使用钒溴过氧化物酶作为产生信号之酶测定特异性结合配体的分析元件和方法

摘要

可用于以竞争式检测或夹层式检测方式,灵敏而快速检测很广范围内各种各样的特异性结合配体的分析元件。该检测使用钒溴过氧化物酶标记的免疫反应剂,和产生化学发光信号的洗涤组合物,所述组合物含有2,3－二氢－2,3－二氮杂萘－1,4－二酮衍生物;卤素、假卤素、提供卤素的原料或提供假卤素的原料;并含过氧化物或产生过氧化物的试剂组合物。

说明书

发明领域

本发明涉及分析元件和分析方法，所述元件和方法用于检测液体样品中的特异性结合配体。更具体地说，本发明涉及使用钒溴过氧化物酶作为该分析元件中产生信号之酶。

发明背景

在医学实践和研究中，以及在分析和诊断过程中，不断需要快速而准确地测定存在于各种液体(例如生物学体液)内的化学和生物学物质。例如，为有效地研究、诊断和治疗，必需快速而准确地测定蛋白、激素、药物、病毒、微生物、麻醉物、及类固醇等的存在。

最近几十年来，已开发出很多不同分析方法来检测上述物质。这些方法已很可靠，且在某情况下适宜于自动化，以及适宜于以配套形式使用。这些方法大部分依赖于本技术领域所谓的“特异性结合反应”，即欲检测之物质(本文中称之为“特异性结合配体”或“配体”)和对该配体能特异性识别并与之反应的相应受体之间的“特异性结合反应”。大部分已知特异性结合反应是免疫反应物之间(免疫测试中)的反应，例如抗体与抗原，或抗体与半抗原，但其它的，例如抗生物素蛋白与生物素也是已知的。

总的来说，免疫测试可以提供是否存在(或存在多少)特异性抗原、抗体、或抗原-抗体复合物的定性和/或定量测定。一种称之为“竞争结合免疫测试”的免疫测试形式中，将欲测定的配体经标记的类似物，置于与固定量适当抗体的竞争之中(所述抗体与配体和配体类似物均能反应)。该类似物上的标记，可以其游离形式或配合物形式(即反应过了)被恰当地检测出，这样该检测结果将告知使用者被检样品中有多少配体。在另一种被称之为“夹层式”免疫测试或免疫度量测试的免疫测试方式中，配体与两个或多个受体分子接触，这些受体在不同表位与该配体结合。一个受体被适当标记，而其余的或者是被固定于固体基质上的，或者是易于固定于其上的。配体之量与配体和两受体中所结合的配合物量成正比。

免疫测试传统上在溶液中进行，或在试验装置中进行，所述装置中的液体以某种方式从参与测试的试剂中除去。虽然溶液技术在该领域中被广泛接受，但它们一般需要使用带来复杂溶液处理和运输能力问题的分析装置，即此种检测所用的分析装置要涉及复杂的液体处理，为避免样品之间的污染，操作和精心清洗时均需要熟练技术人员。

代替溶液化学的是采用干性分析元件。应明确，不是所有含水溶液均可采用干性分析元件，因为要使用使所述元件保持结构完整必要的涂料、粘结剂及其它试剂，由此造成某些影响。另外，学科的多样性通常要求良好的元件构成。而且干性分析元件必需使用隔间分隔不相容成分，这不像溶液化学一样，后者液体贮液是分离开的，可采用连续液体加入方式。

很多文献中已介绍过干性分析元件，及其在免疫测试中的应用，包括Pierce等人的美国专利No.4,258,001，Frickey等人的美国专利No.4,670,381，WO 82/2601(1982年8月5日公开)、欧洲专利申请No.051,183(1982年5月12日公开)和欧洲专利申请No.066,648(1982年12月15日公开)。

改进的干性分析元件及其在免疫测试中的应用，在未决的共同转让美国申请流水号938,460(1992年8月31日递交，Belly等人)中有所介绍，其中采用酶标记来检测。该Belly等人的申请中公开优选辣根过氧化物酶作为酶标记。使用特定清洗技术将已结合(或配合)的免疫反应剂与未结合的反应剂分开，此种元件可以用来测定浓度很低的分析物。

使用以过氧化物酶作为标记的干性分析元件进行免疫测试时，该过氧化物酶的稳定性是非常重要的，因为其浓度的任何变化将严重影响测试灵敏度。Friedman等人的美国专利No.5,372,932所述测试中，使用4′-羟基或4′-烷氧基芳基乙酰胺作为干性分析元件中增进酶或酶标记稳定性的试剂。虽然这些试剂有改善稳定性的效果，但发现该过氧化物酶标记的稳定性仍然小于干性分析元件中所期望的程度。

