含有单磷酸脂A的佐剂和疫苗组合物

摘要

本发明涉及单磷酸脂A、糖和任选地胺类表面活性剂的佐剂和疫苗组合物,当其冷冻和解冻或冻干和重建复原时,重形成用分光光度法测定光透射率大于或等于88%的胶态悬浮液。

说明书

发明背景

1.发明领域

本发明涉及改进的佐剂和疫苗组合物、制备所述改进的佐剂和疫苗组合物的方法，以及使用改进的组合物的方法。

2.现有技术的描述

许多年以来，采用常规的疫苗来保护人和动物抵抗各种各样的传染性疾病。通常，这些常规疫苗含有一种或多种抗原，这些抗原可包括减毒病原、死病原或病原的免疫原性组分。在一些疫苗中，仅用一种或几种抗原就可引起保护性免疫应答。在其它疫苗中，抗原和一种或多种佐剂一起使用来提高抗原的免疫原性。本领域已知的一种佐剂是单磷酸脂A(monophosphoryl lipid A)，其是从明尼苏达沙门氏菌R595的脂多糖衍生的。本领域已知单磷酸脂A是一种在含水环境中自发地凝聚的脂类物质。另外，已知这种凝聚的程度对作为免疫刺激剂的单磷酸脂A的活性有影响，即凝聚的单磷酸脂A的刺激性较小。

通常获得的，单磷酸脂A是冻干的白色粉末形式的三乙胺盐。由于高度疏水，当用水重建回收冻干的单磷酸脂A时，不易形成澄清的溶液，而是产生带有可见的大小不均匀的白色颗粒的混浊混合液，静置时这些颗粒沉淀并且进一步凝聚。为了制备单磷酸脂A的可接受水性制剂，已知应将冻干的单磷酸脂A三乙胺盐以1-2mg/ml(w/v)悬浮于含有0.2％三乙胺的水中，65-70℃加热该悬浮液，然后超声处理该混合液。得到的含水制剂淡乳色或澄清，是一种水性胶态悬浮液。三乙胺酸协助了单磷酸脂A的溶解，而且可用类似剂量的三乙胺代替。

当如上所述制备的单磷酸脂A的含水制剂冻融时，单磷酸脂A凝聚得到混浊的混合液，十分类似于超声处理前的单磷酸脂A混浊混合液。类似地，当上述单磷酸脂A的含水制剂被冻干，然后复水(rehydrate)时，结果同样也是凝聚的单磷酸脂A的混浊混合液。

发明概述

本发明为本领域提供了一种含有单磷酸脂A的冻干组合物，该组合物表现出提高的重建性能，该避免了本领域先前存在的沉淀和凝聚问题。具体地说，本发明提供一种冻干组合物，它含有单磷酸脂A、糖和任选的一种胺类表面活性剂，该组合物能用水性稀释剂重建和复水，而无需进一步超声处理，从而形成含水的单磷酸脂A的胶态悬浮液，用分光光度法测定的透光性至少为88％。本发明的冻干组合物，由5wt％以内的单磷酸脂A、70wt％以上的糖和0-30wt％任选添加的胺类表面活性剂组成，所述的wt％根据单磷酸脂A、糖和(如果存在)胺类表面活性剂的总重(计算)。较佳地，本发明的冻干组合物，由约5wt％以内的单磷酸脂A、约70-99.99wt％糖和约0-28wt％任选地添加的胺类表面活性剂组成。更佳地，本发明的冻干组合物由约4％以内的单磷酸脂A、约75-99.99wt％糖和约0-22％任选添加的胺类表面活性剂组成。该冻干组合物还可含有免疫有效剂量的一种或多种抗原。本发明的冻干组合物可以每毫升水性稀释剂约10-210mg冻干组合物(之比例)，用水性稀释剂重建或复水，无需进一步的超声处理，而形成含水的胶质悬浮液。

