公开/公告号CN1256695A
专利类型发明专利
公开/公告日2000-06-14
原文格式PDF
申请/专利权人 巴斯德·赛诺菲诊断剂公司;
申请/专利号CN98805202.4
申请日1998-04-06
分类号C07K14/16;C12N7/00;
代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所;
代理人陈文平
地址 法国马恩科奎特
入库时间 2023-12-17 13:37:56
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-05-01
专利权有效期届满 IPC(主分类):C07K14/16 授权公告日:20050817 申请日:19980406
专利权的终止
2012-03-21
专利权人的姓名或者名称、地址的变更 IPC(主分类):C07K14/16 变更前: 变更后: 申请日:19980406
专利权人的姓名或者名称、地址的变更
2005-08-17
授权
授权
2000-06-21
实质审查请求的生效
实质审查请求的生效
2000-06-14
公开
公开
本发明涉及可用于检测O组HIV-1病毒感染的生物试验的合成肽,它们的制备方法,包含这些肽的组合物和试剂盒以及使用这些肽的生物试验。
现有技术已知O组HIV-1逆转录病毒。专利EPO,345,375和专利申请EPO,657,532描述了从卡麦隆病人分离的ANT 70和ANT 70 NA分离物。这些文献更具体地描述了和包含这些分离物的裂解物或蛋白的抗原和抗原组合物,对应于基因组RNA的核酸,使用这些核酸的杂交方法,制备上述分离物的方法以及制备这些逆转录病毒的p12、p16、p25、gp41和gp120蛋白的方法。
申请EPO,591,914描述了MVP5180/91分离物。如以前的分离物,通过蛋白质印迹表征的该分离物显示与已知很长时间的HIV-1逆转录病毒分离物有差异。申请EPO,591,914精确地描述了MVP5180/91分离物的DNA序列并精确地定位了gag,pol和env基因。申请EP 0,591,914进一步描述了V3环的合成肽以及免疫显性区(gp41)。它们可用于生物试验,尤其是用于体外检测组O HIV-1抗体。
申请EP 0,673,948描述了由15-50个氨基酸(AA)组成并包含序列-VWGIRQLRARLQALETLIQNQQRLNLWGXKGKLIXYTSVKWNTSWSGR-的合成或重组肽,其中X代表半胱氨酸残基或丝氨酸残基。这些肽可用于诊断领域,用于检测一些O组HIV-1逆转录病毒分离物的感染。
还已知申请EP0,727,483描述了形成属于O组HIV-1家族的逆转录病毒一部分的MVP2901/94分离物。该申请描述了一些具有充分确定的肽序列的抗原。这些肽序列对应于MVP2901/94分离物的gp120序列的一部分和gp41的一部分(免疫显性区)。
申请WO96/12809描述了两种属于O组HIV-1家族的新的分离物。它们为VAU和DUR分离物。该申请描述了一些来自上述两种病毒的可用于检测识别HIV-1 VAU或DUR肽序列的抗体的肽序列。
申请WO96/32293描述了来自ANT 70分离物序列的两种抗原。它们为gp41的免疫显性区的被称为MDL061的抗原和抗原MDL056。根据本发明,为了检测100%的来自被O组HIV-1病毒感染的病人的有限血清收集物的样品,必须使用包含这两种肽的组合物,因为每种分离的肽其本身不能获得满意的结果。
的确,根据O组病毒分离物显示的遗传可变性,通过使用来自相同和唯一分离物的抗原保证感染个体的血清学筛选几乎是不可能的。这意味着不可能获得保证100%灵敏度的试剂。因此,O组首次成为重要问题;即某血清学试剂不能充分识别被特别不同的组或亚类感染的个体。对于0组HIV-1病毒尤其是这种情况。
申请WO96/40763还强调O组的很大的差异性。该申请描述了将一些较小的修饰(一个或两个氨基酸置换)掺入至天然B型HIV-1序列中的肽。根据该申请,这些杂合肽能与抗O组抗体反应。
申请WO96/27013描述了一系列被称为BCF01、BCF02、BCF03、BCF06、BCF07、BCF08、BCF09、BCF11、BCF12、BCF13和BCF14的新的O组HIV-1病毒以及一系列被称为ESS/BCF02、FAN/BCF01、LOB/BCF06、M/AN/BCF07、NKO/BCF08、POC/BCF03、NAM/BCF11、BCF09、BCF12、BCF13和BCF14的相应的gp41免疫显性区的肽。由于其低溶解性,尤其是肽BCF13,许多这些肽难于在诊断中应用。
