的标记。整合本发明DNA片段的位置优选位于启动子和外源基因之间，但不限于此，只要求整合位置能够发挥该DNA片段的基因表达增强作用。根据本发明，转化细胞所携带的本发明DNA片段、启动子及外源基因既可以整合到染色体上，也可整合到表达载体上。

又，外源基因的表达水平与外源基因的转录速度、转录产物的积累、蛋白质的积累、或酶的活性有关。

下面根据实施例具体地阐述本发明内容。

实施例

实施例1 RPC213 cDNA的分离

将水稻品种“月光”及“IR24”于温室培养，以备实验。

(A)RNA的抽提

实验材料取自[IR24]的叶子、成熟与未成熟的雌蕊、花药、浆片、内外稃、未成熟的种子、发芽的种子、根、愈伤组织以及未成熟的小穗(长4.5-6.0mm)，迅速用液氮冷冻然后-80℃保存。用酚/SDS法(Watanabe&Price，美国国家科学院院刊，79，6304-6308，1982)从这些组织中提取总RNA。在抽提缓冲液中添加一种防氧化剂β-巯基乙醇使终浓度为10％(V/V)。又，为了消除任何痕量DNA的混入，将供于逆转录PCR实验的组织，在RNase抑制剂(RNA级，Pharmacia)存在下用DNaseI(FPLC纯，Pharmacia)处理，而不使用氯化锂沉淀法。即，在40mM Tris-Cl pH7.5、6mM MgCl₂缓冲液中将0.375μg/μl的总核酸和1.75U/μl RNase抑制剂混合，再加入0.375U/μlDNaseI(浓度均为最终浓度)，37℃温育10-30分钟。然后用酚/氯仿抽提使DNaseI失活。

叶子和根(表1中记为根(土))采自温室播种1个月的栽培植株，未成熟雌蕊采自抽穗前1周至2周的植株，成熟雌蕊及花药、浆片、内外稃采自即将开花或开花前的数日前，未成熟的种子采自开花后1-2周的植株。发芽的种子和根是在N6培养基(Chu等Scientia Sinica，18，659-668，1975)上播种后分别进行1周、3周无菌培养的植物体。在加有2mg/l2，4-D的N6固体培养基上对种子进行诱导，然后在同样组成的液体培养基中振荡培养3周，取愈伤组织。雌蕊及叶子的总RNA用Oligotex-dT30 super(酒宝造)按照出厂说明书的步骤纯化以制备PolyA＋RNA。

(B)雌蕊cDNA文库的构建

从雌蕊中分离纯化PolyA＋RNA，以约1μg的PolyA＋RNA为模板，用ZAP-cDNA合成盒(STRATAGENE)合成cDNA。按照试剂盒所附的说明书给cDNA接上EcoRI接头再用XhoI消化后，连接于载体UniZAP XR。然后用Giga pack Gold packaging extract(STRATAGENE)将噬菌体DNA包装于噬菌体颗粒之中。

C)示差筛选

依照高仓(WO98/29542)方法进行示差筛选。从B)中构建的cDNA文库中取约30,000个噬菌斑进行检查，结果有198个噬菌斑与雌蕊探针杂交显示强杂交信号而与叶子探针杂交仅显示弱信号。再对其中的152克隆进行第二次筛选。为了避免噬菌斑杂交的强背景以及使筛选有效，采用以下方法筛选。首先，滴一滴氯仿于200μl的SM缓冲液(0.1M NaCl、7mMMgSO₄、50mM Tris-Cl pH7.5、0.01％明胶)中并将第一次筛选的噬菌斑4℃下保存于此缓冲液。然后稀释保存液并将噬菌体铺板，使噬菌斑的密度很低(10-100pfu/板)，分离单个噬菌斑并保存于相同缓冲液之中。从该缓冲液中，制备含高浓度噬菌体的平板溶菌液，依照ZAP cDNA合成盒说明书进行体内切割，从而由该噬菌体基因组制得质粒(pBLuescriptSK(-))。

用限制性内切酶EcoRI及XhoI(宝酒造)消化质粒并因此对cDNA插入片段进行分离纯化。此cDNA插入片段用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分级分离，然后转移到HybondN+尼龙滤膜上，用雌蕊和叶子的探针，以及从花药、发芽的种子、根、愈伤组织或未成熟的种子的总RNA经寡dT引物合成的单链cDNA探针进行差示杂交。结果，获得6个与雌蕊探针杂交，而与其他探针几乎不杂交的cDNA克隆。其中将含有约1.5kb cDNA插入片段的克隆命名为“RPC213”，以供下面实验使用。

D)分析cDNA克隆的器官表达特异性

对上述C)筛选的cDNA克隆“RPC213”进行Northern印迹杂交，以检查各器官中的表达模式及其表达水平。如下制作滤膜。

首先根据《分子克隆》(Smbrook等，1982)用去离子的乙二醛和DMSO除去上述A)中各器官的总RNA 20μg的二级结构，然后用1％琼脂糖凝胶分级分离。再用常规方法将RNA转移到尼龙膜Gene Screen Plus(杜邦公司)上。80℃真空干燥1个小时后，在20mM Tris-Cl pH8.0中将滤膜煮沸5分钟除去乙二醛。使用的探针是利用多引物标记系统(Amersham公司)将所述cDNA的EcoRI-XhoI 1.5kb片段进行RI标记的探针。预杂交及杂交均依照滤膜说明书进行操作。洗涤条件是：室温下在2×SSC、1％SDS中及在0.2×SSC、1％SDS中各5分钟，而65℃在0.16×SSC、1％SDS中15分钟共2次，室温2×SSC中1分。使Kodak X-Omat胶片-70℃于滤膜过夜暴光。

结果，在成熟雌蕊中检出强杂交信号，在内外稃和愈伤组织中检出弱信号，在叶子和花药以及未成熟种子中检出极弱的信号。而其他的器官没有检测出信号。因此从Northern印迹分析结果可知，经过分离的克隆在成熟雌蕊中表达作用比较强，在内外稃和愈伤组织中表达很弱，在叶子和花药以及未成熟种子中表达微弱。转录产物的大小推测为约1.6kb。

为了能更高灵敏地分析有关cDNA克隆的器官特异性表达，以水稻各器官的RNA为模板进行逆转录PCR反应。首先，使用GENESIS 2000荧光测序仪(杜邦公司)部分测定插入到质粒pBluescript SK(-)的cDNA片段的碱基序列。按照测序仪的说明书用引物M13及M14(宝酒造)进行T7 DNA聚合酶反应，用6％丙烯酰胺凝胶进行电泳。从5′(EcoRI)端和3′(XhoI)端两个方向测定碱基序列。其中以3′端约400个核苷酸(mRNA正义链)的DNA序列为模板用DNA合成仪(ABI公司)合成一种引物：

213S；5′-CGCTATGGCCCGTTTCAGCT-3′

213AS；5′-GTCGTCCTGTCGCTTCATTAC-3′

用OPC柱(ABI公司)纯化，用于逆转录PCR。有可能用这些引物扩增约250bp的产物。又以水稻肌动蛋白1基因(RAcl，McElroy等PlantMol.Biol.14，163-171，1990)的序列为基础合成引物：

5′-GTATCCATGAGACTACATACAACT-3′

5′-TACTCAGCCTTGGCAATCCACA-3′

用作对照组。这些引物中间夹有内含子，当模板DNA混有基因组DNA时，除了267bp的cDNA产物外，推测还有350bp的基因组DNA产物。

使上述各器官的10μg总RNA与500ng的寡dT15引物(Amersham)混合，在55μl反应液中70℃10分钟降解二级结构，冰浴后，在100μl的1×第一多核苷酸链缓冲液(BRL)、0.5mM dNTPmix、10mM DTT、2U/μlRNase抑制剂(RNA级，Pharmacia)、10U/μl逆转录酶Superscript(BRL)(浓度均为最终浓度)反应液中37℃温育60分钟。然后95℃5分钟降解RNA-cDNA杂合体，冰浴。此溶液的cDNA浓度为100ng/μl。再将各器官的合成cDNA稀释成4个梯度(100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl)，作为PCR反应的模板。

