公开/公告号CN1178472A
专利类型发明专利
公开/公告日1998-04-08
原文格式PDF
申请/专利权人 财团法人阪大微生物病研究会;
申请/专利号CN97190078.7
发明设计人 松田守弘;
申请日1997-03-24
分类号C07K14/33;A61K39/08;C12N15/00;C12N15/31;C12P21/02;
代理机构中国国际贸易促进委员会专利商标事务所;
代理人李瑛
地址 日本大阪府
入库时间 2023-12-17 13:04:52
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-05-11
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):A61K39/08 授权公告日:20051221 终止日期:20150324 申请日:19970324
专利权的终止
2005-12-21
授权
授权
1998-04-08
公开
公开
发明背景
技术领域
本发明涉及破伤风毒素功能性片段抗原和包含该破伤风毒素功能性片段抗原的破伤风疫苗。更具体地说，本发明涉及特异性的破伤风毒素功能性片段抗原，这种抗原作为破伤风疫苗的抗原极其有用，此功能性片段抗原是有利的，不仅因为该功能性片段抗原用作抗原时，和目前的破伤风疫苗(包含作为抗原的整个破伤风毒素类毒素)相比极有效地减少副作用，而且因为它具有实质上和整个破伤风毒素类毒素相同的免疫力。本发明也涉及一种十分安全有效的包含破伤风毒素功能性片段抗原作为活性组分的破伤风疫苗(破伤风类毒素)和一种包含所说破伤风疫苗和至少一种不同于破伤风疫苗之疫苗的组合疫苗，本发明也涉及用于产生所说片段抗原和疫苗的方法。
现有技术
众所周知，破伤风是死亡率极高的传染病，其产生严重的症状，如角弓反张和气促。破伤风杆菌在环境中广泛地传播，一般在土壤和动物的粪便等能发现它们的孢子。因此，所有人都有由于各种类型的创伤而感染破伤风感染的危险，如由于刺伤和压伤等创伤。此外，当一个人感染了破伤风杆菌时，利用抗生素、肌肉松弛剂等常规化疗不能明显地改变死亡率，不管破伤风患者是年长还是年幼。近几年来，在发达国家大多数死于破伤风的病例发生在老年患者中，这些老年患者在他们的儿童时期没有针对破伤风进行接种。
此外，甚至当一个人在婴儿或儿童时期接受了破伤风接种得到了基本的免疫，得到了辅助剂，而在成年时期当他在地震、火灾、交通事故等受到意外的伤害时，剩下免疫力不能足以预防破伤风感染。因此，对于40岁以上的成年人，特别是老年人来说亲自接受辅助剂注射以确保防止破伤风是非常必要的。
在发达国家，随着医院内分娩数量的增加、生存环境和卫生的和改进、提供类毒素和抗毒素的医疗急救措施质量的提高和年青人义务接种使得破伤风患者数量减少到半世纪以前的1/30。此外，破伤风是非流行病疾病，不能从一个人传染到另一个人。因此，预防这种疾病的重要性变得被忽略了。然而，即使是现在，在世界死于破伤风的人估计每年有1,000,000万，包括在发展中国家的大多数新出生的婴儿破伤风患者在内。而且由于滥用毒品的传播，最近通过污染的注射针传染的破伤风患者的数量也在增加。
在这种情况下，认为破伤风主要是通过接种来预防，而不是通过治疗。现在正在积极采取措施来预防破伤风。例如，世界健康状况组织开展的免疫计划中，针对破伤风的接种计划正在成为采取的最重要的任务之一，并且接种计划正在执行。从1963年开始，在各种不同的国家每三年召开一次目的在于根除破伤风疾病的“国际破伤风会议”。