本发明的另一方面是制备单磷酸脂A的含水胶质悬浮液的方法，其中冷冻该含水胶质悬浮液来保藏，然后解冻供使用而无本领域先前所知的沉淀和凝聚问题。用该方法，单磷酸脂A与水性稀释剂混合，并且任选地与胺类表面活性剂，和同样任选地与一种或多种抗原混合。用超声处理形成含水胶态悬浮液，任选地用加热或其它已知的方法处理，如本文以下详细描述的。以约10mg/ml-200mg/ml量，在含水胶态悬浮液形成之前或之后将糖加入到该混合液中。糖可以是固体或水溶液形式。然后可冰冻得到的含水胶态悬浮液。解冻该冻结的含水胶态悬浮液，而无需进一步超声处理，如用分光光度法测定所示，含单磷酸脂A的含水胶态悬浮液的透光性大于或等于88％。如本文下述，可将一种或多种抗原加入到解冻的含水胶态悬浮液中，形成疫苗组合物，可将其给予脊椎动物。另外，如果在冷冻前该含水胶态悬浮液含有一种抗原，可解冻该疫苗组合物，并给予脊椎动物。

本发明的含水胶态悬浮液是一种特殊类型的液体悬浮液，其中悬浮的单磷酸脂A颗粒非常细密地分散但以不溶解的形式存在。本发明的含有单磷酸脂A、糖和任选地一种胺类表面活性剂的含水胶态悬浮液是真正的悬浮液，而非溶液，不具有象普通单磷酸脂A悬浮液那样的沉淀和凝聚特性。可用透光性确定本发明的含水胶态悬浮液的存在。因此，本发明的含有单磷酸脂A、糖和任选地一种胺类表面活性剂的含水胶态悬浮液，是一种显示透光性(用分光光度法测定)大于或等于88％的悬浮液。

在冰冻或冻干前，将糖加入到单磷酸脂A的含水胶态悬浮液中，本发明解决了本领域先前的沉淀和凝聚的问题。可在形成含水胶态悬浮液之前或之后加入糖，但必需是在悬浮液冰冻或冻干前加入。在冷冻或冻干前将糖加入到单磷酸脂A的含水胶态悬浮液中，提供的组合物在冷冻后被解冻时可得到含水胶态悬浮液，而无需进一步超声处理，或在冻干后用适合的水性稀释剂重建无需进一步超声处理而得到含水胶态悬浮液。适合的糖包括单糖，葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖，以及双糖，蔗糖、乳糖、异麦芽糖、麦芽糖和海藻糖。也可采用糖的混合物，如蔗糖和葡萄糖的混合。这些糖都是无毒的和药学上可接受的。优选蔗糖和葡萄糖。糖可以是固体形式或水溶液形式。适合的水性稀释剂包括水或盐水，也可包括一种或多种抗原，另外含有防腐剂或添加的佐剂或其它药学上可接受的添加剂、运载体或载体。适合的胺类表面活性剂包括三乙胺(TWA)和三乙醇胺(TEM)。

本发明的另一方面是一种重建或复水的含水胶态悬浮液，除了无需进一步超声处理的步骤外，其可用水性稀释剂重建上述的冻干组合物而得到。如本文所述，在本发明之前，为了得到含有单磷酸脂A的含水胶态悬浮液，必需有超声处理的步骤。然而，现已发现当将水性稀释剂加入到上述冻干组合物时，无需进一步超声处理就可得到含有单磷酸脂A的含水胶态悬浮液。如此得到的重建含水胶态悬浮液表现出的透光性大于或等于88％(用分光光度法测定)。令人惊讶的是，如此得到的重建含水胶态悬浮液在冷冻、解冻后再形成的含水胶态悬浮液也表现出大于或等于88％的透光性。本发明重建的含水胶态悬浮液由约每毫升水性稀释液2.5mg以内的单磷酸脂A、约10-200mg糖，和约0-6mg胺类表面活性剂组成。较佳地，本发明重建的含水胶态悬浮液是由每毫升水性稀释剂约2.0mg以内的单磷酸脂、约20-150mg糖，和约0-3mg胺类表面活性剂组成的。该重建的含水胶态悬浮液也可含有免疫有效剂量的一种或多种抗原。适合的糖、胺类表面活性剂和水性稀释剂如上所述。

本发明的另一方面内容是含有本文所述的冻干组合物和重建的含水胶态悬浮液联合免疫有效剂量的一种或多种抗原的疫苗组合物。可任选地在水性稀释剂中提供有效剂量的一种或多种抗原。具体地说，该疫苗组合物还包括免疫有效剂量的一种或多种抗原，所述的抗原是由细菌、病毒、寄生虫、癌细胞或变应原衍生或产生的。抗原的有效剂量的定义是当给予动物或人时，能诱发免疫应答(通过特异性抗体或细胞介导效应机制测定)的抗原剂量。一种或多种抗原的免疫有效剂量一般约为1μg或少于5mg。单磷酸脂A佐剂的有效剂量，是指当加入到疫苗时能提高对疫苗中的抗原免疫应答的数量或质量或持续时间的单磷酸脂A的量。佐剂单磷酸脂A的有效剂量为约1μg-1mg范围中。