PCR反应如下：首先用1μl的cDNA稀释液制备20μl的反应液，其中终浓度为：0.5pM/μl引物、0.2mM dNTP、1×PCR缓冲液、0.05U Taq聚合酶(宝酒造)。用GeneAmp9600(Perkin Elmer公司)进行PCR反应，其条件是，94℃3分钟1个循环，94℃0.5分钟、60℃1分钟、72℃1分钟共30个循环，72℃6分钟1个循环。PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳、溴乙锭染色后照相。比较各电泳带的强度，将强度相同的2个样品评价为包含等量的RPC213基因cDNA。

作为对照实验，用水稻的所有器官中均组成型表达的Racl基因引物制得各器官的总RNA反转录产物，对其进行PCR。结果在研究的所有器官中检出预期的267bp PCR产物，没有检出350bp产物。因此认为模板cDNA未被基因组DNA污染。

通过使用质粒克隆，已证实用RPC213基因的引物可扩增具有预期分子量的产物。当用这些引物进行反转录PCR时，用100ng的cDNA作为模板，在成熟雌蕊和内外稃以及愈伤组织中检出明显的PCR产物带，在花药和未成熟的种子中其带很浅，在叶子、发芽的种子和根中其带更浅。其中，将模板cDNA稀释到1ng时在成熟雌蕊和内外稃中也能检出PCR产物，相反愈伤组织、花药以及未成熟种子只能在模板DNA达10ng时检出PCR产物。将模板稀释至100ng以下时，叶子和发芽的种子、根中不能检出PCR产物。根据产物带的存在与否及强度比较，水稻各器官中RPC213基因的表达水平为，以成熟雌蕊中的表达水平为1时，内外稃为1-1/10左右，花药和未成熟种子及愈伤组织为1/10左右、其它器官为1/100左右。

下面分析花器的各个部位及发育阶段的表达水平。模板是从完整的成熟雌蕊、成熟雌蕊的柱头、成熟雌蕊的子房、完整的未成熟雌蕊和浆片中制得的cDNA。用叶子的cDNA及质粒DNA作对照组。对照实验首先用肌动蛋白引物进行PCR反应。结果是，可从所有的模板cDNA中扩增到267bp产物。然后用RPC213特异性引物进行PCR反应。结果，当以10ng的cDNA为模板时，在除叶子以外的所有器官中检出PCR产物。其中未成熟雌蕊及柱头、浆片即使把模板稀释到0.1ng也能检测出其产物，然而在成熟雌蕊及其子房中只能在模板稀释至1ng以上时检出产物。由此估计，花器各部位的RPC213的表达水平，以在成熟的完整雌蕊中的水平为1时，未成熟雌蕊及柱头、浆片为10左右，子房为1左右。即反转录PCR的结果表明，RPC213基因在未成熟雌蕊、成熟雌蕊的柱头以及浆片上都具有很强的优势表达，成熟雌蕊的子房和内外稃表达很弱，在其它组织中几乎不表达。

将以上的Northem印迹分析结果和RT-PCR结果归纳为表1。

表1 RPC213基因表达的分析结果器官/分析方法             成熟雌蕊    柱头    子房    未成熟雌蕊Northern分析               ＋＋       NT       NT        NTRT-PCR                      1         10        1        10器官/分析方法              浆片     内/外稃    花药    未成熟种子Northem分析                NT         ＋        -        ±RT-PCR                     10       1-0.1      0.1       0.1器官/分析方法            发芽的种子   叶       根      地下根      愈伤组织Northern分析                -         ±               -         -           ＋RT-PCR                    0.01       0.01      0.01       NT          0.1

＋＋：强表达；＋：弱表达；±：很少表达；-：不表达。

NT：未分析。

RT-PCR：以成熟雌蕊中的表达水平为1确定的相对表达值

E)RPC213碱基序列的测定

用荧光测序仪(373A型、Applied Biosystems)如下测定在花器中特异性表达的cDNA克隆RPC213(约1.5kbp)的全部碱基序列。以前述M13引物(宝酒造)的碱基序列为基础合成引物，再测定未解码区的碱基序列。通过重复此引物行走方法最后测得总碱基数为1496bp的RPC213碱基序列。进行ORF检索，鉴定出具有最大ORF的读码框。在这个读码框中，一种类似于PolyA信号的序列(Heidecker and Messing，Annu.Rev.Plant Physiol.37，439-466，1986)位于翻译终止密码子TGA的下游大约70bp及90bp处。SEQ ID NO：3显示RPC213的全部碱基序列。SEQ ID NO：3的碱基序列共1524bp，其中包括根据下述基因组克隆的碱基序列而添加在转录起点之后的28bp。

实施例2 RPC213启动子的分离

(A)基因组文库的构建

水稻“IR24”播种后约2个月的叶子的基因组DNA用SDS/酚法分离并用氯化锂沉淀法纯化。用限制性内切酶MboI(宝酒造)部分酶切基因组DNA，用于蔗糖密度梯度离心。蔗糖用缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0，1mMEDTA，200mM NaCl)溶解，制成5个梯度浓度(10、17.5、25、32.5和40％)。使该蔗糖溶液按上述顺序在离心管(40PA，日立)中从下至上分层，顶层为部分酶切的DNA溶液。在20℃用转子SRP28SA(日立)以20,000rpm离心17个小时，再用蠕动泵将该混合物分成每个0.5ml的80个级分，获得大量含16-23kb DNA的级分。将此DNA级分用T4 DNA连接酶(BOEHRINGERMANNHEIM)连接至λDASHII/BamHI(STRATAGENE)，再用GigapackIIGold packaging extract(STRATAGENE)包装成噬菌体颗粒。

(B)克隆的筛选

使约10,000pfu噬菌体与用于感染的大肠杆菌SRBP2混合，在14×10cm方型培养皿上展平，39℃过夜培养。使尼龙滤膜Hybond N+(Amersham)与噬菌斑表面接触，按照滤膜所附说明处理滤膜。水稻花器特异性cDNA(RPC213)5′端的0.6kb EcoRI-SalI片段用多引物标记系统(Amersham)进行RI标记，以所得标记物为探针进行噬菌斑杂交。杂交及洗涤条件按照实施例1中的C)实施。根据此方法从100,000个噬菌斑中筛选出6个阳性克隆。再从这些阳性噬菌斑中制备噬菌体DNA，以该DNA为模板用PCR213特异性引物213S、213AS进行RPC反应。其结果是在2个克隆(RPG106和RPG107)中扩增了约250bp的预期产物。

(C)含有启动子的区的亚克隆

从上述2个RPC213基因组克隆提取DNA，用限制性内切酶SacI、HindIII(宝酒造)酶切后，在0.8％琼脂糖凝胶中分级分离。从播种后约1个月的水稻品种[秋光]和[IR24]的植物体中通过酚/SDS法(Komari等Theor.Appl.Genet.77，547-552，1989)分离纯化DNA。用SacI、HindIII酶切约5μg的DNA，电泳同上。再将DNA带印迹于尼龙滤膜HybondN+(Amersham)上，然后如实施例1D)所述对前述1.5kb的DNA片段进行RI标记，用此标记物作为探针进行DNA杂交。

杂交及洗涤条件依照滤膜说明书实施。其实施结果是，在RPG106中，出现与总基因组DNA的情况中大小一致的带。从而将RPG106中与探针反应的6.0kb SacI片段亚克隆至pBluescript的同一位点。使用4种限制性内切酶BglII、HindIII、SacI、SalI制作物理图谱，以便进一步定位包含该启动子的区。

