MAR组合提高重组CHO细胞转基因表达水平的研究

摘要

背景： 哺乳动物细胞表达系统由于其翻译后修饰类似于人源细胞而被广泛用于表达重组药物蛋白。中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞目前是生产治疗性重组蛋白的首选哺乳动物细胞系。转基因沉默和低表达水平是重组蛋白生产普遍存在的问题。前期实验已经证明，核基质结合区（matrix attachment region，MAR）能够提高CHO转基因表达，但MAR组合是否具备功能及其作用机制尚不清楚。 目的： 探讨MAR组合对重组CHO细胞转基因表达的影响及其调控机制。 方法： PCR扩增人β-干扰素（humanβ-interferon MAR，iMAR）和β-珠蛋白MAR（humanβ-globin MAR，gMAR）序列，使用无缝克隆技术将iMAR和gMAR片段分别连接到线性载体表达盒侧翼，构建分别由巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）或猴病毒（simian virus40，SV40）启动子驱动的重组质粒载体。转染CHO-K1细胞48h后，用荧光显微镜分析转染效率和增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）表达情况；G418加压筛选出CHO细胞稳定表达细胞株，流式细胞仪检测细胞EGFP的表达；生物信息学分析MAR组合对CHO细胞转基因表达的影响和作用机制。 结果： 在两种启动子驱动下MAR提高了重组质粒载体的转染效率，EGFP瞬时和稳定表达水平。不同的MAR（iMAR和gMAR）组合在CMV启动子作用下与在SV40启动子驱动下相比，EGFP的表达水平较高。而在SV40启动子驱动下两个gMAR的组合显示活性最高。此外，MARs能够增加稳定转染的阳性细胞克隆的比例。 结论： CMV启动子与两个不同MAR元件组合或SV40启动子与两个gMARs的结合，能够提高重组CHO细胞转基因表达水平及稳定性。

目录

第一个书签之前