对本发明疫苗组合物合适的抗原包括在接触抗原的哺乳动物体内能产生特异性针对该抗原的抗体或细胞介导免疫应答能力的任何抗原。可用一种或多种抗原。该抗原或这些抗原可从致病微生物衍生，包括病毒、细菌、支原体、真菌、原生动物和其它寄生虫。另外，所述的抗原可从除微生物以外的其它来源衍生，例如，癌细胞或变应原。该抗原或这些抗原可是致病微生物的全部或一部分，与微生物相关的蛋白、糖蛋白、糖脂、多糖或脂多糖的全部或一部分，或该抗原或这些抗原是模仿这些蛋白、糖蛋白、糖脂、多糖或脂多糖一部分或全部的多肽或其它实体。

可产生或衍生出用于疫苗的抗原的致病微生物对传染病领域来说是已知的，如下所列出的，例如Medical Microbiology，第二版，(1990)J.C.Sherris(ed.)，Elsevier Science Publishing Co.，Inc.，New York，和Zinsser Microbiology，第20版(1992)，W.K.Joklik等人(eds)，Appleton&Lange Publishing Division of PrenticeHall，Englewood Cliffs，New Jersey。可用于人疫苗的生物例子包括衣原体、未分型的猪流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、粘膜炎莫拉氏菌、淋病奈瑟氏球菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、伤寒沙门氏菌、肺炎链球菌、链球菌A族、链球菌B族、单纯性疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、流感、麻疹、副流感、呼吸道合胞体病毒、轮状病毒、诺沃克病毒等。

抗原可包括含有多糖抗原的糖偶联物，例如细菌荚膜多糖或其片段、化学连接于蛋白载体来提高免疫原性。本领域已熟知偶联细菌荚膜多糖和蛋白载体分子的方法，也可参考，例如Dick和Burret，Contrib Microbiol Immnuol.10：48-114(CruseJM，Lewis RE Jr.，eds；Basel Kruger(1989)。适合的偶联物包括肺炎球菌糖偶联物，更详细地公开于美国4,673,574、美国4,761,283、美国4,902,506、美国5,097,020和美国5,360,897，它们公开的内容本文全部纳入作为参考。