(D)测定RPG106中5.4kb SacI-SalI片段的全部碱基序列

基因组克隆RPG106上有4个BglII位点。利用这些限制性位点进行亚克隆，用M13引物(宝酒造)通过荧光测序仪(373A型，Applied Biosystems)测定两条链的碱基序列。不能用此方法解码的区及亚克隆位点的邻近区都可以用引物行走法测定碱基序列，从而测定RPG106的5.4kb SacI-SalI片段的全部碱基序列(共5396bp)，示于SEQ ID NO：4。比较此碱基序列和RPC213cDNA克隆的碱基序列，可知用差示筛选法分离的cDNA克隆只是其中一部分但包含几乎整个ORF。即，ATG位于分离的cDNA克隆5′端上游7个碱基处。包含此ATG的读码框与上述cDNA读码框一致。显而易见，在RPC213基因同一读码框内的第一ATG和第三ATG之间有一个81bp的内含子序列。在第一ATG和内含子之间有一个与它们属不同读码框的第二ATG。cDNA中从5′端到第1个SalI位点的序列约有300bp，它与RPG106基因组DNA中相应区但不含内含子的碱基序列完全一致。

(E)转录起始点的测定

根据引物延伸法测定转录起始点。合成2个引物

213Z；5′-TGCTGGTATGGATGTGATG-3′

213Z-2；5′-CTGACGAGGCTGTTGCTG-3′

用MEGARABEL试剂盒(宝酒造)按说明书在上述引物(各10pM)的5′末端以[γ-³²P]ATP进行RI标记。在3U/μl的RNase抑制剂(RNA级，Pharmacia)存在下于缓冲液(0.25M KCl，2mM Tris-HCl pH8.0，0.2mM EDTA)中使所述标记的引物0.1pM(0.3×10⁶cpm)与未成熟小穗(抽穗前1-2周)或叶子的总RNA50μg在10μl反应系中42℃退火2小时。然后加入另一缓冲液(66mM Tris-HCl pH8.3，6.6mM MgCl₂，1.3mM DTT，0.66mM dNTP，130μg/ml放线菌素D)30μl以及1μl(200U)反转录酶(SUPERSCRIPT，BRL)，42℃温育1个小时。然后加乙醇和乙酸铵使之沉淀，用70％乙醇洗涤沉后，风干，溶解于电泳缓冲液(将T7测序试剂盒(Pharmacia)的反应终止液与0.1MNaOH，1mM EDTA以2∶1混合而得)。

将全部溶液于95℃加热3分钟，然后在6％丙烯酰胺凝胶上电泳。同时电泳的还有用相同引物、以含2.3kb RPG106 BglII的质粒为模板经T7测序试剂盒实施测序而形成的产物，以及作为标记物的10bp和50bp序列梯(BRL公司)，所述序列梯已用MEGARABEL试剂盒和[γ-³²P]ATP通过交换反应在末端进行RI标记。结果，从没有表达该基因的叶子RNA中没有得到延伸产物，相反，以未成熟小穗的总RNA为模板时，用213Z引物检出2条延伸产物的带，用213Z-2引物检出3条延伸产物的带。通过与序列梯比较，用这两个引物所得产物的检出位置一样。从此结果来看，在RPC213基因上有连续3组转录起始碱基“CAA”，并断定转录是从这些胞嘧啶或腺嘌呤开始的。TATA盒样序列(5′-TATAAAT-3′)位于最上游转录起始点的胞嘧啶(C)的上游31bp处。从该TATA盒到转录起始点的距离与Joshi报道的其它植物基因类似(Nucleic Acids Res.，15，6643-6653，1987)。另外，假设的翻译起始密码子(第一ATG)存在于这个转录起始点的C的下游21bp处。

实施例3 RPC213启动子表达的分析

A)构建用于启动子表达分析的载体并转化水稻

为了分析分离的启动子的体外表达，如下构建与GUS报道基因相连的载体(图1)。使用的载体为pSB21(Komari等植物杂志，10，165-174，1996)。并利用该载体内35S启动子两端的唯一HindIII位点和BamHI位点。

首先用HindIII和BglII同时消化RPG106 SacI 6.0kb(pBluescript)以制备启动子片段，该片段由RPC213基因第一ATG下游87bp处的BglII位点的上游区约1.8kb构成。将此片段与用相同酶消化而除去35S启动子的载体pSB21连接。将所得质粒载体命名为pYOT213αG。在该pYOT213αG中，RPC213基因的第一ATG和GUS基因的ATG在同一读码框内。由此，RPC213基因的翻译从该第一ATG起始时，GUS蛋白质便被翻译成融合蛋白。

假设RPC213基因的翻译是从第三ATG开始的，用以下方法构建另一载体以制备具有更大范围的启动子片段。为了用PCR扩增该启动子区的一部分，首先合成1对引物：

213P-5H-2；5′-GACGTGATCCACGGCATTGACG-3′

213P 2ndATG-Bam；5′-CGGGGATCCGTTCTCCTCCACCCACGC-3′

213P-5H-2位于RPG106的唯一HindIII位点上游。213P 2ndATG-Bam具有紧邻RPC213基因第三ATG上游的碱基序列和一个BamHI位点。在100μl的反应体系中进行PCR反应，该体系包括上述引物(各100pM)、通过使RPG106模板初步碱变性获得的约1μgDNA、以及Extaq(宝酒造)。

反应条件是以94℃3分钟一个循环，94℃1分钟、60℃1分、72℃2.5分钟共20个循环，72℃6分钟1个循环。将扩增的产物克隆于pCRII(Invitrogen)之后，检查碱基序列。用HindIII和BamHI消化该质粒，分离2.0kb的RPC213启动子片段，然后连接至已用相同酶处理而不含35S启动子的载体pSB21上。所得质粒进一步用HindIII消化并去磷酸化，插入3.3kb的RPG106 HindIII片段，此片段是用HindIII消化RPG106 SacI6.0kb(pBluescript)而成。将所得质粒载体命名为pYOT213βG。该载体在所述启动子下游具有GUS基因，其包含紧邻RPC213基因第三ATG上游的约5.3kb片段。将如此构建的两个载体用三亲株杂交方式分别导入到根癌农杆菌LBA4404株并用于水稻转化试验。

依照Hiei等(植物杂志，6，271-282，1994)方法用来自水稻品种“月光”之未成熟胚的愈伤组织进行水稻转化。

B)通过对GUS的组织学观察分析启动子表达位点

在已导入pYOT213αG或pYOT213βG的转化体上采集叶子、根以及抽穗期和开花期的小穗，按Jefferson等(EMBO J.，6，3901-3907，1987)的方法用X-gluc.(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸)作底物进行GUS染色，在立体显微镜和光学显微镜下进行组织细胞学的观察。小穗内部的器官有雌蕊、花药、浆片、内外稃以及小穗基部，将启动子表达GUS的强度分为4级(图2)。

在导入pYOT213αG的转化体中，所检查的器官无一被GUS染色，然而5个转化体的部分器官中显示GUS基因表达的启动子活性。其中，在pYOT213αG-17转化体中，观察到雌蕊和浆片有GUS表达，而内外稃和小穗基部上有非常微弱的GUS表达。这个观察结果与Northern杂交和RT-PCR结果基本相同。而pYOT213αG-4的GUS表达特异地在雌蕊中检出。雌蕊的表达部位是在花柱和子房之间的部分。这5个转化体中叶子和根以及花药均未看到GUS的表达。即2个转化体显示有雌蕊表达，1个转化体有浆片表达。4个转化体在内外稃有极弱表达，3个转化体在小穗基部有极弱表达。

另一方面，检查了13个pYOT213βG转化体。其中有5个转化体(pYOT213βG-3，7，8，16和17)的叶子和根部无GUS表达或有极弱表达，而花器中有GUS表达并显示花器特异性启动子活性。其中2个转化体(pYOT213βG-7和8)的GUS表达在雌蕊和浆片中相对较强，在花药中极弱，这与Northern杂交和RT-PCR结果一致。除了显示花器特异性表达的转化体外还有8个转化体，虽然在叶子和根部观察到GUS表达，但是花器的启动子活性比较大。例如，在pYOT213βG-6转化体中能观察到叶子和根部的GUS表达，尤其在雌蕊中发现其GUS表达很强。在内外稃、花药、浆片和小穗基部观察到很弱的表达。在pYOT213βG-17中，叶子和根部的表达很弱或几乎没有，雌蕊中的表达比较强。在转化体pYOT213βG的雌蕊中，GUS表达部位主要是柱头，即柱头轴以及柱头的毛状组织。