目前，Butler和Walker介绍过从水生藻和海藻中提取的，以及来自陆生苔藓及真菌的钒溴过氧化物酶(VBrPO)族，在有过氧化氢和溴阴离子存在时能催化产生活性溴，所述活性溴是强氧化剂(见Butler等人Chem.Revs.，93，pp.1937-1944，1993，引入本文中作为参考)。

而问题之一是大多数卤素过氧化物酶其最佳pH值范围较低，即3-5。这对于依赖于过氧化阴离子的现有技术分析元件来说是个难题，过氧化物的pKa一般为约11.5。而钒溴过氧化物酶在pH值为约6-10时工作仍有效。

虽然公开于现有技术中的分析元件和方法显示出测试灵敏度及稳定性均提高了，但该领域仍需要进一步改进。例如，需要提供较简单的分析元件。该元件不要求如Friedman等人在美国专利No.5,372,932中所述的稳定试剂。同时，仍需要提供比已知现有技术系统有改善的酶稳定性和更高灵敏度的元件。

发明概述

有关现有干性分析元件及免疫测试法所存在的上述问题，由本发明采用新的分析元件而加以克服，所述元件在其至少一个区带含有钒溴过氧化物酶标记的免疫反应剂。

更具体地说，本发明涉及用于测定特异性结合配体的分析元件，该元件包含：

(i)一种多孔的展开区带，

(ii)一个或多个附加区带，它与所述多孔展开区带处于流体相接触状态，以及

(iii)任意含一种吸收性材料，与上述区带处于流体接触状态。

其中所述元件的至少一个区带含有钒溴过氧化物酶标记的免疫反应剂，该免疫反应剂能特异性地与所研究的特异性结合配体或其受体反应。

本发明也提供使用上述免疫测试分析元件测定特异性结合配体的方法，包括：

(A)将假定含有所述特异性结合配体的液体样品与所述分析元件接触，

(B)将所述分析元件与一种洗涤组合物接触，所述组合物包含：

(a)产生化学发光信号的试剂，该试剂提供应答钒溴过氧

化物酶的催化活性之信号，所述产生信号试剂是2，3-二氢-2，3-二氮杂萘-1，4-二酮衍生物；

(b)卤素、假卤素、产生卤素的原料或产生假卤素的原料；和

(c)过氧化物或产生过氧化物的试剂组合物；

(C)检测未反应的，或已反应的钒溴过氧化物酶标记的免疫反应剂，作为研究的所述特异性结合配体的度量。

本发明提供一种用于干性分析元件的高灵敏度和稳定的组合物。本发明的元件可广泛用于各种特异性结合配体的测定，但对测定低浓度配体特别有用。通过加入钒溴过氧化物酶标记的免疫反应剂到该元件中，达到酶稳定及增强检测之优点。

附图简要说明

图1是使用本发明含产生信号的钒溴过氧化物酶作为其一种组分的元件所获得的化学发光信号，和如Friedman等人的美国专利No.5,372,931实施例1所述，含辣根过氧化物酶(HRP)作为产生信号之酶，并含3′-氯-4′-羟基-N-乙酰苯胺在洗涤组合物中作为增强剂的对照元件所产生的信号之图解。

图2是使用本发明含产生信号的钒溴过氧化物酶作为其一种组分的元件所获得的信噪应答，和如Friedman等人的美国专利No.5,372,931实施例1所述，含辣根过氧化物酶(HRP)作为产生信号之酶，并含3′-氯-4′-羟基-N-乙酰苯胺在洗涤组合物中作为增强剂的对照元件所获得的信噪应答之图解。

图3是使用本发明含产生信号的钒溴过氧化物酶的元件进行印迹酶测试的稳定性，和含辣根过氧化物酶作为产生信号之酶的对照元件所得结果的图解。

图4(a)和4(b)表示使用本发明产生信号的含钒溴过氧化物酶的元件，在室温下贮存不同时间后，其保留的化学发光信号百分比，和含辣根过氧化物酶作为产生信号之酶的对照元件所得该百分比的柱状图。

发明详细说明

本发明的方法是一种特异性结合测试法，例如免疫测试，它可以是竞争式结合，或者作为本领域熟知项目的免疫度量。要测定的所研究的分析物是特异性结合配体、标记配体、标记配体类似物或其受体。本发明对于测定各种含水液体中的低浓度配体很有利，例如测定人和动物的生物学体液、食物、城市污水，以及以这种方式普通试验的其它液体。可以试验的生物学体液包括(但不限于)全血、血清、血浆、尿、脊髓液、泪水、滑膜液、淋巴液、组织或蚀斑悬浮液、龈液、阴道液、颅液，以及本领域技术人员熟知的其它液体。