也提供了一种免疫接种哺乳动物的方法，包括将有效剂量的本发明疫苗组合物给予所述的哺乳动物。

也提供了制备冻干组合物的方法，包括：

a.在水性稀释剂中，以约5mg/ml以内的剂量，悬浮单磷酸脂A，和任选地，以约0-6mg/ml量悬浮胺类表面活性剂；

b.形成含水胶态悬浮液，用分光光度法测定其透光性大于或等于88％；

c.在形成含水胶态悬浮液之前或之后，加入约10-200mg/ml糖；

d.将含有含水胶态悬浮液的糖冻干；和

e.回收冻干组合物。

也提供了制备冻干组合物的方法，包括

a.在中等强度的无机酸中加热革兰氏阴性菌明尼苏达沙门氏菌R595的脂多糖足够的时间，得到单磷酸衍生物；

b.在有机溶剂中溶解该单磷酸衍生物，并干燥；

c.用弱碱处理该单磷酸衍生物，除去在该部位的碱性不稳定脂肪酸链，产生3-脱酰基单磷酸脂A；

d.通过液相层析纯化3-O-脱酰基-4’-单磷酸脂A，回收2-O-脱酰基-4’-单磷酸脂A；

e.将单磷酸脂A悬浮在水性稀释剂中，约5mg/ml以内的量，和任选地，以约0-6mg/ml量悬浮胺类表面活性剂；

f.形成含水胶态悬浮液，用分光光度法测定其透光性大于或等于88％；

g.在形成含水胶态悬浮液之前或之后，加入约10-200mg/ml糖；

h.将含有含水胶态悬浮液的糖冻干；和

i.回收冻干组合物。

还提供了制备含有能冷冻和解冻的单磷酸脂A的含水胶态悬浮液的方法，包括：

a.将将单磷酸脂A悬浮在水性稀释剂中，约5mg/ml以内的量，和任选地，以约0-6mg/ml量悬浮胺类表面活性剂；

b.形成含水胶态悬浮液，用分光光度法测定其透光性大于或等于88％；

c.在形成含水胶态悬浮液之前或之后，加入约10-200mg/ml糖；

d.冷冻含有含水胶态悬浮液的糖；和

e.解冻和回收该含水胶态悬浮液。

优选实施例的描述

美国专利No.4,912,094描述了单磷酸脂A的制备，这里全部纳入作为参考。简单地说，通过在中等强度的无机酸(0.1N HCl)溶液中回流从革兰氏阴性菌，明尼苏达沙门氏菌R595的非庚糖(heptoseless)突变体中获得的脂多糖(或脂A)，约30分钟。适合的无机酸包括氯化氢、硫酸等。该处理的结果是在葡糖胺还原端1-位点的磷酸酯分子的丢失。在该处理过程中，从非还原葡糖胺6’位点除去了核心碳水化合物。产生了脂A的单磷酸衍生物。在有机溶剂中溶解脂A的单磷酸衍生物，用非常弱的碱处理，来除去3位的碱性不稳定脂肪酸，产生3-O-脱酰基-4’-单磷酸脂A，表明葡糖胺还原端的3位被脱氧(de-O-)乙酰化。从化学角度说，它是3-脱酰基单磷酸脂A和4、5或6乙酰链的混合物。适合的有机溶剂包括甲醇(酒精)、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、氯仿、二氯甲烷等以及它们的混合。也可用水和这些有机溶剂的一种或多种的组合。适合的碱性基可选自各种氢氧化物、碳酸盐、磷酸盐和胺。范例性的碱基包括无机碱基如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾等，和有机碱基如烷基胺，以及包括，但并不限制于，二乙胺、三乙胺等。通过液相层析纯化该3-O-脱酰基-4’-单磷酸脂A，并转化成三乙胺(三乙铵)一元盐。

本文所用的术语单磷酸脂A是指作为三乙胺(三乙铵)一元盐的3-O-脱酰基-4’-单磷酸脂A。

为了制备本发明的冻干组合物，将单磷酸脂A加入到水性稀释剂中，较佳的是水，剂量为每毫升水性稀释剂约5mg以内的单磷酸脂A，较佳的是约2.5mg/ml以内，更佳的是约0.5-2.5mg/ml。任选地，剂量约0-6mg/ml，较佳的0-3mg/ml添加的胺类表面活性剂。

通过超声、任选地用加热或其它方法，来形成含水胶态悬浮液，其透光性用分光光度法测定大于或等于88％。加热是任选的，但其能促进形成单磷酸脂A的含水胶态悬浮液。适合的超声处理装置包括，例如，探头超声仪(Vibracell VCX600；Sonica)，其连接有大小适合于待处理体积的探头，或水浴超声仪，如LaboratorySupplies Co.Inc.，(Hicksville，NY)的No.G112SPIT型。其它在制药工业上使用的类似装置也适合用于超声处理单磷酸脂A。

可用超声处理以外的其它方法来形成单磷酸脂A的含水胶态悬浮液，如通过微流化装置产生的剪切力。

可在形成含水胶态悬浮液之前或之后加入糖，以每毫升水性稀释剂约10-200mg糖的剂量，较佳的是约20-150mg/ml。该含水胶态悬浮液，含有单磷酸脂A、糖和任选地加入的胺类表面活性剂，和任选地免疫有效剂量的一种或多种抗原(如上所述的剂量)，经冻干形成本发明的冻干组合物。

冻干单磷酸脂A、糖和任选的胺类表面活性剂、一种或多种抗原组成的含水胶态悬浮液，形成本发明的冻干组合物。如本领域技术人员所知，冻干是干燥的一种方法，在该方法中水被冷冻后因真空而从产品中升华。冻干或冷冻干燥的说明见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第84章，第1565页，18版，A.R.Gennaro，Editor，1990，Mack Pubilishing Company。

通过透光性测定以确定是否形成了含水胶态悬浮液。已发现透光性至少为88％的组合物表现出胶态悬浮液的特性。用1cm光程的光照射玻璃、石英或塑料比色杯中的样品液以分光光度计来测定透光性。该光可以是可见光谱或不可见光谱，但适宜使用650nm波长来测定这些类型的透光性。透过样品光的量(即透射量)要参考含有溶剂或稀释剂(用于溶解或悬浮物质的)的空白比色杯。不吸收或不散射光的样品，表现为100％透光性，而吸收或散射所有光的为0％透光性。