出乎意料地,现发现一些合成肽为具有优异品质的诊断试剂,它们使得能满意地筛选被O组HIV-1逆转录病毒感染的病人。这些肽由在高度保守的短序列周围连接的可变序列组成,所述保守序列存在于O组HIV-1逆转录病毒所有分离物中。本发明的肽使得能获得优于用带有一些O组HIV-1分离物的gp41(env)的免疫显性表位的合成肽所获得的结果。
以下将使用三字母命名法来命名氨基酸。
本发明的合成肽对应于通式(I):
Δ-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSer-Ω (I)其中-Δ代表生物素残基、生物胞素残基、氢原子、乙酰基(CH3CO-)、可含一个或两个巯基、醛或胺官能基团的脂族链,脂族链优选为1至6个碳原子的烷基链或2至6个碳原子的链烯基链,或2至6个碳原子的氨基烷基羰基链,-Z代表式(II)-(X)之一的肽序列:
-Ξ1-Ser-Ξ2- (II)
-Ser-Ξ2- (III)
-Ξ1-Ser- (IV)
-Ξ1-Gln-Ξ2- (V)
-Gln-Ξ2- (VI)
-Ξ1-Gln- (VII)
-Ξ1-Asn-Ξ2- (VIII)
-Asn-Ξ2- (IX)
Ξ1-Asn- (X)
其中
-Ξ1代表0-9个氨基酸的肽序列,和
-Ξ2代表0-5个氨基酸的肽序列,-Θ代表式(XI)的肽序列:
-(AA1)-(AA2)-(AA3)-(AA4)-(AA5)- (XI)
其中:
·(AA1)代表赖氨酸或精氨酸残基,或鸟氨酸残基,
·(AA2)代表甘氨酸残基或天冬酰胺残基,
·(AA3)代表赖氨酸或精氨酸残基,或鸟氨酸残基,
·(AA4)代表亮氨酸残基,或丙氨酸残基或异亮氨酸残基或谷氨酰胺残基,
·(AA5)代表异亮氨酸残基,或缬氨酸残基或亮氨酸残基或苏氨酸残基,或正亮氨酸残基或正缬氨酸残基,
前提是(AA1)、(AA2)、(AA3)、(AA4)和(AA5)不一起形成肽序列-LysGlyLysLeuIle和-LysGlyLysLeuVal-,与丝氨酸的-CO-基团相连的Ω代表:
-羟基(-OH)基团或氨基(-NH2)基团,
-包含1-6碳原子的烷氧基基团,
-式(XII)的肽序列:
-Val-Σ-Ψ(XII)
其中Σ代表式(XIII)或式(XIV)序列
-(AA6)-Trp Asn-(AA7)-(AA8) (XIIIH)
-(AA6)-Trp His-(AA7)-(AA8) (XIV)
其中:
·(AA6)代表不同于赖氨酸的氨基酸,
·(AA7)代表一个氨基酸,
·(AA8)代表丝氨酸或苏氨酸残基,
与游离AA8氨基酸的-CO-残基相连的Ψ代表OH或NH2基团或包含1-6个碳原子的烷氧基基团,
-式(XV)的肽序列:
-Val-Ψ (XV)
其中与缬氨酸-CO-残基相连的Ψ具有如式(XII)中相同的含义,
-或式(XVI)-(XVIII)之一的肽序列:
-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSer-Ψ (XVI)
Val-Σ-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSerVal-Σ-Ψ (XVII)
Val-Z-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSerVal-Ψ (XVIII)
其中Z和Θ具有式(I)给定的定义,Σ具有式(XII)给定的定义,与丝氨酸的-CO-残基、AA8氨基酸的-CO-残基或缬氨酸的-CO-残基相连的Ψ具有如式(XII)中相同的含义。
当Ω代表式(XVI)-(XVIII)之一的肽序列时,式(I)的肽变为其大小可从26变化至66个氨基酸的二聚体。当Ω不代表式(XVI)-(XVIII)之一的肽序列时,式(I)的肽为单体类型并且其大小可从13个氨基酸变化为33个。
本发明的肽可为线性形式或为通过半胱氨酸之间的二硫桥环化的形式。
优选其中(AA5)代表缬氨酸残基,或亮氨酸残基或苏氨酸残基的式(I)化合物,并且当Ω对应于式(XII)的肽序列时,(AA6)代表谷氨酰胺或精氨酸残基。
优选式(I)的肽,其中-Δ代表生物素残基、氢原子、可包含一个或两个巯基、醛或胺官能基团的脂族链,脂族链优选为1至6个碳原子的烷基链,或2至6个碳原子的氨基烷基羰基链,-Z代表式(II)或(V)的肽序列—其中Ξ1代表两个氨基酸的肽序列和Ξ2代表一个氨基酸,或式(IV)的序列—其中Ξ1代表三个氨基酸,或式(VIII)的肽序列—其中Ξ1代表九个、八个或三个氨基酸的肽序列和Ξ2代表五个氨基酸的肽序列,-Θ代表下式的肽序列:
-Lys Gly Arg Leu Val-,
-Arg Gly Lys Ala Val-,