可以测定的配体包括(但不限于)肽、多肽、蛋白(例如酶、抗体、脂蛋白和糖蛋白)、药物、麻醉物、甾类化合物、毒素和糖类(例如多糖)。具体研究的特异性结合配体包括异羟基毛地黄毒苷、二苯乙内酰脲、苯巴比妥、茶碱、C-反应性蛋白、人绒毛膜促性腺激素、刺激甲状腺激素、甲状腺原氨酸衍生物(例如甲状腺素和三碘甲状腺原氨酸)、肌酸激酶-MB、氨甲酰氮、庆大霉素、妥布霉素或万古霉素。本发明在测定异羟基毛地黄毒苷、二苯乙内酰胺、苯巴比妥和C-反应性蛋白方面最为有效。

本发明使用一种含多孔展开区带的分析元件进行，通常有带适当孔度(以容纳试验样品)，比如1-50μl的涂层，在稀释或未加稀释条件下进行。本发明元件可用本领域已知技术装配。优选多孔展开区带是各向同性孔，其性质由该区带的颗粒、纤维或其它物理成分中相互连接空间所提供。所述多向同性孔意味着液体可均匀地通过该区带展开。此种区带所用材料是不溶于水的，在测试期间能保持其结构完整。常用材料及装配该元件的方法在下述文献中有所介绍，例如Przybylowicz等人的美国专利No.3,993,158，Pierce等人的美国专利No.4,258,001，Kitazima等人的美国专利No.4,292,272和koyama等人的美国专利No.4,430,436，这些内容均列入本文作为参考。优选的多孔展开区带由有机高聚物颗粒及高聚物粘胶制备成凝固的三维结构，如Pierce等人的美国专利No.4,258,001所述。

该元件中有一个或多个附加区带，所有的均与多孔展开区带处于流体相接触状态。应明确所谓“流体相接触”是指流体可以很容易地由一个区带移到另一区带。所述附加区带(优选涂有高聚物涂层)包括胶层、试剂、和射线阻隔区带，并包含一种或多种本领域已知的亲水粘合材料，例如明胶、丙酰胺高聚物及乙烯吡咯烷酮高聚物。有些可以是不溶于水的，而另一些可能是水溶性的。

本发明元件的区带可以是自载的，但优选配置在适当尺寸稳定的化学惰性载体上。优选所述载体是无孔并能透过电磁辐射的。所选择的载体应当与欲采用的检测模式相容(例如透射或反射分光仪)。有用的载体包括(但不限于)纸、金属薄膜、聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯及纤维素酯。

该元件还可任意包含一种吸收材料，该材料与本发明元件之区带处于流体相接触状态。本发明所用吸收材料对所述元件提供全部附加液体容量，为本发明方法所用洗涤液体提供容器。适宜的吸收材料包括(但不限于)玻璃微纤维、纸、海绵、织物、塑料等，只要该材料能吸收液体即可。

一个优选方案中，吸收材料的环状断面置于展开区带之上，使展开区带接近样品并洗涤。

本发明元件至少一个区带是钒溴过氧化物酶标记的免疫反应剂，它能够与所研究的特异性结合配体或其受体特异性反应。在竞争结合免疫测试中，该标记的免疫反应剂通常是特异性结合配体的标记类似物。在夹层测试中，该标记的免疫反应剂，可以是配体的标记受体，或者是与受体特异性结合的标记分子(例如标记的抗-抗体)。

使用许多已知方法之任一种均可制备此种标记的免疫反应剂，包括由Yoshitake等人在“欧洲生化杂志”(Eur.J.Biochem)101，395(1979)，和Kondo等人在美国专利No.5,106,732中所介绍的。

如本文所述所谓“钒溴过氧化物酶”意指能催化物质(如鲁米诺)的氧化反应，产生适当化学发光信号的任何钒溴过氧化物质(酶催化物或其它的)。本发明可用的蛋白质钒溴过氧化物酶源，在Butler等人，于“化学综述”(Chem.Revs.)，93，pp，1937-1944(1993)的文章中能找到，包括(但不限于)从泡叶藻、仙菜、糖海带、墨角对叶藻(Fucus distichus)、小珊瑚藻、珊瑚藻、巨藻等。分离钒溴过氧化物酶的方法，可在前述Butler等人的文献中找到。这些蛋白质钒溴过氧化物酶源中泡叶藻是特别优选的。