虽然不希望受理论的束缚，但据信得到了本发明的有利结果，是因为在形成含有单磷酸脂A的含水胶态悬浮液之前或之后加入了糖，从而防止了在冷冻或解冻含水胶态悬浮液时或冻干含水胶态悬浮液用水性稀释剂重建或复水时单磷酸脂A的凝聚。在冻干前，通过在含有单磷酸脂A的含水胶态悬浮液中加入糖，该冻干组合物可用水性稀释剂(如水或盐水)重建，而不会有单磷酸脂A再凝聚的问题。另外，冷冻重建的胶态悬浮液或疫苗组合物时也不会造成凝聚再发生。类似地，通过在冷冻前将糖加入到含有单磷酸脂A的含水胶态悬浮液，一旦解冻就可重新得到含水胶态悬浮液，而无需进一步超声处理。糖防止单磷酸脂A凝聚的能力明显，无论含有单磷酸脂A的含水胶态悬浮液是用水还是含有三乙铵或三乙醇胺的水制备。

因此，在形成含水胶态悬浮液之前或之后，将糖加入到含有单磷酸脂A的含水组合物中，当这种含水胶态悬浮液冷冻和解冻或冻干或重建时，都有令人惊讶的和未预计到的结果。这些结果进一步有利于制备疫苗组合物。

提供以下的实施例用于说明本发明。

实施例1

制备混浊混合液和测定透光性

以1mg/ml(w/v)将单磷酸脂A(RIBI ImmunoChem.，Hamiton，MT)悬浮于水中，形成带有大小不均匀的可见白色颗粒的混浊混合液。将该混浊混合液置于Shimadzu UV-1601，UV-Visible分光光度计中，用650nm波长的光照射。该混浊混合液让3.3％入射光穿过(即％透光度＝3.3)。未见含水胶态悬浮液。

实施例2

制备含水胶态悬浮液和测定透光性

以1mg/ml(w/v)，将单磷酸脂A悬浮于含有0.5％三乙醇胺(v/v)(5.62mg/ml(w/v))或0.2％三乙铵(v/v)(1.46mg/ml(w/v))的水中。在56-65℃加热该样品10-15分钟，用探头超声仪(Vibracell VCX600)以30％功率(圆锥形小尖头)或水浴超声仪(No.G112SPIT，Laboratory Supplies Co.Inc.，Hicksville NY.)全功率超声处理2-3分钟。得到一澄清的悬液，将其置于Shimadzu UV-1601，UV-Visible分光光度计上，用650nm波长的光照射。测定得％光透射率为≥88％，意味着形成了含水胶态悬浮液。

实施例3

制备单磷酸脂A的含水胶态悬浮液和冻干

以1、2或5mg/ml(w/v)将单磷酸脂A悬浮于水或含有0.5％三乙醇胺v/v(5.6mg/ml w/v)或0.2％三乙铵v/v(1.46mg/ml w/v)的水中，形成单磷酸脂A的含水胶态悬浮液。将各种单磷酸脂A的悬浮液56-65℃加热10-15分钟，然后超声处理共2-3分钟，得到澄清的悬浮液(无可见的颗粒)。用探头超声仪圆锥形小尖头(Vibracell VCX600)以30％功率，或水浴超声仪(No.G112SPIT，Laboratory Supplies Co.Inc.，Hicksville NY.)全功率超声处理样品(1-1.5ml)。将上述每份单磷酸脂A的含水胶态悬浮液用等量的水或蔗糖或葡萄糖溶液(各种不同浓度)稀释。得到的含水胶态悬浮液包括为0.5、1.0或2.5mg/ml(w/v)的单磷酸脂A、和终浓度为10、50、100或200mg/ml(w/v)的蔗糖或10、50、100或170mg/ml(w/v)的葡萄糖，见表1。这些制品含有2.81或5.62mg/ml的三乙醇胺(TEM)或0.73mg/ml三乙铵(TEA)或无胺类表面活性剂。将样品置于ShimadzuUV-1601，UV-Visible分光光度计上，用650nm波长的光照射。光透射率百分比，如表1所示，范围为90.0-99.9％，表明形成了含水胶态悬浮液。