-Arg Gly Arg Leu Val-,或
-Arg Gly Arg Ala Val-,和-Ω代表羟基、肽序列(XV)或对应于式(XII)肽序列的下列序列之一:
-Val Arg Trp Asn Glu Thr-Ψ,
-Val Gln Trp Asn Glu Thr-Ψ
或
-Val Gln Trp Asn Ser Thr-Ψ.
优选地,Z代表下式的肽序列:
· -Leu Leu Ser Ser-
· -Leu Leu Asn Ser-
· -Leu Leu Gln Ser-
· -Arg Leu Asn Ser-
· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser-
· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu-
· -Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile-
· -Leu Asn Gln Gln Arg Leu LeuAsn Ser-
或
·-Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser-
同样形成本发明一部分的是包含20至50个氨基酸并对应于式(Ia)的合成肽:
Δ-Za-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSer-Ωa (Ia)其中Za代表式IIa-Xa的基团:
Ξ1a-Ser-Ξ2a (IIa)
-Ser-Ξ2a (IIIa)
-Ξ1a-Ser (IVa)
Ξ1a-Gln-Ξ2a (Va)
-Gln-Ξ2a (VIa)
Ξ1a-Gln- (VIIa)
Ξ1a-Asn-Ξ2a (VIIIa)
-Asn-Ξ2a (IXa)
-Ξ1a-Asn (Xa)其中-Ξ1a代表1-15个氨基酸的肽序列,和-Ξ2a为一个氨基酸,-Ωa如式(I)所定义代表式(XII)的肽序列,或式(XVIIa)的肽序列:
Val-Σ-Za-TrpGlyCys-Θ-CysTyrThrSerVal-Σ-Ψ (XVIIa)其中Za具有式(Ia)指定的含义,及Δ、Θ、Σ和Ψ具有如式(I)的相同含义。
优选包含下面序列的式(I)或(Ia)的肽(这些肽可为如上所定义的二聚体形式或单体形式)。根据一字母和三字母命名法给出序列。
序列No.1-LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Glu Thr-
22
序列No.2-LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Glu Thr-
22
序列No.3-LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Glu Thr-
22
序列No.4-LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST-或-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Ser Thr-
22
序列No.5-LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST-或-Leu Leu Gln Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Ser Thr-
22
序列No.6-LLNSWGCRGKAVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Glu Thr-
22
序列No.7-LLSLWGCRGRAVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Leu Trp Gly Gys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Glu Thr-
22
序列No.8-LLSSWGCRGRLVCYTSVQWNET-或-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Glu Thr-
22
序列No.9:-LLSSWGCKGRLVCYTS-或-Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser- 1 5 10 15
序列No.10:-LLNSWGCKGRLVCYTS-或-Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser- 1 5 10 15