分别把各器官中的GUS表达结果归纳为图2：无一植株显示叶子和根部的强表达，其中略多于1/2的植株显示在叶子中中等水平至弱水平的表达，1/3或更少的植株显示在根部的中等水平至弱水平的表达。其它植株在叶和根部显示极弱表达或无表达。然而，在花器中，除花药以外的所有器官，即雌蕊、浆片、内外稃及小穗基部都具有很强的启动子活性。尤其在所有13个转化体的雌蕊中表现出明显的GUS表达，其中1个显示深绿色GUS染色(强表达)。在浆片和内外稃中，约2/3的植株有启动子对GUS基因的表达，半数以上的转化体(分别为5个和6个)显示GUS强表达。2个植株显示小穗基部有强表达。

从以上结果可知，与GUS基因连接的这2个DNA片段在花器中具有明显的启动子活性。具有较长活性的213β具有较高活性。213β的启动子活性比213α的启动子活性高，但两个启动子片段的器官特异性很相似，由此认为调节RPC213启动子表达水平(能增强其表达)的碱基序列位于3.3kb的SacI-HindIII片段(其包含在213α之5′区的213β碱基序列中而不位于213α的碱基序列中)中，或位于从213α3′区的BglII到RPC213基因第三ATG间的序列中，后一种可能性更大。

实施例4 RPC213基因的第一内含子序列、紧邻该第一内含子的从转录起始点到第三ATG之间的外显子序列、由上述两个序列组成的序列的基因表达增强效果之分析

RPC213基因最上游转录起始点的下游21bp处具有第一ATG(1stATG)。该第一ATG下游146bp处有一个81bp的内含子(第一内含子)，下游354bp处有第三ATG(3st ATG)。若剪接该内含子，这两个ATG将位于同一读码框内。在1st ATG下游112bp处有另一个ATG(2nd ATG)它位于另一读码框内，在此读码框中3rd ATG上游23bp处出现终止密码子(TGA)，剪接所述内含子时不能构建一个较长ORF(图3，4)。因此认为，该2nd ATG在植物细胞内不能用作RPC213基因的翻译起始密码子。

上述启动子表达分析的结果表明，213基因中1st ATG至3rd ATG的区域对该基因的表达具有重要调节作用，进而分析了这段区域的基因表达增强效果。

A)质粒的构建

根据上述DNA序列信息，用PCR对RPC213基因的第一内含子及包含该内含子的外显子序列(从转录起始点至紧邻3rd ATG之前)进行克隆。

合成扩增第一内含子的引物对如下：

213inFW1：5′-GGGTCTAGACCTGCACGTACTAGGTATAGTAGC-3′

213inRV1：5′-CACCCCGGGCCGTCGTCCCCTGCAAGG-3′。

用于扩增包含该内含子之外显子序列(从转录起始点至紧邻3rd ATG之前)的引物对合成如下：

2131edFW1：5′-TCGTCTAGAAAGGCAGAAAAGAAAGCCAATG-3′

2131edRV1：5′-AGCGGGCCCGGGTTCTCCTCCACCCACGC-3′这些引物分别整合有XbaI或SmaI限制性位点以备后述克隆。在使用扩增内含子的引物所扩增的DNA片段上，除了81bp的内含子外，在其5′侧添加15bp外显子，在其3′侧添加12bp外显子。用扩增转录起始点至紧邻3rdATG的部分的引物所得的包含第一内含子的DNA片段包含374bp。PCR反应液50μl，其中模板DNA(RPG106 SacI 6.0kb)10ng、引物10pM、dNTPs0.2mM、1×GC缓冲液(宝酒造)、Ex-taq 2.5U。反应条件是96℃3分钟一个循环，96℃1分、55℃1分、72℃1分共30个循环、最后72℃6分钟一个循环。将PCR产物克隆到pCRII(Invitrogen)载体上以检验碱基序列。其结果每种PCR产物的碱基序列均与相应DNA模板的碱基序列完全相同。将上述2个碱基序列用SEQ ID NO：2和1表示。

将被克隆至pCRII的内含子和包含该内含子并从转录起始点到紧邻3rdATG的一段序列用XbaI和SmaI消化，然后整合至已用相同酶消化的载体pBI221载体(CLONTECH)上(分别为pYT213I和pYT213RI，见图4)。

即使翻译是从pYT213RI中的1st ATG起始，该读码框也与GUS基因的一致。此时将在GUS蛋白N末端添加90个氨基酸残基。为了除去这种可能性，用PCR合成一类似序列，此序列包括RPC213基因的转录起始点到紧邻3rd ATG的区域，但不包括1st ATG或位于其112bp下游不同读码框内的2nd ATG。

合成下述引物，它包含RPC213基因第一ATG的邻近序列，但其中ATG已被置换为AAG：

213ledFW-atg：5′-

CGTCTAGAAAGGCAGAAAAGAAAGCCAAAGGC GTC-3′；

将这个引物再与前述的213ledRVl重组，以RPG106 SacI 6.0kb为模板进行PCR反应(图3A)。PCR反应液的组成及反应条件均依据pYT213RI和pYT213I的进行。将PCR产物克隆到pCRII上，验证碱基序列之后，用限制性内切酶XbaI和SmaI同时消化，将所得片段整合到用相同酶消化的载体pBI221(质粒A)上。

RPC213基因在1st ATG的11bp下游有限制性位点StuI，在3rd ATG的20bp上游存在限制性位点MluI。如图3所示，1st ATG与内含子之间有限制性位点BglII，而在内含子与3rd ATG之间有限制性位点Eco52I。用限制性内切酶StuI和MluI同时消化RPG106 SacI 6.0kb得到约0.32kb的片段，将其两端用klenow(宝酒造)钝化。将该片段连接至已用SmaI降解并用CIP处理的pBI221，构建质粒B，该质粒在35S启动子和GUS基因之间以正确的方向整合了RPC213的第一内含子及其相邻外显子。

质粒A及质粒B中来自RPC213基因的DNA片段各只有一个ATG(即第一ATG下游112bp处属于另一读码框的2nd ATG)。若翻译起始于该ATG，则很可能终止于上述短ORF内。故用连锁PCR如下述删除该ATG(图3B和3C)。

首先合成一种引物，其包含2nd ATG的邻近序列且其中ATG已被AAG替代：

213Fwlink：5′-CTTCTCCAAGGCCTGTACGG-3′合成与其互补的引物：

213Rvlink：5′-CCGTACAGGCCTTGGAGAAG-3′再合成位于上述BglI限制性位点上游的引物：

213FW5Bg：5′-CCAATCATCACATCCATACC-3′进一步合成Eco52I限制性位点下游处的引物：

213RV3E52：5′-CCGCCGCAGTCCACACC-3′用213Fwlink加213RV3E52，或213FW5Bg加213RVlink分别进行PCR反应(第一次PCR，图3B和3C)。100μl反应液中含：模板DNA[RPG106 SacI6.0kb(图3B)或RPC213cDNA(图3C)]800ng，引物100pM，dNTPs 0.2mM，1×EX-taq缓冲液(宝酒造)，EX-taq 5.0U。反应条件是98℃3分钟1个循环，98℃1分钟、60℃1分钟、72℃1分钟共15个循环，最后72℃6分钟1个循环。以基因组克隆(RPG106 SacI 6.0kb)为模板时，用213Fwlink加213RV3E52可扩增153bp的片段(图3B frg.1)，用213FW5Bg加213RVlink可扩增67bp的片段(同一图的frg.2)，如所预期。当以RPC213 cDNA为模板时，可分别按预期扩增72bp片段(图3C frg.4)和67bp片段(同一图的frg.5)。用klenow处理这些PCR产物以除去末端腺嘌呤之后，再进行凝胶纯化。然后将213FWlink加213RV3E52所得PCR产物和213FW5Bg加213RVlink所得PCR产物装入同一试管里，再以这些产物为模板用外侧的引物213FW5Bg和213RV3E52进行第二次PCR反应。100μl反应液中包括：模板DNA100-500ng，引物100pM，dNTP 0.2mM，1×EX-taq缓冲液(宝酒造)，EX-taq5.0U。反应条件是98℃3分钟1个循环，98℃1分钟、60℃1分钟、72℃1分钟10个循环，最后72℃6分钟1个循环。根据第二次PCR反应，以基因组克隆(RPG106 SacI 6.0kb)和以cDNA克隆(RPC213 cDNA)为模板分别如期地扩增了201bp片段(图3B frg.3)和120bp片段(图3C frg.6)。用限制性内切酶BglII和Eco52I同时消化基因组序列的连锁PCR产物(201bp片段)，通过整合到用相同限制性内切酶消化的质粒A或质粒B而分别构建pYT213RI-A和pYT213dRI(图4)。来自于cDNA序列的120bp片段用BglII和Eco52I消化，然后整合至已用相同酶消化的质粒A和质粒B，分别构建了pYT213R-A和pYT213dR(图4)。将已整合到pYT213dRI、pYT213dR、pYT213RI-A、pYT213R-A的来自于RPC213基因的DNA序列分别用序列表中的SEQ ID NO：5-8表示。pYT213RI-A中来自RPC213的序列包括从转录起始点到紧邻第三ATG之间的包含内含子的整个序列，且第一ATG和第二ATG的T(胸腺嘧啶)均被A(腺嘌呤)替代。在pYT213R-A中，不含有内含子序列。在pYT213dRI中，已删除pYT213RI-A中来自于RPC213基因的序列的5’侧32bp(故不再含第一ATG)和3’侧20bp。此外，pYT213dR中已删除内含子序列。