表1单磷酸脂A组合物的配制

％光透射率样品MPLmg/ml加入的糖糖mg/ml加入的胺加入的胺mg/ml 1 0.5蔗糖10 TEM 2.81 97.2 2 0.5葡萄糖10 TEM 2.81 97.1 3 0.5蔗糖10 TEM 2.81 97.2 4 0.5葡萄糖10 TEM 2.81 97.3 5 0.5蔗糖10 TEM 0.73 98.9 6 0.5蔗糖10 TEM 0.73 98.4 7 0.5蔗糖50 TEM 5.62 95.9 8 0.5蔗糖50 TEM 5.62 96.0 9 0.5蔗糖50 TEM 2.81 97.4 10 0.5葡萄糖50 TEM 2.81 97.5 11 0.5蔗糖50 TEM 2.81 97.5 12 0.5葡萄糖50 TEM 2.81 97.4 13 0.5蔗糖50 TEM 0.73 98.8  14  0.5  蔗糖  50  TEM  0.73  99  15  0.5  蔗糖  50  -  0  96.1  16  0.5  蔗糖  50  -  0  96.0  17  0.5  蔗糖  100  TEM  2.81  97.6  18  0.5  葡萄糖  100  TEM  2.81  97.6  19  0.5  蔗糖  100  TEM  2.81  97.4  20  0.5  葡萄糖  100  TEM  2.81  97.6  21  0.5  葡萄糖  170  TEM  2.81  98.2  22  0.5  葡萄糖  170  TEM  2.81  98.1  23  0.5  葡萄糖  200  TEM  2.81  98.4  24  0.5  蔗糖  200  TEM  2.81  98.4  25  0.5  蔗糖  200  TEM  2.81  97.7  26  0.5  蔗糖  200  TEM  2.81  97.8  27  0.5  蔗糖  200  TEM  0.73  99.4  28  0.5  蔗糖  200  TEM  0.73  99.4  29  0.5  蔗糖  200  TEM  0.73  98.9  30  0.5  蔗糖  200  TEM  0.73  98.9  31  1.0  蔗糖  200  TEM  0.73  97.7  32  1.0  蔗糖  200  TEM  0.73  97.6  33  1.0  蔗糖  200  TEM  2.81  95.7  34  1.0  蔗糖  200  TEM  2.81  95.6  35  2.5  蔗糖  200  TEM  2.81  90.1  36  2.5  蔗糖  200  TEM  2.81  90.0  37  2.5  蔗糖  200  TEM  0.73  95.4  38  2.5  蔗糖  200  TEM  0.73  95.3

冻干单磷酸脂A佐剂组合物

表1所列出的含水胶态悬浮液的冻干方法如下，先将玻璃小瓶或聚丙烯培养管中的样品于干冰颗粒上冷冻至少30分钟。然后将它们转移到大的冷冻干燥容器(Labconco)中，并连接于Virtus Freeze Dryer(冻干机)上。在250millitor真空度，冷凝器温度为-50℃，冻干样品18小时。表2列出了冻干佐剂组合物的组分。

重建冻干的佐剂组合物

将表2中列出的冻干的样品，用体积相等于冻干前含水胶态悬浮液体积的水或普通盐水(0.9％NaCl w/v)重建。表2也列出了用水性稀释剂重建后，样品的光透射率百分比数据。如表2所示，含有75％以上至99.4％(重量)蔗糖或葡萄糖的冻干组合物，在用水或盐水复水时得到了含水胶态悬浮液。例如表2所示的1-38样品，复水后透射率百分比的范围为88.0-98.4％，表明形成了含水胶态悬浮液。冻干后含有99％糖(重量)的样品15和16，在超声处理时没有添加胺(三乙铵或三乙醇胺)来制备的。当用水或普通盐水复水时，测得的透射值百分数分别为96.1和93.6，表明形成了含水胶态悬浮液。这些数据显示当用超声处理制备的单磷酸脂A的含水胶态悬浮液，用有效剂量的糖(如蔗糖或葡萄糖)冻干，可用水或普通盐水复水，而重新得到含水胶态悬浮液。