序列No.11:-ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET-或-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly 1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr-20 25 30
序列No.12:-ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVRWNET-或-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile Trp Gly Cys Arg Gly 1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr-20 25 30
序列No.13:-ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET-或-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu Trp Gly Cys Arg Gly 1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr-20 25 30
序列No.14:-LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV-或-Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr 1 5 10 15Thr Ser Val-20
序列No.15:-RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV-或-Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys 1 5 10 15Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val-20 25
序列No.16:-RLNSWGCKGRLVCYTSV-或-Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val- 1 5 10 15
下列合成肽是特别优选的肽:
肽No.1(2B):SEQ ID No.1LLSLWGCRGKAVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Glu Thr
22
肽No.2(3B):SEQ ID No.2LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Glu Thr
22
肽No.3(4B):SEQ ID No.3LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Glu Thr
22
肽No.4(5B):SEQ ID No.4LLSSWGCKGRLVCYTSVQWNST或Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Ser Thr
22
肽No.5(6B):SEQ ID No.5LLQSWGCKGRLVCYTSVQWNST或Leu Leu Gln Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Ser Thr
22
肽No.6:SEQ ID No.6LLNSWGCRGKAVCYTSVQWNET或Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly Lys Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Glu Thr
22
肽No.7:SEQ ID No.7LLSLWGCRGRAVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Ala Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Glu Thr
22
肽No.8(7B):SEQ ID No.8LLSSWGCRGRLVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Glu Thr
22