B)瞬时检测

以玉米黄化叶为实验材料，分离原生质体。植物的材料及生长条件、原生质体的分离基本按照Sheen的报道(Sheen，植物细胞3，225-245，1991)进行。分离的原生质体悬浮于电穿孔缓冲液(0.6M甘露醇、含有20mM KCl的4mM Mes-NaOH、pH5.7)中。用Biorad公司出产的Gene Pulser在125μF、400V/cm的条件下进行电穿孔。一次电穿孔中使用了悬浮于0.8ml电穿孔缓冲液中的约1×10⁵个原生质体、含有GUS基因的30μg质粒DNA、含有荧光素酶基因的15μg pDO432(Ow等科学234：856-859，1986)以及75μg鲑精DNA。电穿孔完成后，将原生质体于25℃避光培养。将回收的原生质体悬浮于75μl的50mM Tris-H₃PO₄、pH7.5中，加入等量的Lysis ReagentLuc(Toyo Ink MFG.，Tokyo，日本)后，用超声波破碎以提取酶液。GUS试验(荧光试验)依据Jefferson方法进行。荧光素酶活性的检测用PicaGene(ToyoInk MFG.)进行。GUA活性通过共转化的虫荧光素酶活性标准化(Leckie等生物技术17：52-3、56-7，1994)。

瞬时检测结果于表2所示。

表2 RPC213基因的第一内含子、从转录起始点到紧邻第三ATG的序列、以及从转录起始点到紧邻第三ATG的包含第一内含子的序列，它们的基因表达增强效果

质粒              构成                                  相对GUS活性值

pBI221         35Spro-GUS-NOS                                  1

pYT213RI       35Spro-213前导序列＋内含子-GUS-NOS             92.9

pYT213I        35Spro-213内含子-GUS-NOS                        3.9

pYT213dRI      35Spro-213Δ5′&3′前导序列＋内含子-GUS-NOS    11.3

pYT213dR       35Spro-213Δ5′&3′前导序列-GUS-NOS             0.3

pYT213RI-A     35Spro-213前导序列(-ATG)＋内含子-GUS-NOS       60.4

pYT213R-A      35Spro-213前导序列(-ATG)-GUS-NOS               10.5

以pBI221的活性为1，将GUS活性表示为相对值。

pYT213RI的GUS活性比pBI221对照的高出90倍以上。这表明RPC213基因中从转录起始点到紧邻第三ATG的含第一内含子的序列具有非常强的基因表达增强效应。即使单独的内含子序列的GUS活性也比对照组(pYT213I)高3.9倍。

已知GUS蛋白表达为融合蛋白时仍保留其活性。就质粒pYT213RI而言，在用于瞬时检测的玉米叶子的原生质体内，翻译从1st ATG起始时，有可能在GUS蛋白的N端添加90个残基的氨基酸序列。因此它能增加GUS蛋白质的稳定性，从而检出很高的GUS活性。不从RPC213基因的片段起始翻译的另一构建体(无需ATG的构建体)也接受检测。结果是，这种无需ATG的pYT213RI-A也显示比对照组高出60倍以上的GUS活性。这意味着RPC213基因中从转录起始点到紧邻第三ATG的含第一内含子的序列本身可在转录水平上增强基因表达。而且其效果是非常强的。即使是RPC213基因中从转录起始点到紧邻第三ATG的不含第一内含子的序列也显示高于对照组10倍左右的GUS活性(pYT213R-A)。

另一方面，RPC213基因中从转录起始点到紧邻第三ATG的序列以及含第一内含子的相同序列，从其DNA序列中5′和3′侧删除数十个碱基，其基因表达增强效应会大大降低。即pYT213dRI的活性达到pYT213RI-A的约1/6(比对照组高约11倍)，而pYT213dR显示无活性。这些结果提示，从转录起始点到紧邻第三ATG的序列的一级DNA结构对于调节植物细胞内源性RPC213基因的表达，尤其转录是最佳的。从以上结果可知：RPC213基因中从转录起始点到紧邻第三ATG的序列、第一内含子、及包含这两个序列的DNA序列分别可增强基因表达约10倍、4倍和60倍。我们希望这些元件对于在基因工程方面提高外来基因的表达具有实质性贡献。

                          序列表<110>日本烟草公司<120>提高基因表达水平的新的DNA片段<130>991306<160>25<210>1<211>374<212>DNA<213>稻品种：IR24

  组织：绿叶

  来源：

  文库名：衍生自绿叶基因组DNA的λDASHII基因组文库

  克隆名：RPG106 SacI-SalI5.4kb<220><223>链型：双链

 拓朴构型：线性

 分子类型：基因组DNA

 特征：nt1，nt2：经引物延伸法测定的RPC213基因的转录起始点

       nt21-nt23：RPC213基因的第一个ATG

       nt133-nt135：RPC213基因的第二个ATG

       nt167-nt247：RPC213基因的第一个内含子<400>1aaaggcagaa aagaaagcca atggcgtctt caggcctcgc agttgcagca acagcctcgt   60cagcctggct ctgctgcccc aatcatcaca tccataccag cagcagcaga tctcgcaagc  120atcttcttct ccatggcctg tacgggtctg cacctgcacg tactaggtat agtagctgca  180actttattca caatgtgatg tcacgttatt atatatgttt cgtcgtcaat ggcggcgaac  240cttgcagggg acgacggccg ccggtgtgga ctgcggcggc ggccaccgca gcagcgccgg  300cggacacggc ggcgtcggcg cggcgggagc aggtggagat cgcccggtcg ctgaacgcgt  360gggtggagga gaac                                                    374<210>2<211>108<212>DNA<213>稻品种：IR24

  组织：绿叶

  来源：

 文库名：衍生自绿叶基因组DNA的λDASHII基因组文库

 克隆名：RPG106 SacI-SalI5.4kb<220><223>链型：双链

 拓朴构型：线性

 分子类型：基因组DNA

 特征：nt16-nt96：RPC213基因的第一个内含子<400>2acctgcacgt actaggtata gtagctgcaa ctttattcac aatgtgatgt cacgttatta   60tatatgtttc gtcgtcaatg gcggcgaacc ttgcagggga cgacggcc               108<210>3<211>1524<212>DNA<213>稻品种：IR24

    组织：雌蕊

    来源：

  文库名：衍生自雌蕊mRNA的λZAPII cDNA文库

  克隆名：RPC213<220><223>链型：双链

 拓朴构型：线性

 分子类型：mRNA的cDNA

 特征：nt1，nt2，nt3：经引物延伸法测定的RPC 213基因的转录起始点

       nt22-nt24：RPC213基因的第一个ATG

       nt134-nt136：RPC213基因的第二个ATG

       nt295-nt297：RPC213基因的第三个ATG

       nt1276-nt1278：RPC213基因的终止密码子

       nt1343-nt1348：nt1365-nt1370：poly(A)信号

       nt1507-nt1524：poly(A)<400>3caaaggcaga aaagaaagcc a atg gcg tct tca ggc ctc gca gtt gca gca    51