表2用水或普通盐水复水后，冻干的单磷酸脂A组合物的光透射率特性

冻干后的组分Wt.％复水后光透射率  (％)样品％MPL％糖％添加的胺复水所用的稀释剂 1 3.8 75.1 21.1水95.8 2 3.8 75.1 21.1水96.1 3 3.8 75.1 21.1盐水95.5 4 3.8 75.1 21.1盐水65.4 5 4.5 89.0 6.5水96.5 6 4.5 89.0 6.5盐水94.8 7 0.9 89.1 10水95.7 8 0.9 89.1 10盐水95.7 9 0.9 93.8 5.3水96.0 10 0.9 93.8 5.3水96.6 11 0.9 93.8 5.3盐水95.7 12 0.9 93.8 5.3盐水96.3 13 1.0 97.6 1.4水98.4 14 1.0 97.6 1.4盐水96.3 15 1.0 99.0 0水96.1 16 1.0 99.0 0盐水93.6 17 0.5 96.8 2.7水96.4 18 0.5 96.8 2.7水97.1  19  0.5  96.8  2.7  盐水  95.8  20  0.5  96.8  2.7  盐水  96.8  21  0.3  98.1  1.6  水  97.4  22  0.3  98.1  1.6  盐水  96.6  23  0.2  98.4  1.4  水  97.7  24  0.2  98.4  1.4  盐水  96.8  25  0.2  98.4  1.4  水  97.2  26  0.2  98.4  1.4  盐水  96.9  27  0.2  98.4  0.4  水  98.4  28  0.2  98.4  0.4  盐水  96.7  29  0.2  99.4  0.4  水  95.5  30  0.2  99.4  0.4  盐水  96.7  31  0.5  99.1  0.4  水  97.1  32  0.5  99.1  0.4  盐水  96.1  33  0.5  98.1  1.4  水  95.0  34  0.5  98.1  1.4  盐水  94.6  35  1.2  97.4  1.4  水  89.8  36  1.2  97.4  1.4  盐水  88.0  37  1.2  98.4  0.4  水  94.8  38  1.2  98.4  0.4  盐水  90.8

实施例4

用实施例3所述的步骤，制备表3中所列出的含有单磷酸脂A、糖和胺的制备物。测定这些制备物的光透射率，并列于表3，％光透射率的范围为95.4-98.8，表明形成了含水胶态悬浮液。

表3单磷酸脂A制备物的组成

％光透射率样品MPLmg/ml加入的糖糖mg/ml加入的胺加入的胺mg/ml 39 0.5 - 0 TEM 5.62 95.8 40 0.5 - 0 TEM 2.81 95.8 41 0.5 - 0 TEA 0.73 98.8 42 0.5-0 - 0 95.8 43 0.5-0 - 0 95.9 44 0.5蔗糖0.5 TEM 5.62 95.5 45 0.5蔗糖1 TEM 5.62 95.4 46 0.5蔗糖5 TEM 5.62 95.5 47 0.5蔗糖10 TEM 5.62 95.6

用实施例3所述的步骤，冻干表3中的制备物，并如表4所示用水或盐水重建。

表4用水或普通盐水复水后，冻干的单磷酸脂A制备物的光透射特性

冻干后的组分Wt.％复水后％光透射率样品％MPL％糖％添加的胺复水所用的稀释剂复水后 39 8.2 0.0 91.8水58.6 40 15.1 0.0 84.9水58.2 41 40.7 0.0 59.3水22 42 100.0 0.0 0水32.8 43 100.0 0.0 0盐水30.2 44 7.6 7.6 84.9水63.1 45 7.0 14.0 78.9水64.7 46 4.5 45.0 50.5水50.6 47 3.1 62.0 34.9水83.5

当用水或盐水复水无糖的冻干样品(39-43)时，得到的制备物是混浊的，带有悬浮颗粒。这些样品的％透射率范围为22.0-58.6。当用水复水含有7.6-62.0％糖的样品44-47时，也得到类似的结果，表明没有形成含水胶态悬浮液。

实施例5

含糖的含水三乙铵中超声处理的单磷酸脂A的冷冻和解冻

在含有0.2％三乙铵(v/v)的水中超声处理单磷酸脂A，然后与等体积的水或添加蔗糖的水混合，得到澄清的含有0.5mg/ml(w/v)单磷酸脂A无蔗糖，或含有100mg/ml蔗糖w/v和终浓度为0.1％v/v(0.73mg/ml w/v)的三乙铵的悬浮液。将样品(48和49)置于Shimadzu UV-1601，UV-visible分光光度计上，用650nm波长的光照射，每种都让98.8％的光穿过，表明形成了含水胶态悬浮液。将胶态悬浮液冷冻，然后解冻。一旦解冻，无蔗糖的单磷酸脂A制备物(样品48)为带颗粒的混浊，且用Shimadzu UV-1601，UV-visible分光光度计以650nm波长的光照射，测得其光通透率为60.3％，表明没有形成含水胶态悬浮液。而含有蔗糖的单磷酸脂A(样品49)在冷冻和解冻后，保持清澈，且用Shimadzu UV-1601，UV-visible分光光度计以650nm波长的光照射，测得其光通透率为97.8％，表明形成了含水胶态悬浮液。这些数据显示于表5。