肽No.9(12B):SEQ ID No.9LLSSWGCKGRLVCYTS或Leu Leu Ser Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15
肽No.10(14B):SEQ ID No.10LLNSWGCKGRLVCYTS或Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser 1 5 10 15
肽No.11(18B):SEQ ID No.11ALETLLQNQQLLNSWGCRGRLVCYTSVRWNET或Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Arg Gly 1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr20 25 30
肽No.12(19B):SEQ ID No.12ALETLLQNQQLLNIWGCRGRLVCYTSVRWNET或Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asn Ile Trp Gly Cys Arg Gly 1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr20 25 30
肽No.13(20B):SEQ ID No.13ALETLLQNQQLLDLWGCRGRLVCYTSVRWNET或-Ala Leu Glu Thr Leu Leu Gln Asn Gln Gln Leu Leu Asp Leu Trp Gly Cys Arg Gly 1 5 10 15Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Arg Trp Asn Glu Thr20 25 30
肽 No.14(21B):SEQ ID No.14LNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV或Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr 1 5 10 15Thr Ser Val20
肽No.15(22B):SEQ ID No.15RALETLLNQQRLLNSWGCKGRLVCYTSV或Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Asn Gln Gln Arg Leu Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys 1 5 10 15Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val20 25
肽 No.16(23B):SEQ ID No.16RLNSWGCKGRLVCYTSVorArg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Lys Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val 1 5 10 15
可按照常规方法通过固相合成获得作为本发明主题的式(I)的合成肽:R.B.Merrifield,美国化学协会杂志(1963),85,pp.2149-2154;R.C.Sheppard,“肽1971”,Nesvadba H.(编)北荷兰,阿姆斯特丹,pp.111;E.Atherton和R.L.Sheppard,“固相肽合成,实用方法”,IRL PRESS(1989),Oxford University Press,pp.25-34。作为自动合成仪,可使用来自Millipore的合成仪“9050 Plus Pep Synthesizer”或等同的合成仪。
用于合成的固相载体应与所使用的技术和化学性质相容。例如,对于在合成仪“9050 Plus Pep.Synthesizer”上合成,推荐使用适宜于所谓的“连续流动”技术的树脂;PEG PS树脂满足这些标准。这些载体由位于聚苯乙烯珠功能团和第一个氨基酸的连接点之间的基于聚乙二醇(PEG)的臂(间隔臂)组成。该锚定点的特性可根据所选择的C-末端官能基团而变化。在本发明的情况下,使用各种PEG-PS树脂。
起始树脂和作为原料使用的氨基酸为有商业供应的产品(PerSeptive-Biosystem,或Néosystem)。
对于肽合成,使用了下面的侧链保护基团:
所用氨基酸的α位的伯胺官能基团的暂时的保护为9-芴基甲氧羰基(Fmoc)基团。用20%的哌啶/二甲基甲酰胺溶液进行去保护。