以上表明，破伤风是一种普遍存在的细菌引起的疾病，由于这种细菌的孢子不能从土壤中根除，因此“破伤风接种是把人类(无论年龄和性别)由于破伤风致死减少到零的唯一方法”，这种说法是不夸张的。接种对于地球上出生的所有人来说，不仅是在现在而且在将来也是非常重要的。
为了预防破伤风，已经把破伤风类毒素用作疫苗。用作为破伤风疫苗的活性成分的破伤风类毒素，是利用福尔马林来解毒的。这样的破伤风类毒素是以没有佐剂的简易形式或者以沉淀的抗原制备吸附在少量铝盐上作为佐剂的形式或者把破伤风类毒素与其它疫苗(如白喉类毒素、百日咳疫苗和流感嗜血菌B疫苗等)相混合来制备的组合抗原制剂形式施用。对于婴儿来说，一般以所说的DPT组合疫苗形式施用。DPT是白喉疫苗(D)、破伤风(T)和百日咳(P)以吸附的形式存在的混合物。为了对受创伤的患者进行预防破伤风的处理，使用简易的T类毒素疫苗或者DT组合类毒素疫苗。这些类毒素广泛地应用于世界各地，并且T类毒素制剂在世界得到了高度评价，被认为是最有效的和重要的疫苗之一。然而，当前的破伤风类毒素制剂也存在各种需要解决的问题。例如，破伤风类毒素有各种不利的副作用；不同的厂商的产品的质量不同；对免疫性的保持只限于5至10年，因此需要再次接种以保持抗原水平以预防破伤风感染。因此常规破伤风类毒素有很多需要解决的问题，如在关于安全性、质量的控制、免疫性的保持、在施用中容易使用减少劳动量和在经济上节约等方面。
下文讨论了现有技术与本发明的主要目的，本发明的主要目的是提供破伤风毒素抗原，此抗原不仅在用作疫苗时对减少不利的副作用有极好的表现，而且表现出高的免疫力，这样解决了伴随现有技术存在的上述问题。
人们知道在使用常规破伤风类毒素疫苗时伴随各种不利的副作用。各种不利的副作用如在注射位点的区域反应(如红斑、变软、肿胀、水肿和无菌脓肿)、全身发热、变态反应(极少见，如局部过敏、过敏性休克、血清病III型过度敏感和迟发过敏)和严重的普遍反应(如外围的神经病、淋巴结病、臂丛神经病、Guillain Barret综合病症和急性横向脊髓炎)已经有过报道。(参见“疫苗”，第二版，S.A.Plotkin和E.A.Mortimer编辑，pp.75-77，W.B.Saunders公司，1994；“Mandel1、Douglas和Bennett的传染病的原则和实践”，第4版，G.L.Mandel等编辑，P.2781，Churchill Livingstone Son.公司，1995；美国医学联合会杂志264(18)，P.2448，1990和271(20)，P.1629，1994；Lancet，339，pp.1111-1112，1992年5月2日)。
曾经努力试图减少或消除这些破伤风类毒素疫苗的不利的副作用。例如，提出了产生获得高度纯化类毒素的方法、利用修饰或新的佐剂和单独使用A、B、C片段(为破伤风毒素的亚单元，以下有所解释)作为活性组分等方法。在这些尝试中，有关利用破伤风毒素片段的技术，作为这些技术所利用的破伤风毒素片段的例子如下，通过以胰蛋白酶和/或者木瓜蛋白酶消化破伤风毒素制备片段C(参见检验日本专利申请公开的说明书50-71820，51-72819和52-83928)；以木瓜蛋白酶消化破伤风毒素制备片段A-B(参见未审查日本专利申请公开说明书53-26319)；通过在大肠杆菌、酵母或沙门氏菌中表达编码片段C的基因得到抗原(参见未审查日本专利申请公开说明书3-285681，日本专利申请审查前出版物(Kokyo)4-506005，国际申请出版物WO 90/15871、WO 94/03615和EP-A-O 209 281)和片段C合成的表位(参见国际申请出版物WO 94/00484)。