表5用三乙铵超声处理和有或无蔗糖稀释的单磷酸脂A冻融前和后的光透射性能

MPL制备物的组成％光透射率样品MPL(mg/ml)蔗    糖(mg/ml)加入的TEA  (mg/ml)冷冻前解冻后解冻后的外观48 0.5 0 0.73 98.8 60.3混浊49 0.5 100 0.73 98.8 97.8清澈

实施例6制备疫苗组合物

a.制备单磷酸脂A的含水胶态悬浮液

用上述实施例3列出的步骤，加热0.5mg/ml单磷酸脂A(用水配制的)和2.8mg/ml胺类表面活性剂三乙醇胺的混合液，并超声处理，产生含水胶态悬浮液。在超声处理之前或之后，但在冷冻或冻干之前加入终浓度在约10-200mg/ml之间的蔗糖。则得到的含水胶态悬浮液用于疫苗组合物时，既可冷冻和解冻，也可冻干和用水性稀释剂重建。

b.从冷冻的单磷酸脂A组合物制备含水疫苗组合物

将如上述(a)制备的单磷酸脂A、蔗糖和三乙醇铵的含水胶态悬浮液冷冻。然后解冻，与含有抗原(如按美国专利No.5,360,897制备的肺炎球菌糖偶联物)的水性稀释剂混合，得到每毫升含有约400μg单磷酸脂A和200μg肺炎球菌糖偶联物的疫苗组合物。为了得到含有400μg单磷酸脂A和200μg肺炎球菌糖偶联物的疫苗组合物，例如，可将0.8ml解冻的胶态悬浮液和用0.2ml水配制的200μg肺炎球菌糖偶联物混合。然后将该疫苗组合物给予脊椎动物，较佳的是人，每剂量用约0.1-1.0ml。

c.从冻干的单磷酸脂A组合物制备含水疫苗组合物

将上述(a)的单磷酸脂A、蔗糖和三乙醇铵的含水胶态悬浮液冻干。然后用含有抗原(例如按美国专利No.5,360,897制备的肺炎球菌糖偶联物)的水性稀释剂重建，得到每毫升含有约400μg单磷酸脂A和约200μg肺炎球菌糖偶联物的疫苗组合物。然后将该疫苗组合物给予脊椎动物，较佳的是人，每剂量用约0.1-1.0ml。

d.制备冻干的含水疫苗组合物

在上述(a)的单磷酸脂A、蔗糖和三乙醇胺的含水胶态悬浮液中加入抗原，例如按美国专利No.5,360,897制备的肺炎球菌糖偶联物，得到疫苗组合物。然后冷冻该疫苗组合物。在冷冻之前或冷冻和解冻之后，通过添加水性稀释剂来调节单磷酸脂A和肺炎球菌糖偶联物的浓度，分别为400μg/ml和200μg/ml，只要在冷冻前蔗糖的浓度保持约10-200mg/ml。然后可将冻融的疫苗组合物给予脊椎动物，较佳的是人，每剂量用约0.1-1.0ml。

e.制备冻干的疫苗组合物

在上述(a)制备的单磷酸脂A、蔗糖和三乙醇胺的含水胶态悬浮液中加入抗原，例如按美国专利No.5,360,897制备的肺炎球菌糖偶联物，得到疫苗组合物。可在加热和超声处理步骤之前或之后，加入抗原。计算出加入的肺炎球菌糖偶联物的量，使得后来重建的冻干疫苗组合物水混合液中含有约400μg/ml的单磷酸脂A和约200μg/ml肺炎球菌糖偶联物。然后冻干该疫苗组合物。冻干后，用水性稀释剂重建该组合物。然后可将重建的含水疫苗组合物给予脊椎动物，较佳的是人，每剂量用约0.1-1.0ml。