为了偶联,优选使用过量的二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)和1-羟基苯并三唑(HOBt)。
合成后,将树脂用有机溶剂(二甲基甲酰胺,接着是二氯甲烷)洗涤,真空干燥并接着用冷却至0℃并包含适宜“清除剂”的三氟乙酸(TFA)溶液处理。可使用例如包含82%三氟乙酸、5%苯酚、5%水、5%苯甲硫醚和3%乙二硫醇的K试剂。
过滤树脂后,沉淀合成的肽并用乙醚漂洗。
通过反向液相色谱纯化合成的肽,通过质谱测定其纯度。作为固定相,可使用例如Bondapak C-18相。通过在两种缓冲液中形成线性梯度来洗脱肽,第一种本质上为水溶液(例如水-0.1%TFA),第二种近乎有机溶液(例如包含60%乙腈,39.92%水和0.08%TFA的混合物)。混合收集的纯的级分,真空浓缩并冷冻。
为了环化,将纯化的合成肽溶解在乙酸铵溶液(10mM)中。通过加入1M氢氧化铵将pH调至8.5。剧烈搅拌溶液。18小时后完成环化。通过加入乙酸将pH降至6。将环化的肽冷冻干燥,接着如上所述通过反向液相色谱纯化。
借助于主要为卡麦隆来源的被O组HIV-1逆转录病毒感染的病人的血清来评价本发明肽的免疫反应性。进行的各种试验表明,本发明的肽单独或结合(肽的组合物)使得能检测100%的被O组HIV-1逆转录病毒感染的血清。
因此本发明的合成肽在用于检出O组HIV-1逆转录病毒感染的免疫试验中找到了应用。还可使用一些式I的合成肽的组合。可包含两种或多种式I肽的这些组合也组成本发明的一部分。优选包含肽No.1(2B)和No.3(4B)的组合。
还可与可通过常规方法获得的并具有例如申请EPO,591,914中描述的序列的O组HIV-1重组肽(重组蛋白)结合使用本发明式(I)的合成肽。这些组合物也在本发明的范围内。
本发明的合成肽还可与其它HIV-2和/或HIV-1重组(重组蛋白)或合成肽,如专利申请或专利EPO,387,914,EPO,239,425,EPO,220,273或EPO,267,802中描述的肽结合使用。这些专利申请或专利不是穷举性的,只是给出作为实例。
包含一种或多种式(I)合成肽和一种或多种HIV-1或HIV-2重组或合成肽的组合物在用于检出被各种HIV逆转录病毒感染的病人的诊断中找到了应用。这些组合物也构成本发明的一部分。
单独或与O组HIV-1重组肽或HIV-1和/或HIV-2重组或合成肽结合使用一种或多种式(I)的合成肽的免疫分析也构成本发明的一部分。
本发明还涉及用于进行免疫分析的包括式(I)肽的试剂盒或包含至少一种式(I)肽的组合物。
下面的实施例说明本发明但并是不限制性的。实施例1:本发明的化合物的制备:肽No.2(3B)LLSLWGCRGRLVCYTSVQWNET或Leu Leu Ser Leu Trp Gly Cys Arg Gly Arg Leu Val Cys Tyr Thr Ser Val Gln Trp Asn 1 5 10 15 20Glu Thr
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在固相上合成该肽。由Merrified于1963年开发的技术(美国化学协会杂志(1963)85,pp.2149-2154)是将第一个氨基酸通过其酸官能团连接至聚合物固体载体(树脂)上,以及从该第一个氨基酸延伸肽序列,合成中的肽保持锚定在树脂上。
对于肽No.2的合成,作为合成仪,使用了合成仪“9050 Plus PepSynthesizer”,并且用树脂Fmoc Thr(OtBu)PEG PS作为树脂。
合成的各步骤总结在下面表1中:
表I
在合成的最后,将树脂用二甲基甲酰胺洗涤并接着用二氯甲烷洗涤并真空干燥。
接着,将树脂用K试剂(82%三氟乙酸;5%苯酚;5%水;5%苯甲硫醚,3%乙二硫醇)处理。通过用乙醚沉淀分离肽No.2(3B),接着用相同溶剂漂洗。由此获得140mg肽No.2(3B)。
然后将肽No.2(3B)通过反相液相色谱纯化。使用Bondapak C-18柱作为固定相。在两种缓冲溶液之间形成线性梯度来洗脱该肽,第一种基本为水溶液(例如水-0.1%TFA),第二种近于有机溶液(例如含60%乙腈、39.92%水和0.08%TFA的混合物)。合并所收集的纯级分,真空浓缩并冷冻干燥。
为了进行环化,将如此得到的纯化肽溶解在乙酸铵溶液(10mM)中。加入1M氢氧化铵调pH至8.5。剧烈搅拌该溶液,18小时后完成了环化。然后加入乙酸将pH降至6。将环化的肽冻干,然后如上所述通过反相液相色谱纯化。
本发明化合物的制备:肽No.15(22B)
如肽No.2(3B)那样合成了该肽,但使用树脂FmocPAL PEG-PS。