然而，这些疫苗的常规破伤风毒素片段没有一种能在实践中应用，因为和包含那些的整个破伤风毒素分子的类毒素的常规破伤风类毒素相比，所有这些疫苗的破伤风毒素片段有较低的抗原性和免疫力。并且进行了破伤风毒素基因的克隆及两种核苷酸序列和破伤风毒素分子氨基酸序列的测定[参见EMBO杂志，5(10)，2495-2501，1986；核酸研究，14(19)，7809-7812，1986(整个破伤风毒素分子的全部氨基酸序列显示在SEQ.ID.NO.1中)]。进而，基于以上的整个核苷酸序列与氨基酸序列的信息，表达出破伤风毒素基因的片段，产生的合成肽作为破伤风毒素分子的一部分，此外，利用基因DNA片段和合成肽的表达产物，试图测定了破伤风毒素的表位区[参见感染和免疫，57(11)，3498-3505，1989；分子免疫学，31(15)，1141-1148，1994]。然而，还没有得到包含这样的破伤风毒素表位的活性组分的破伤风疫苗。
发明概述
本发明发明人曾长期研究破伤风毒素，从70年代初至今已有20多年了，在当时还不能把破伤风毒素纯化到一种高的水平，也不知道破伤风毒素分子的详细结构和性质。并且本发明发明人广泛地研究了破伤风杆菌产生毒素的能力。他曾进一步广泛和详细地研究以研制出能特别有效地减少常规破伤风疫苗(包含作为抗原的整个破伤风毒素类毒素)具有的不利副作用而且具有和整个破伤风毒素类毒素实质上相同的免疫力的破伤风疫苗抗原。结果，他发现从破伤风毒素衍生的特异性功能性片段抗原(在下文称为“FFA”)可以有效地作为破伤风疫苗，并且能特别有效地减少不利的副作用。基于新的研究结果，完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供特别有效地减少常规的整个破伤风毒素类毒素的不利副作用但也具有和整个破伤风毒素类毒素实质上相同的免疫力的破伤风抗原。
本发明的另一个目的是提供能特别有效地减少当前的疫苗的不利副作用但也具有和常规的整个破伤风类毒素疫苗实质上相同的免疫力的破伤风疫苗，
本发明的另一个目的是提供用于产生上述破伤风疫苗的方法。
本发明还一个目的是提供用于产生作为破伤风疫苗抗原的上述的功能性片段抗原(FFA)的方法。
通过以下的详尽描述和附加的权利要求书和伴随序列表和附图，本发明的上述目的和其它目的、特征以及优点对本领域技术人员是显而易见的。
序列表简要描述
SEQ.ID.NO.1是用于本发明的整个破伤风毒素分子的完整氨基酸序列的一种形式。
附图简要描述
在伴随的附图中：
图1(a)是用于本发明的整个破伤风毒素分子结构的图解图；
图2(b)是整个破伤风毒素分子带切口(nicked)的形式的图解图；
图1(C)显示了整个破伤风毒素分子的三重[A-B·C]模型；
图2(a)是各种破伤风毒素功能性片段抗原的N-末端氨基酸的序列图解图；和
图2(b)是整个破伤风毒素分子的结构模型的图解图。
参考字符的描述
S--S：二硫键
*：切口
-----：非共价键
在代表氨基酸序列的氨基酸残基的单字母的代表体系中，字母分别代表了下列氨基酸残基
A丙氨酸 C半胱氨酸 D天冬氨酸
E谷氨酸 F苯丙氨酸 G甘氨酸
H组氨酸 I异亮氨酸 K赖氨酸
L亮氨酸 M甲硫氨酸 N天冬酰胺
P脯氨酸 Q谷氨酰胺 R精氨酸
S丝氨酸 T苏氨酸 V缬氨酸
W色氨酸 Y酪氨酸。
本发明的详细描述
按照本发明，提供了一种破伤风毒素功能性片段抗原，这种抗原包含至少一种和由以下方法得到的片段实质上相同的片段，所述方法包括如下步骤：断裂至少一个选自在部分氨基酸序列中个别连接相互邻近氨基酸残基之肽键的肽键，其位于参与形成存在于整个破伤风毒素分子全部氨基酸序列N-末端的二硫键的两个半胱氨酸残基之间；断裂二硫键；和断裂破伤风毒素分子基团间的非共价键[如图2(b)所示]；