如本文上面所述，通过将钒溴过氧化物酶加入干性分析元件中，使本发明的元件表现出意想不到的酶稳定性，并且无需加入增强剂而提高检测能力，例如Friedman等人的美国专利No.5,372,931所介绍的。

由于反应中所用其它成分之量，及试验样品中预计的分析物之量不同，所以钒溴过氧化物酶标记的免疫反应剂之量可以在很宽范围内变动。元件中存在量一般为至少约0.01μg/m²，其优选范围是约0.1至约100μg/m²。

本发明的元件还可以含有能与所研究的特异性结合配体，或与其受体发生特异性反应的未标记免疫反应剂。在竞争式结合免疫测试中，所述免疫反应剂一般是该配体之受体(例如抗体)。在夹层式免疫测试中，所述未标记免疫反应剂可以是该配体之受体，或者是该受体的结合分子。优选方案中，该免疫反应剂是对该配体特异性的抗体。

如果存在的话，所述未标记的免疫反应剂，除了一般不处于钒溴过氧化物酶标记的免疫反应剂同一区带之外，可以位于该元件的任何区带。因此，元件该两成分以某种方式维持分离状态，直至测试开始。所述两成分通过处于元件的不同区带而相分离，或者它们可以位于同一区带，但其一种以某种材料包裹，当检测开始时再释放出来。优选所述免疫反应剂维持在不同的区带或层中。

也优选未标记的免疫反应剂被固定于适当颗粒上，所述颗粒分散于元件整个区带。此种颗粒可以由任何适宜材料组成，包括(但不限于)玻璃、氧化铁、陶瓷、有机合成或天然高聚物，其平均粒度为约0.01至约10μm。优选该颗粒从合成高聚物制备，有适当的表面基团能吸附免疫反应剂分子，或与之共价连接。这些材料各种不同类别是本领域已知的，如下述文献所述：U.S.Patent No.4,828,978 to Warren etal.，U.S.Patent No.4,997,772 to Sutton et al.，U.S.Patent No.5,147,777 to Sutton et al.或U.S.Patent No.5,177,023 toSutton et al。以及它们所列参考文献。

特别有用的高聚物颗粒是由烯烃不饱和可聚合单体制备的，所述单体还带有活性羧基、2-取代的乙基磺酰基或乙烯磺酰基，具体如本文前述Sutton等人专利所介绍的。

本发明优选方案中，提供测定特异性结合配体的多层分析元件。特别是含有无孔载体的多层元件，该载体上有下述处于流体接触状态的各层：

第一试剂或缓冲层，

含有能与所研究的特异性结合配体，或其受体反应的未标记免疫反应剂的胶层，

含有均匀分布的钒溴过氧化物酶标记的免疫反应剂的多孔展开层，所述免疫反应剂能与所研究的特异性结合配体或其受体反应。

本发明的多层元件还任意含有与前述各区带之一处于流体接触状态的吸收材料。

更优选的实施方案中，使用某些制造技术，例如(但不只限这些)喷墨沉积、喷涂沉积和印刷沉积等本领域公知的技术，使钒溴过氧化物酶标记的免疫反应剂位于多孔展开层顶部。

正如本领域已知的，本发明的元件可以在适当区带包括各种添加剂，有助于加工制造、流体扩展、吸收不需要的射线，以及受体稳定性等。

本发明的元件可以使用常规涂覆技术和设备来制造，正如现有技术所介绍的(包括印刷术、屏蔽术、漏斗注入及其它涂覆技术)。本发明元件可构成各式各样的构型，包括任意宽度的细长带子、薄片、载片或碎片。本发明的方法可使用适当分析仪器及方法手动或自动进行。一般是通过将试验样品(例如1-50μl)印迹于多孔展开区带上，本发明方法包括在该元件中试剂相互接触。元件中液体的运动，使试剂有效混合，从而发生反应。

施样以后，使该元件处于某些条件下，例如保温、加热或其它可望在该元件的各区带中快速(或有助于)形成适当特异性结合的配位体之条件。虽然在某些情况下，不需将钒溴过氧化物酶标记的免疫反应剂的反应型和未反应型分离开，便可获得适宜的信号，但优选将该元件区带中的所述两种形式分开，正如一般在称之为异源免疫检测法中所作的一样。这样在该区带的规定区域内可以较好地读出信号。