合成的各个步骤总结在下表II中:
表II
在合成的最后,用二甲基甲酰胺,然后用二氯甲烷洗涤树脂,并真空干燥。
随后,用K试剂(82%三氟乙酸、5%苯酚、5%水、5%苯甲硫醚、3%乙二硫醇)处理该树脂。用乙醚沉淀分离后,肽No.7(22B)用相同溶剂漂洗。这样得到140mg肽No.15(22B)。
接着通过反向液相色谱纯化肽No.15(22B),接着如上对于肽No.2(3B)所述进行环化、冷冻干燥并纯化。
以相同方式,并且使用适宜的树脂和氨基酸合成了其他的本发明化合物。
表III表示通过质谱测定的非环化形式的一些式(I)肽的分子量。
表III
使用的ESS、DUR、VAU和HAD血清为来自被O组HIV-1逆转录病毒感染的法国病人的血清。其它被O组HIV-1逆转录病毒感染病人的血清样品通过卡麦隆的YaoundéPasteur中心获得并根据“爱滋病杂志(AIDS)”(1977),11,pp.445-453中描述的血清学方法血清分型为O组。
从健康的自愿者中获得HIV-阴性血清(n=48)
将使用的合成肽以1mg/ml的浓度溶解在水中(贮液)。为了固相敏化步骤(包被),将110μl的2μg/ml各种肽(通过将贮液用0.1M碳酸盐缓冲液稀释获得)加入至微量滴定平板MicrotiterTM(NUNC)的各孔中。在室温下保温过夜后,首先将微量平板用包含0.1%Tween20和0.001%硫柳汞钠的Tris-NaCl缓冲液溶液(pH7.4)洗涤,接着用包含0.5%RegilaitTM(干脱脂奶粉)的PBS溶液饱和。在抽出饱和溶液后,50℃下将平板加热10分钟。
将血清样品用脱脂奶粉溶液(补充有0.01%苯酚红,0.25%氯仿和0.25%Kathon的柠檬酸缓冲液中)以1/5进行稀释,沉积在平板的各孔中并在40℃下保温30分钟。
在用包含0.1%Tween20和0.001%硫柳汞钠的Tris-NaCl缓冲液溶液(pH7.4)洗涤后,将100μl由辣根过氧化物酶标记的抗人IgG和IgM山羊抗体偶联物的包含0.01%硫柳汞钠作为保存剂的柠檬酸缓冲液溶液加入至各孔中,接着在40℃下将平板保温30分钟,其中该柠檬酸缓冲液中补充有30%甘油和25%正常胎牛血清。
在用包含0.1%Tween20和0.001%硫柳汞钠的Tris-NaCl缓冲液溶液(pH7.4)洗涤后,通过向各孔中加入100μl邻苯二胺的过氧化氢溶液显色。接着将微量平板在室温以及黑暗中保温30分钟。通过加入100μl 4N硫酸终止产色反应。在490nm和620nm测定吸光率(A)。
各孔中读取的相对吸光率(A490-A620)与各肽的免疫反应性成正比。它表明各肽与进行试验的生物样品反应的能力。阈值被确定为等于0.15的吸光度。它相当于阴性值的平均值(n=48)加上12个标准偏差。
将本发明肽(肽No.3(4B),肽No.2(3B)和肽No.1(2B),均为环化形式)的反应性与具有VAU分离物(O组HIV-1逆转录病毒)的被膜(env)天然序列一部分并包含gp 41的免疫显性表位的两种合成肽的反应性进行了比较。
这两种肽具有下面的序列:VAU 22 AALeu Leu Asn Leu Trp Gly Cys Lys Asn Arg Ala Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn 1 5 10 15 20Lys Thr
22VAU 35 AAArg Leu Leu Ala Leu Glu Thr Phe Ile Glu Glu Asn Glu Leu Leu Asn Leu Trp Gly Cys 1 5 10 15 20Lys Asn Arg Ala Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn Lys Thr
25 30 35 为了该研究,使用环化形式的这些肽。研究结果示于表IV中。
表IV
表IV(续)
表IV结果表明根据对其它肽的观察,肽No.3(4B)显示最好的性能。与具有对应于gp41的免疫显性表位的VAU分离物部分序列的两种肽比较,该肽使得能最好地辨别被O组HIV-1逆转录病毒感染的病人血清。而且,本发明的肽No.2(3B)和No.1(2B)比包含相同数目氨基酸的VAU 22 AA肽免疫反应性高。实施例3:通过免疫酶试验对根据本发明的肽的免疫反应性的评价:试验No.2
来自O组HIV-1逆转录病毒感染病人的血清样品通过卡麦隆的Yaounde Pasteur中心获得,并根据“爱滋病”(1977),11,pp.445-453中描述的血清学方法被血清分型为O组。从美国获得基因分型的样品(Maryland)。为了对于不同的免疫反应性试验具有足够体积,事先将这些样品以表V给出的稀释度稀释在阴性人血清中。