                    Met Ala Ser Ser Gly Leu Ala Val Ala Ala

                      1               5                  10aca gcc tcg tca gcc tgg ctc tgc tgc ccc aat cat cac atc cat acc    99Thr Ala Ser Ser Ala Trp Leu Cys Cys Pro Asn His His Ile His Thr

             15                  20                  25agc agc agc aga tct cgc aag cat ctt ctt ctc cat ggc ctg tac ggg   147Ser Ser Ser Arg Ser Arg Lys His Leu Leu Leu His Gly Leu Tyr Gly

         30                  35                  40tct gca cct gca cgt act agg gga cga cgg ccg ccg gtg tgg act gcg   195Ser Ala Pro Ala Arg Thr Arg Gly Arg Arg Pro Pro Val Trp Thr Ala

     45                  50                  55gcg gcg gcc acc gca gca gcg ccg gcg gac acg gcg gcg tcg gcg cgg   243Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ala Pro Ala Asp Thr Ala Ala Ser Ala Arg

 60                  65                  70cgg gag cag gtg gag atc gcc cgg tcg ctg aac gcg tgg gtg gag gag   291Arg Glu Gln Val Glu Ile Ala Arg Ser Leu Asn Ala Trp Val Glu Glu 75                  80                  85                  90aac atg ctc ccg ctg ctc acc ccc gtc gac tcc gcg tgg cag ccg cac   339Asn Met Leu Pro Leu Leu Thr Pro Val Asp Ser Ala Trp Gln Pro His

             95                 100                 105gac ttc ctt ccc tgc tcg gcc gcg ggc ggc ggc gag gcg ctg gcg gcg   387Asp Phe Leu Pro Cys Ser Ala Ala Gly Gly Gly Glu Ala Leu Ala Ala

        110                 115                 120ttc acg gag ggc gtg gcc gag ctg cgc gcg ggc gcc gcc ggc gtg ccg   435Phe Thr Glu Gly Val Ala Glu Leu Arg Ala Gly Ala Ala Gly Val Pro

    125                 130                 135gac gag gtg ctg gtc tgc ctc gtg ggg aac atg gtg acg gag gag gcg   483Asp Glu Val Leu Val Cys Leu Val Gly Asn Met Val Thr Glu Glu Ala

140                 145                 150ctc ccG acg tac cag agc atg ggc aac cgc gcc gag ggc ctc gcc gac   531Leu Pro Thr Tyr Gln Ser Met Gly Asn Arg Ala Glu Gly Leu Ala Asp155                 160                 165                 170ggc acc ggc gtg agc ccc ctc ccc tgg gcg cgc tgg ctc cgc ggc tgg   579Gly Thr Gly Val Ser Pro Leu Pro Trp Ala Arg Trp Leu Arg Gly Trp

            175                 180                 185acc gcc gag gag aac cgc cac ggc gac ctc ctc aac cgc tac ctc tac   627Thr Ala glu Glu Asn Arg His Gly Asp Leu Leu Asn Arg Tyr Leu Tyr

        190                 195                 200ctc tcc ggc cgc gtc gac atg cgc cag gtc gag gcc acc gtg cac cgc   675Leu Ser Gly Arg Val Asp Met Arg Gln Val Glu Ala Thr Val His Arg

    205                 210                 215ctc ctc cGc aac ggc atg gag atg ctg gcg ecg gcg agc ccg tac cac    723Leu Leu Arg Asn Gly Met Glu Met Leu Ala Pro Ala Ser Pro Tyr His

220                 225                 230                              ggc ctg ate tac ggc gcg ttc cag gag cgc gcc acc ttc atc tcc cac    771Gly Leu Ile Tyr Gly Ala Phe gln Glu Arg Ala Thr Phe Ile Ser His235                 240                 245                 250ggc cac acg gcg agg ctc gcg ggg cag cac ggc gac cgg gcg ctc gcc    819Gly His Thr Ala Arg Leu Ala Gly Gln His Gly Asp Arg Ala Leu Ala

            255                 260                 265aag atc tgc ggc gtg atc gcc gcc gac gag agg cgg cac gag gcg ggc    867Lys Ile Cys Gly Val Ile Ala Ala Asp Glu Arg Arg His Glu Ala Gly

        270                 275                 280tac acg atg gcg tee gcc agg ctg ttc gag ctc gac ccg gac ggc atg    915Tyr Thr Met Ala Ser Ala Arg Leu Phe Glu Leu Asp Pro Asp Gly Met

    285                 290                 295gcg cgc gcg ctg gcg gac gtc atg cgc ggg aag gtg acc atg ccg ggg    963Ala Arg Ala Leu Ala Asp Val Met Arg Gly Lys Val Thr Met Pro Gly

300                 305                 310cag ctc atg tcg gac ggc cgc gac ggc gac ggc gag cac agc ctg ttc   1011Gln Leu Met Ser Asp Gly Arg Asp Gly Asp Gly Glu His Ser Leu Phe315                 320                 325                 330gcc cgg ttc tcc gcc gtg gcg gag cgc gcc ggc gtg tac acg gcg agg   1059Ala Arg Phe Ser Ala Val Ala Glu Arg Ala Gly Val Tyr Thr Ala Arg

            335                 340                 345gac tac ggc gaa ctc gtc gag cac ttc gtg cgg agg tgg cgg gtg gcg   1107Asp Tyr Gly Glu Leu Val Glu His Phe Val Arg Arg Trp Arg Val Ala

        350                 355                 360gag ctc gcg gcg ggg ctc tcc ggc gag ggc cga cgc gcg cag gag tac   1155Glu Leu Ala Ala Gly Leu Ser Gly Glu Gly Arg Arg Ala Gln Glu Tyr

    365                 370                 375ctg tgc ggg ttg gcg ccc aag atc cgg agg atg gag gag ctg gcc cac   1203Leu Cys Gly Leu Ala Pro Lys Ile Arg Arg Met Glu Glu Leu Ala His

380                 385                 390cgg agg gcg gcc cgc atc gag ccc gct atg gcc cgt ttc agc tgg atc   1251Arg Arg Ala Ala Arg Ile Glu Pro Ala Met Ala Arg Phe Ser Trp Ile395                 400                 405                 410ttc gat agg ccc gtc atg ctg ggc tga tcaacccggg gcttcggtta tggtttt 1305Phe Asp Arg Pro Val Met Leu Gly

            415atgggcccgt ttactgggct ctgcttgctc aaattataat aagctacatc gtgtgctaaa 1365ataatttatc tttgttatta aggattcgtg tgagaaagct attttgtttt ctgtagcaag 1425tttaggaatg taatgtaatg taatgaagcg gcaggacgac tgccatttga ttaagaaaag 1485actcgcgctt gtttgtagtc caaaaaaaaa aaaaaaaaa                        1524<210>4<211>5396<212>DNA<213>稻