对该元件施用洗涤溶液(约5至200μl)是有效完成所述分离的优选方法。可用本领域任何适宜之方式施用所述洗涤溶液，但优选以连续计量速度施用，例如最高达10μl/秒，最优选约1μl/秒。不过洗涤溶液的任何施加速度和方式均可使用，只要施用期间多孔展开区带容易吸收液体即可，所述液体是该元件中使用前述吸收材料容易提供的。

所述洗涤溶液可以包括按顺序施用的多种液体组合物，但至少其中一种液体必需含本文下述产生信号的组合物，此外还可加入表面活性剂于任何洗涤溶液中。

本发明方法中所采用的洗涤溶液，是pH值约6.5至约10的能提供化学发光信号的分析组合物，所述组合物包含：

(a)一种产生化学发光信号的试剂，该试剂产生应答钒溴过氧化物酶的催化活性之信号，其中所述产生信号试剂是2，3-二氢-2，3二氮杂萘-1，4-二酮衍生物；

(b)一种卤素、假卤素、产生卤素的原料或产生假卤素的原料；以及

(c)一种过氧化物或产生过氧化物的试剂组合物。

正如上述，本发明所用的产生信号的组合物包含2，3-二氢-2，3-二氮杂萘-1，4-二酮衍生物(本文中称为“DPD”)作为其组分之一。任何在化学发光反应中可转化为激发态，而其后回复到非激发态，同时发出光的游离DPD或共轭DPD均可用于本发明之实践，很多这类化合物是本领域公知的，包括Kricka等人的美国专利No.4,598,044，和Grundermann等人的Chemiluminescence in Organic Chemistry(Springer-Verlag，Berlin，1987，第204-207页)一书中所介绍的那些化合物。

此类化合物总的称之为“鲁米诺型酰肼”，包括苯二甲酰肼、苯1，2-二甲酰肼、蒽-2，3-二甲酰肼、菲-1，2-二甲酰肼、芴-1，2-二甲酰肼、苯并〔g，h，i〕苝-1，2  二甲酰肼、蔻-1，2-二甲酰肼，以及其它对本领域专业人员来说显而易见的该类化合物。

具体来说，可以用于本发明的DPD类化合物由下面结构式定义：其中Z¹、Z²、Z³和Z⁴各自为氢；含约1至约6个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、异丙基、叔丁基、仲戊基和己基；含约2至约6个碳原子的链烯基，例如乙烯基、1-丙烯基、异丁烯基、2-(N，N-二并丙氨基)乙烯基、2-(N，N-二异丁氨基)乙烯基、2-(N，N二异戊氨基)乙烯基和2-己烯基；羟基；含约1至约6个碳原子的烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、异丙氧基、叔丁氧基和己氧基；羧基；氨基，包括烷基或烷酰基取代的氨基，例如甲氨基、乙氨基；酰氨基(例如乙酰氨基和己酰氨基)；二甲氨基、二乙氨基和二异丁氨基；共轭氨烯基(例如下面定义的)；或氨芳基，包括取代氨芳基，例如对-(N，N-二甲氨基)苯基、对-(N，N-二乙氨基)苯基，和5-氨基-2，3-二氢-2，3-二氮杂萘-1，4-二酮-8-基(称之为鲁米基，即luminyl)。

Z¹和Z²至少一个是氨基(包括取代氨基，如上面所定义的)、共轭氨基链烯基(包括如上定义的氨基链烯基)，或氨芳基，例如对-(N，N-二甲氨基)-苯基，对-(N，N-二乙氨基)苯基和5-氨基-2，3-二氢-2，3-二氮杂萘-1，4-二酮-8-基。本文中所谓“共轭氨基链烯基”，指能够从氨基通过链烯基与其取代的2，3-二氮杂萘二酮芳环产生电子共振的单价基团，例如包括2-(N，N-二异丙氨基)乙烯基、2-(N，N-二异丁氨基)乙烯基和2-(N，N-二异戊氨基)乙烯基之类的二烷氨基乙烯基，以及4-(N，N-二乙氨基)-1，3-丁二烯-1-基之类的二烷氨基丁二烯基。

此外，Z¹、Z²、Z³和Z⁴的任何相邻两个、三个或所有的(即二个或三个，甚至四个全部结合)可结合在一起形成含一个或多个芳环的稠合环系。该稠环可以由一个或多个羟基、氨基(如上所述取代或未取代的)，或具约1-约4个碳原子的烷氧基(例如甲氧基、乙氧基或异丙氧基)取代。优选由一个或多个伯胺、仲胺或叔胺、羟基或上面所述烷氧基取代的此种稠环。