将使用的合成肽以1mg/ml的浓度溶解在水中(贮液)。对于固相敏化步骤(包被),如对实施例2所描述的进行该过程。
将血清样品用脱脂奶粉溶液(补充有0.01%苯酚红,0.25%氨仿和0.25%Kathon的柠檬酸缓冲液中)以1/5进行稀释,沉积在平板的各孔中并在40℃下保温30分钟。
在用包含0.1%Tween20和0.001%硫柳汞钠的Tris-NaCl缓冲液溶液(pH7.4)洗涤后,将100μl辣根过氧化物酶标记的抗人IgG和IgM山羊抗体偶联物的包含0.01%硫柳汞钠作为保存剂的柠檬酸缓冲液溶液加入至各孔中,接着在40℃下将平板保温30分钟,其中该柠檬酸缓冲液中补充有30%甘油和25%正常胎牛血清。
在用包含0.1%Tween20和0.001%硫柳汞钠的Tris-NaCl缓冲液溶液(pH7.4)洗涤后,如实施例2所描述进行显色。
各孔中读取的相对吸光度(OD)(A490-A620)与各肽的免疫反应性成正比。它表明各肽与进行试验的生物样品反应的能力。
将环化形式的本发明的肽:肽No.10(14B)、N0.11(18B)、No.12(19B)、No.14(21B)、NO.15(22B)、No.16(23B)的反应性与具有O组HIV-1逆转录病毒的被膜(env)天然序列一部分序列的三种同源合成序列比较。这些肽为来自VAU分离物的两种肽-肽VAU22AA和肽VAU35AA-和肽MVP5180(在表V中称为“MVP5180”)。肽VAU22AA和VAU35AA(其结构示于实施例2中)和肽MVP5180包含gp41的免疫显性表位。
所有这些肽以环化形式使用。MVP5180肽的序列如下:MVP 5180Arg Leu Gln Ala Leu Glu Thr Leu Ile Gln Asn Gln Gln Arg Leu Asn Leu Trp Gly Cys 1 5 10 15 20Lys Gly Lys Leu Ile Cys Tyr Thr Ser Val Lys Trp Asn Thr Ser
25 30 35
研究结果示于表V中。
表V
对于各种试验的肽,根据在波长A492-A620处读取的各种相对吸光度水平将样品分成4类(a,b,c,d):
·-a:OD<0.100,
·-b:0.100<OD<0.500,
·-c:0.500<OD<1.000,
·-d:OD>1.000,
这样就可评价肽的免疫反应性的程度。免疫反应性最大的肽为在对应于最高吸光度值的类型中发现的最高样品数的那些。
结果示于表VI中。
表VI
结果表明试验的本发明所有肽比来自天然分离物(MVP5180,VAU)的现有技术的参考肽在免疫反应性上具有更好的性能。本发明的肽No.15(22B)、No.14(21B)和No.16(23B)显示为免疫反应性最大的。实施例4通过免疫酶试验对包含多个本发明肽的组合的免疫反应性的评价
对于本试验,根据实施例2描述的方法进行操作,使用相同的血清。用环化的肽No.1(2B)、环化的肽No.3(4B)或包含这两种肽(1∶1w/w)的组合物敏化所用的微量平板。向各孔沉积100μl包含2μg/ml肽No.1(2B)的溶液,或100μl包含肽No.3(4B)的溶液,或包含1μg/ml肽No.1(2B)和1μg/ml肽No.3(4B)的溶液。
本试验结果示于表VII。
表VII
*>表示信号大于分光光度计的读程。
表VII(续)
*>表示信号大于分光光度计的读程。
表VII的结果表明当用于诊断时,本发明的肽组合使得能检测所有来自O组HIV-1逆转录病毒感染病人的血清。
序列表(1)一般信息:
(i)申请人:
(A)姓名:Pasteur Sanofi Diagnostics
(B)街道:3 boulevard Raymond Poincare
(C)城市:Marnes la Coquette
(E)国家:法国
(F)邮编(ZIP):92430
(G)电话:0153774000
(H)电传:0153774133
(ii)发明名称:可用于检测O组HIV-1病毒感染的生物试验的合成肽
(iii)序列数目:16
(iv)计算机可读形式:
(A)介质类型:软盘
(B)计算机:IBM PC兼容
(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS
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机译: 用于生物试验的合成肽,用于检测HIV病毒感染1组0
机译: 适用于检测0组HIV-1病毒感染的生物测试中使用的合成肽
机译: 合成肽可用于检测O型HIV-1病毒感染的生物学检测