 品种：IR24

 来源：

 文库名：衍生自绿叶基因组DNA的λDASHII基因组文库

 克隆名：RPG106 SacI-SalI5.4kb<220><223>链型：双链

 拓朴构型：线性

 分子类型：基因组DNA

 特征：nt1-nt5369，nt3335-nt5108：其启动子活性已由GUS证实的序列

       nt4964-nt4969：TATA盒样序列

       nt4995，4996，4997：由引物延伸法测定的RPC213基因的转录起始点

       nt5016-nt5018：RPC213基因的第一个ATG

       nt5128-nt5130：RPC213基因的第二个ATG

       nt5370-nt5372：RPC213基因的第三个ATG

       nt5162-nt5242：内含子

       nt1-nt6：SacI限制性位点

       nt729-nt734，nt2811-nt2816，m5103-nt5108：BglII限制性位点

       nt3335-nt3340：HindIII位点<400>4gagctcatgt gaccgttctc ggtgagttca gagataacgt ttagacttcc cttatcagcc  60tcgtgcgggc acctataggg tttgtctgag tcaatctccg atgtcagcca agaaagaaca 120gagcatacga gtaaatctcc cgtcttgctg taatcaagaa tttggattga agtcaagaaa 180ttttatctcg gcaggtacac catctcttca ttccgtattc cttgtcgaga tccaccaacc 240gttctcgagt gatcgagaag gtgtagaatc tgcgacggag ctttgtcgac atttgtcgta  300ctcgccttag tcgatcttgg tgtagaacca tagagacatg gagccttcgt caatgtcgaa  360tagaattttc ctgaaatcaa tactcataaa agaatattag atagaaataa cccccgagcg  420aacgctcaaa gggtaacatg ttatacaatg tatggaaaac tgaaaatgaa ttaaatttac  480agaccaatgt tttgtatatg agcgtctact cttttaccga cttcgatcag tcaatttgtt  540aagttatata ctttccctag cccctagcct tgtcgttgga gaatcgttct cggaagataa  600ggctcttgga cctttgacct gcctcggttg aacaagcact aatcctagcc cccagccgtg  660aagttggaaa acccgatttc cgattacacg gcttggttaa tacgcacggc gagaactctt  720acacgaccag atcttacatg gtcttttgtc tctacagtat ccgacaaggc cttattggct  780ctgggcgtcc ccagccgaag ttcccttagg ttcctcggag gccttgtcaa gacggtgtaa  840agggacagta ggataggttt caacgctagg tgtcatcgtg gtaagggatc tctgggtaaa  900acacttggcg atcttgtgta cctgatatca actttgttgg agtaaaggta atgggagaat  960cgctacacct ctggttgagg accaggtggt agtcgcaact cgaccacttg aagtagaaat 1020agtgggagaa tcgctacacc gctggtcgag aaccaagtag tagtctaaac tcgaccacta 1080gaattaaagg tagtgggaga atcgctacac cgctggtcga gaactaggta tagtctaaac 1140tcgaccacta gaagtaaagg tagtgggaga atcgctacac cgctggtcga ggaccaggta 1200gtagtcgtaa ctcgaccact agaagtggaa atagtgggag aatcgctaca ccgctggtcg 1260agaaccaggt gtaatctaaa ctcgaccact tgaagtaaat gtgcgagaga tcgctacgat 1320tgacgggtct agaaccagtg agtaggtgtc tctcaaccat cttaagtcat ggtgcgagga 1380ctgctgcgtt attgctgtag tcgtacctcg accatctaaa gttaaggtgc gagagattgc 1440tacgttttac tagttcaaga accagcgagc gagtagaatt atctctcgaa caccaatgaa 1500agttgcggtg cgagagattg ctacgtactg gttcgaggac catcgagcga gtagaattat 1560ctctcgaaca ccaatggaag ttgcggtgcg agagatttct acgtactggt tcgagaacca 1620gcgagcgagt agaatcatct ctcgaacacc aatggaggtt gcggtgcgaa agattaatat 1680gcactggttc gaggaccagc gaacgtgtag agttatatct cgaacaccaa tggaagttgc 1740ggtgcgagag attgctacgt actagttcga ggaccatcga gcgagtagaa ttatttctcg 1800aacaccaatg gaagttgcgg tgcgagagat tgctacgtac tggttcgaga accagcgagc 1860gagtagaatt atctctcgaa caccaatgga agtttgcggt gcgagagatt gctacgtact 1920ggttcaagaa ccatggaagt tgcggtgcga gagatttcta tgtactggtt cgaggaccag 1980ggagcgagta gaattatctc tcgaacacca atggaagttt gcggtgcgag agattgctac 2040gtactggttc gagaaccagt gaatgtgtag agttatctct cgaacaccaa tggaggttgc 2100ggtgcgagag attgctacgt actggttcga gaaccagcga acgtgtagag ttatctctcg 2160aacacatgga ggttgcggtg cgagagattg ctacgtactg gttcgaggac cagtgaacgt 2220gtagagttat ctctcgaaca ccaatggagg tgctagagtt ggtttattac atatgcgtct 2280catgtggcca gcatgactca cacacccaac ttgtagcata tccggatgtc tgttcgcaag 2340catgtcgggt gatcaagccg acagcgctcg cgaggaatta tccgttaaca accttttctc 2400gagtagtcta gccatggcgg gtgctatgag ataggtcgtc ggtcttcgtt ggtgggttgg 2460gcgtgacgac tttgcatttg tcgagatcgt tctcgataat gcggtgtact tgaccacaac 2520ctagtcgagt gctcaattgt tcctgaaaaa tattttctag aagacaagac atatagcaga 2580taatatcgag tatgtactca gaaaactgca tggatcttct agtattatca ggatgtaacg 2640agcagatgta aatattaggc attatgtaaa ccgtaaacaa gcatgattca tacaaaagag 2700aatagagcga gccccagtgt tagaccgttg tcggcctaac accggaaaca ctcacataat 2760aaatattgta taaaaaacat gctctaggta aacataataa attatattat agatctgaca 2820attctgtatg atctgaatag gtacgataaa ttgcatataa aatattgcgt acctttgtag 2880atacatgccg gatgtatcta cgaaattagt agattcaatc tactgaatac ctttgccttc 2940ttggtgagga acagcaactc cttaatatgc ttttgcgtgc atggtactgt cccccgtgca 3000cgtaccatgt aatctggtca tttaattgac ctgtttgtct ttagccccga gtcagattgc 3060tgcctagaga ttggatagta gtgcagacgt ggaaactccc cgagtccgac tagcatttac 3120accaataagc agatcaatcc gacgctttga tttccgctcc acgacgcgct tgttttgttg 3180gtggagatcg atgccgtgtt cggcttggac gcggttaatc gagccctcca ccagttgatg 3240tggcgcgtgt attggtactg atcaatctcg aaggttgtct gcactgttga ttgacaacct 3300caaaattgac gtgatccacg gcattgacgt cttgaagctt gagcgatcct gataaatcga 3360atttgttgac gacgattgtt ccgatctcgt cgggacacgt attctggtag gtttagatca 3420cccaacagcg aagttgtcga gtagattgtt gtcggagaat ccatctctta aacccatctc 3480gtcgaaatcc tgaagcacca aaatccccct acctggcgtg ccattatcga cgtttgatgt 3540ctcgactacg gtatttgcat gtcatggggg atcgttggta ctaggatata cgcgagactg 3600acgtaaaaga gatggagaca gggattttta tacaggttcg ggcccctgaa ttgtcatata 3660ataaccctac atcctgttgg ccgaagccgg tattgctctt attcatgata atcacaccat 3720tacaatattt agggtagcct atctaactat tgtcgacatg gcggtctgac gatctgactc 3780gtagtcgaca acagggtagc cttcctcctc gaacctgtgc ctgacgagat cagagatagc 3840gctttcgtct ctcctgacag tatcctgaga caccgtaggg gacttgtcgt gcctatctct 3900gaagtcgata tccggcgtct tgtcttggcg tatgttggct tgtattggct tgtggctttg 3960tggcgtttat gttgctcgta tattgtggtg ggtgtgtatt gtccgtgtct tgtatggtgg 4020gtgtcgattg tgtcccattt ccttctaggg gaccttgtat ttatacccat aggtgtcccc 4080ttgtccaagt agaactaggg aaaccaatat ggatacaatc cgattagtcc tttgtcgttt 4140ccatgtagaa ctttggttgt ctttctttat ccggaactcc tcctatatcc gcaggttatt 4200ttcgtatagg acatgttatg tggtgggtcc taccgagatt tagtcaacta ctattaggta 4260tgtggtatcc ataaccctga cacataccat gatttttctg tctatcaata actgcctcgg 4320tgaacttgaa gaagtaggtt gttattgcag caataatgag acaaactagt atttatttat 4380gatatccctt ggttaagtag tcatgcgtta taataggaac ctctaattcc ctcgtaaata 4440cagctaagtt tattataaca agagctttaa taatattaaa attgtagcct tttttggatt 4500tgtacgaaat aattagcctt aaaaaacatt taatgttggt tagctcaaaa tatttggaaa 4560tggagtgagt atatgttact gacttcaaaa atttttcaaa cggtattcat gtcgttttcg 4620tgagtggact gaaacagcag taattacatt gaacatttga acacctgtat aaagtattaa 4680atatatacta aaaaataatt aattatacat attacgacta atttgcaaga cgaatctttt 4740aagcataatt gctccatgat ttaacaatat agtgctacag taaacatgtg ctaatgacgg 4800attaattagg cttaataaat tcgtctcacg tttactgacg gattctataa ttgatttttt  4860tattaatgcc caaacacccc atacaacact ctatataata ctcaatgtga cgtgccaaaa  4920ctttagacac ctggatgtaa acaccactct gttccttctc ctctataaat ggcaccgggg  4980tggtttgtcg gcaccaaagg cagaaaagaa agcca atg gcg tct tca ggc ctc     5033