代表性的有用DPD化合物包括(但不限于)鲁米诺、异鲁米诺、N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺半琥珀酰亚胺、N-(6-氨己基)-N-乙基异鲁米诺、N-乙基异鲁米诺、和7-二甲氨基萘-1，2-二甲酰肼。鲁米诺(5-氨基-2，3-二氢-2，3-二氮杂萘-1，4-二酮)和异鲁米诺(6-氨基-2，3-二氢-2，3-二氮杂萘-1，4-二酮)是优选的，而最优选鲁米诺。

其它有用的DPD化合物是上面引用的Gundermann等人公开文献中所介绍的，包括取代或未取代的邻苯二甲酰肼、蒽-2，3-二甲酰肼、菲二甲酰肼、芴-1，2-二甲酰肼、苯并〔g，h，i〕苝-1，2-二甲酰肼和蔻-1，2-二甲酰肼，例如下述结构式所表示的化合物

其它本发明使用的，由本领域专业人员确认的其它2，3-二氮杂萘二酮类似物，包括Masuya等人的欧洲专利申请No.91310875.9和Yamaguchi的美国专利No.5,324,835，其内容引入本文作为参考。

上面所认定的化合物可从市场购得，或用本领域技术人员公知的常规原料和方法制得。

本发明中采用的第二种洗涤组合物组分是卤素、假卤素、提供卤素的原料、或提供假卤素的原料。本文中所谓“卤素或提供卤素的原料”，指加入到本发明洗涤组合物中，能提供卤阴离子(即氟、氯、溴或碘阴离子)的任何物质。这包括氯、溴或碘之类卤素。提供卤素的源可以包括金属或非金属卤素盐。非金属盐包括(但不限于)铵盐、烷基铵盐、取代烷基铵盐、芳基铵盐、取代芳基铵盐、盐、氧鎓盐、鎓盐、锍鎓盐等等。提供卤素的原料还可以是包括均聚物或共聚物的高聚物材料，所述均聚或共聚物含有上述卤素作为反离子的阳离子物种的结合。此种物质的例子是NH₄Br。一般来说，提供卤素的原料作为IA族金属盐加入到组合物中。除含IA族金属外其它的金属盐也包括在本文中。本发明极优选的实施方案中，提供卤素的原料是NaBr。

本文中所谓“假卤素或提供假卤素的原料”指加入本发明所用组合物中，能提供与卤素相近的高电子亲和力之阴离子的任何物质。业已报道过提供假卤素的原料一般是(但不限于)IA族金属化合物。假卤素或提供假卤素的原料可以是上面有关提供卤素的原料所介绍的那些金属或非金属化合物，例如铵盐、烷基铵等等，及其高聚物。可以存在于提供分析信号组合物中的适宜假卤素包括(但不限于)CN^-、SCN^-、OCN^-、叠氮化合物、异腈等。假卤素中SCN^-是特别优选的。本发明采用的优选提供假卤素原料是NaSCN。

本发明所采用的洗涤组合物中第三种成分是过氧化物或产生过氧化物的试剂组合物。所谓“过氧化物”包括一般现有技术所采用的无机或有机过氧化物。至于产生过氧化物的试剂组合物，意指加入到本发明所用产生信号组合物中时，能产生过氧化物的任何试剂组合物。此类产生过氧化物的试剂组合物对本领域技术人员来说是已知的，它们包括(但不限于)过硼酸盐、过乙酸盐、过氧化脲、和有机过氧化物，例如过酸、过苯甲酸和过硫酸氢钾制剂，以及氢过氧化物。

采用pKa值约6.0至约8.0的适宜生物学缓冲液将本发明所用洗涤组合物一般缓冲至pH约6.5至约10，更优选约6.8至约8.0。这些缓冲液是本领域已知的。此类缓冲液有代表性的例子包括(但不限于)三(羟甲基)氨基甲烷-HCl(Tris-HCl)；2-〔N-吗啉代〕乙磺酸(MES)；哌嗪-N，N′-二〔2-乙磺酸〕(PIPES)；3-〔N-吗啉代〕-2-羟基丙磺酸(MOPSO)，磷酸盐缓冲液等。上述生物学缓冲液中，特别优选Tris-HCl。

本发明采用的洗涤组合物中，每种成分之量，根据其使用倾向，试剂的具体敏感度，以及本领域技术人员公知的其它因素，而有所不同。因此，下面的一般范围意在为专业人员提供指南，而并不限制本发明的实践。

具体地说，本发明采用的缓冲液之量对本领域专业人员是显而易见的，因为怎样测定为维持所需pH值所必需的缓冲液之量是周知的。

产生信号的化合物DPD之量一般至少约0.01毫摩尔，而约0.1至约10毫摩尔范围为优选。

有关第二组分，即卤素、假卤素、产生卤素的原料或产生假卤素的原料，一般加入量至少约0.1毫摩尔。更优选卤素、假卤素、产生卤素的原料，或产生假卤素的原料在产生信号的组合物中之量是约50至约100毫摩尔。

有关第三种成分，即过氧化物或产生过氧化物的试剂组合物，在洗涤组合物中的量至少为约0.02毫摩尔。更优选过氧化物或产生过氧化物的试剂组合物之量为约0.5毫摩尔到约1.0毫摩尔。

本发明的元件可用于各种检测方式，以提供化学发光信号，应答反应型或未反应型钒溴过氧化物酶标记的免疫反应剂。

下面给出实施例举例说明本发明的范围。因为这些实施例只为说明之目的而给出，而不能以此对本发明加以限制。

除有专门指出的地方外，所有的试剂和装置均从伊斯曼柯达公司或其它商业途径获得。

实施例1含水化学发光组合物及钒溴过氧化物酶溶液的配制

提供化学发光信号的含水组合物配制如下：

配制0.05M Tris-HCl缓冲液中含100μM二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、0.75M NaBr，和1％十六烷基三甲溴化铵(CTAB)的缓冲溶液(pH8.0)。

产生信号的组合物从两份混合物配制。第一份含1mM鲁米诺钠，而第二份含1mM H₂O₂，二者均从上面缓冲液配制。该两份在临使用前合并。

贮存于4℃的钒溴过氧化物酶(获自泡叶藻)贮液，在0.05M Tris-HCl，pH8和0.01％牛血清白蛋白(BSA)中系列稀释，提供已知浓度范围10至50000×10^-18摩尔的钒溴过氧化物酶。

制备含有下列试剂基质组合物的涂层元件：珠粒展开层：                0.1M Tris pH8.0

                        高聚物珠粒(VtE)

                        粘结剂(MaWnaMt)

                        0.5g/m²  TSH  Ab珠粒

                        DTPA     (10^-4M)胶填料：                    明胶

                        0.2M  Tris  pH8.0

                        DTPA     (10^-4M)

                        TX-100

              坚膜剂     (BVSME)载体：            7 mil Estar(聚对苯二甲酸乙二醇

              酯)

上面的试剂基质中所用试剂名称定义如下：

Tris：三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液。

高聚物珠粒：聚(乙烯基甲苯-共-甲基丙烯酸珠粒)。

粘合剂：聚(丙烯酸甲酯-共-2-丙烯酰氨钠-2-甲基-丙磺酸酯-共-甲基丙烯酸2-乙酰乙酰氧乙酯)。

TSH珠粒：共价连接抗甲状腺刺激激素(TSH)抗体的聚(苯乙烯-共-3-(对乙烯基苯甲硫基)丙酸)。

TX-100：即Triton  X-100，一种由Rohm和Haas Co.出售的辛基苯氧基多乙氧基乙醇表面活性剂。

BVSME：二(乙烯基磺酰基)甲基醚

MaWnaMt＝聚(丙烯酸甲酯-共-2-丙烯酰-2-甲基丙磺酸，钠盐-共-甲基丙烯酸乙酰乙酰氧乙酯)(90/4/6)。评估钒溴过氧化物酶在灵敏检测免疫试验涂层上的化学发光信号

上面配制的产生化学发光信号的组合物，和钒溴过氧化物酶缓冲溶液使用如下：

载片形状的元件，由按上面制备的涂层取16mm²切片置于EKTACHEM(商标)C-载片基底上组装而成(如Belly等人美国专利申请流水号938,460所述)。将具有10mm直径中心孔洞(能供施样用)的Whatman GF/B吸收微纤玻璃材料(Whatman SpecialtyProducts Division，Product No.PD 008-12A-100)放于该涂层上。然后将防渗漏环状塑料顶片放于所述吸收层上，将整个装配件用胶带密封上(详见Belly等人的美国申请流水号938,460图1和图2所示)。

然后用100μl上述产生化学发光信号的组合物以1μl/秒的速度冲洗。随着洗涤溶液的施用，5μl产生化学发光信号的组合物中的上述钒溴过氧化物酶的适当稀释液在所述涂层上形成印迹。立即将该元件卸下，用TURNER(商标)TD-20e光度计，于室温下测量涂层的化学发光信号。采用一种适配器修正该光度计使之能适应卸下的16mm²涂层，由此可读出该涂层10mm直径中心部分的数据。