                                   Met Ala Ser Ser Gly Leu

                                    1               5gca gtt gca gca aca gcc tcg tca gcc tgg ctc tgc tgc ccc aat cat    5081Ala Val Ala Ala Thr Ala Ser Ser Ala Trp Leu Cys Cys Pro Asn His

         10                 15                   20cac atc cat acc agc agc agc aga tct cgc aag cat ctt ctt ctc cat    5129His Ile His Thr Ser Ser Ser Arg Ser Arg Lys His Leu Leu Leu His

     25                  30                  35ggc ctg tac ggg tct gca cct gca cgt act ag[g tatagtagct gcaactttat 5182Gly Leu Tyr Gly Ser Ala Pro Ala Arg Thr Arg

 40                  45tcacaatgtg atgtcacgtt attatatatg tttcgtcgtc aatggcggcg aaccttgcag] 5242g gga cga cgg ccg ccg gtg tgg act gcg gcg gcg gcc acc gca gca gcg  5291  Gly Arg Arg Pro Pro Val Trp Thr Ala Ala Ala Ala thr Ala Ala Ala   50                  55                  60                  65ccg gcg gac acg gcg gcg tcg gcg cgg cgg gag cag gtg gag atc gcc    5339Pro Ala Asp Thr Ala Ala Ser Ala Arg Arg Glu Gln Val Glu Ile Ala

             70                  75                  80cgg tcg ctg aac gcg tgg gtg gag gag aac atg ctc ccg ctg ctc acc    5387Arg Ser Leu Asn Ala Trp Val Glu Glu Asn Met Leu Pro Leu Leu Thr

         85                  90                  95ccc gtc gac                                                        5396Pro Val Asp

    100<210>5<211>325<212>DNA<213>稻

 品种：IR24

 来源：

 文库名：衍生自绿叶基因组DNA的λDASHII基因组文库

 克隆名：RPG106 SacI-SalI5.4kb<220><223>链型：双链

 拓朴构型：线性

 分子类型：修饰的基因组DNA

 特点：nt1-nt3：StuI限制性位点的后半部分

       nt321-nt325：钝端化MluI限制性位点的前半部分

       nt100：引入突变(T→A)

       nt133-nt213：RPC213基因的第一个内含子<400>5cctcgcagtt gcagcaacag cctcgtcagc ctggctctgc tgccccaatc atcacatcca   60taccagcagc agcagatctc gcaagcatct tcttctccaa ggcctgtacg ggtctgcacc  120tgcacgtact aggtatagta gctgcaactt tattcacaat gtgatgtcac gttattatat  180atgtttcgtc gtcaatggcg gcgaaccttg caggggacga cggccgccgg tgtggactgc  240ggcggcggcc accgcagcag cgccggcgga cacggcggcg tcggcgcggc gggagcaggt  300ggagatcgcc cggtcgctga acgcg                                        325<210>6<211>244<212>DNA<213>稻

 品种：IR24

 组织：雌蕊

 来源：

 文库名：衍生自雌蕊mRNA的λEPAII cDNA文库

 克隆名：RPC213<220><223>链型：双链

 拓朴构型：线性

 分子类型：针对mRNA的修饰型cDNA

 特点：nt1-nt3：StuI限制性位点的后半部分

       nt240-nt244：钝端化MluI限制性位点的前半部分

       nt100：引入突变(T→A)<400>6cctcgcagtt gcagcaacag cctcgtcagc ctggctctgc tgccccaatc atcacatcca   60taccagcagc agcagatctc gcaagcatct tcttctccaa ggcctgtacg ggtctgcacc  120tgcacgtact aggggacgac ggccgccggt gtggactgcg gcggcggcca ccgcagcagc  180gccggcggac acggcggcgt cggcgcggcg ggagcaggtg gagatcgccc ggtcgctgaa  240cgcg                                                               244<210>7<211>374<212>DNA<213>稻

 品种：IR24

 来源：

 文库名：衍生自绿叶基因组DNA的λDASHII基因组文库

 克隆名：RIPG106 SacI-SalI5.4kb<220><223>链型：双链

 拓朴构型：线性

 分子类型：修饰的基因组DNA

 特点：nt1，nt2：经引物延伸法测定的RPC213基因的转录起始点

       nt22：引入突变(T→A)

       nt134：引入突变(T→A)

       nt167-nt247：RPC213基因的第一个内含子<400>7aaaggcagaa aagaaagcca aaggcgtctt caggcctcgc agttgcagca acagcctcgt   60cagcctggct ctgctgcccc aatcatcaca tccataccag cagcagcaga tctcgcaagc  120atcttcttct ccaaggcctg tacgggtctg cacctgcacg tactaggtat agtagctgca  180actttattca caatgtgatg tcacgttatt atatatgttt cgtcgtcaat ggcggcgaac  240cttgcagggg acgacggccg ccggtgtgga ctgcggcggc ggccaccgca gcagcgccgg  300cggacacggc ggcgtcggcg cggcgggagc aggtggagat cgcccggtcg ctgaacgcgt  360gggtggagga gaac                                                    374<210>8<211>293<212>DNA<213>稻

 品种：IR24

 组织：雌蕊

 来源：

 文库名：衍生自雌蕊mRNA的λEPAII cDNA文库

 克隆名：RPC213<220><223>链型：双链

 拓朴构型：线性

 分子类型：针对修饰mRNA的修饰型cDNA

 特点：nt1，nt2：经引物延伸法测定的RPC213基因的转录起始点

       nt22：引入突变(T→A)

       nt134：引入突变(T→A)<400>8aaaggcagaa aagaaagcca aaggcgtctt caggcctcgc agttgcagca acagcctcgt   60cagcctggct ctgctgcccc aatcatcaca tccataccag cagcagcaga tctcgcaagc  120atcttcttct ccaaggcctg tacgggtctg cacctgcacg tactagggga cgacggccgc  180cggtgtggac tgcggcggcg gccaccgcag cagcgccggc ggacacggcg gcgtcggcgc  240ggcgggagca ggtggagatc gcccggtcgc tgaacgcgtg ggtggaggag aac         293<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>9cgctatggcc cgtttcagct                20<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>10gtcgtcctgt cgcttcatta c              21<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>11gtatccatga gactacatac aact           24<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>12tactcagcct tggcaatcca ca               22<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>13tgctggtatg gatgtgatg                   19<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>14ctgacgaggc tgttgctg                    18<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>15gacgtgatcc acggcattga cg               22<210>16<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>16cggggatccg ttctcctcca cccacgc          27<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>17gggtctagac ctgcacgtac taggtatagt agc   33<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>18caccccgggc cgtcgtcccc tgcaagg               27<210>19<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>19tcgtctagaa aggcagaaaa gaaagccaat g          31<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>20agcgggcccg ggttctcctc cacccacgc             29<210>21<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>21tcgtctagaa aggcagaaaa gaaagccaaa ggcgtc     36<210>22<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>22cttctccaag gcctgtacgg                       20<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>23ccgtacaggc cttggagaag                        20<210>24<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>24ccaatcatca catccatacc                        20<210>25<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>25ccgccgcagt ccacacc                           17