图1表示在上述条件下该测试得出的化学发光输出值(置于修正的光度计之后t＝4分钟时的10秒积分)。更具体地说，图1表示本发明的元件能产生像现有技术元件一样容易检测的绝对信号。

图1中，对照元件含辣根过氧化物酶作为产生信号之酶，而3′-氯-4′-羟基-N-乙酰苯胺在洗涤组合物中作为增强剂，如Friedman等人的美国专利No.5,372,931所述，其中洗涤组合物作如下修改：除了该文中所述成分外，还加有0.05M Tris-HCl，pH 8.0，0.1％十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)，150μM 3′-氯-4′-羟基-N-乙酰苯胺。

图2表示信噪比，一种本领域专业人员熟知的体系灵敏度识别度量。图2中的数据使用本发明元件和含辣根过氧化物酶作为产生信号之酶的对照元件获得。HRP对照物的洗涤组合物包括3′-氯-4′-羟基-N-乙酰苯胺作为增强剂，如Friedman等人的美国专利No.5,372,931所述，其修改如下：除该文中所述成分外，还加有0.05M Tris-HCl，pH 8.0，0.1％十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)，150μM 3′-氯-4′-羟基-N-乙酰苯胺。该图表明本发明元件比对照元件提供了较高灵敏度。

实施例2元件稳定性比较

本例是干性元件中钒溴过氧化物酶的稳定性与干性元件中HRP的稳定性之比较。将下列试剂基质组合物涂复于7mil Estar(聚对苯二甲酸乙二醇酯)载体上制备基础涂层元件：

       层            成分  沉积(g/m²)   多孔展开层  高聚物珠粒-VtE  Latex粘结剂-MaWnaMt  缓冲剂-TES    130    2.583    0.219     胶层    (受体)  共聚物-IMnAg(85/5/10)  缓冲剂-TES  表面活性剂-TX-100    0.50    0.10    0.02  第一反应剂  基质-明胶  缓冲剂-TES  表面活性剂-TX-100  坚膜剂-BVSME    10.0    4.58    0.02    0.150提示：VtE＝聚(乙烯基甲苯-共-甲基丙烯酸)(98/2)

MaWnaMt＝聚(丙烯酸甲酯-共-2-丙烯酰氨-2-甲基丙

         磺酸，钠盐-共-甲基丙烯酸乙酰乙酰氧乙酯)

        (90/4/6)

TES＝N-〔2-羟基-1，1-二(羟甲基)乙基〕牛磺酸

BVSME＝二(乙烯基磺酰基)甲基醚

IMnAg＝聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-2-羟基乙基甲基丙

烯酸酯-共-亚甲基二丙烯酰胺)(85/5/10)。

除了将钒溴过氧化物酶和HRP贮液在10mM磷酸盐缓冲液中(pH7.0)稀释至10^-8M外，本例采用与实施例1相同的用于钒溴过氧化物酶贮液的试剂。

除了吸收材料不包括在载片组装件上外，两元件均采用实施例1所述程序组装。然后使上述钒溴过氧化物酶或上述HRP贮液在元件上形成印迹。

然后将各元件在室温下黑暗中陈化30分钟、2小时、4小时、6小时、24小时和48小时。每一时间间隔后，切割该元件，取出涂层材料，然后在含磷酸盐(pH 7.0)，0.15M  NaCl和0.1％BSA的1ml缓冲液中提取。然后将提取材料离心约2分钟，分离颗粒和固体物质。

在10μl提取上清液中加入适当的产生信号溶液200μl进行酶活性测定。对钒溴过氧化物酶来说，使用本发明产生信号的洗涤组合物，对于HRP来说，使用Friedman等人的美国专利No.5,372,931实施例1所公开的试剂组合物。在37℃使用DYNATECH(商标)ML 3000光度计测定化学发光信号。

这些实验结果在图3中作图表示(对每一时间间隔点在t＝5分钟时1.0秒积分)。图4(a)和(b)是由图3描绘的(a)HRP和(b)钒溴过氧化物酶保留活性的百分比数据作图。具体地说，这些图很清楚地表明，在很长时间内(直至48小时)含钒溴过氧化物酶的元件的稳定性基本保持恒定。相反，清楚地表明含HRP的元件稳定性却急剧降低。

上面给出的实验和实施例举例说明了本发明的精神和范围。这些实施方案和实施例使得其它方案和例子对本领域专业人员说来变得显而易见。这些其它的方案和例子落入本发明范围之内，因此，本发明只能由其所附权利要求书来加以限制。