所说破伤风毒素功能性片段抗原具有：
(a)经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测量的90,000至110,000的分子量；
(b)经等电聚焦法测量的7.25±0.5的等电点；和
(c)与整个破伤风毒素类毒素实质上相同的免疫力。
为了更容易地理解本发明，本发明主要的特征和各种优选的实施方案列举如下。
1.一种破伤风毒素功能性片段抗原(FFA)，该抗原包含至少一种和由以下方法得到的片段实质上相同的片段，所述方法包括如下步骤：断裂至少一个选自在部分氨基酸序列中个别连接相互邻近氨基酸残基之肽键的肽键，其位于参与形成存在于整个破伤风毒素分子全部氨基酸序列N-末端的二硫键的两个半胱氨酸残基之间；断裂二硫键；和断裂破伤风毒素分子基团间的非共价键，
其中所说的破伤风毒素功能性片段抗原具有：
(a)经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测量的90,000至110,000的分子量；
(b)经等电聚焦法测量的7.25±0.5的等电点；和
(c)与整个破伤风毒素类毒素分子实质上相同的免疫力。
2.按照以上第1项的破伤风毒素功能性片段抗原，其中每一个所说的至少一种片段分别具有选自由下列氨基酸序列(1)至(8)组成的组的N-末端氨基酸序列：
(1)KIIPPTNNIRENLYNRTASLTDLGGELCIK，
(2) IIPPTNNIRENLYNRTASLTDLGGELCIK，
(3) ENLYNRTASLTDLGGELCIK，
(4) NLYNRTASLTDLGGELCIK，
(5) NRTASLTDLGGELCIK，
(6) TASLTDLGGELCIK，
(7) SLTDLGGELCIK，和
(8) GGELCIK。
3.按照以上第1或者2项的破伤风毒素功能性片段抗原，该抗原由一种固定液(fixative)稳定化。
4.一种破伤风疫苗，该疫苗包含作为活性成分的以上第1至3项的有效致免疫量的破伤风毒素功能性片段抗原。
5.一种组合疫苗，该疫苗包含作为多种活性成分之一的以上第1至3项的有效致免疫量的破伤风毒素功能性片段抗原。
6.一种用于产生破伤风疫苗的方法，该方法包括用固定液稳定化破伤风毒素功能性片段抗原，
所说的破伤风毒素功能性片段抗原包含至少一种和由以下方法得到的片段实质上相同片段，所述方法包括如下步骤：从破伤风杆菌(Clostridumtetani)培养过滤物中收集和纯化细胞外破伤风毒素以获得细胞外破伤风毒素分子；断裂存在于所说的细胞外破伤风毒素分子的整个氨基酸序列N-末端的二硫键；和断裂细胞外破伤风毒素分子基团间的非共价键；
所说的破伤风毒素功能性片段抗原具有：
(a)经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测量的90,000至110,000的分子量；
(b)经等电聚焦法测量的7.25±0.5的等电点；和
(c)与整个破伤风毒素类毒素分子实质上相同的免疫力。
7.一种产生破伤风毒素功能性片段抗原的方法，该方法包括：
将编码以上第1或2项的破伤风毒素功能性片段抗原之DNA与载体连接；
用所说的载体转化除破伤风杆菌外的宿主细胞；和
表达所说的编码所说破伤风毒素功能性片段抗原之DNA。
下文详细叙述了本发明的细节。
在本发明中，Ala代表丙氨酸残基，Arg代表精氨酸残基，Asn代表天冬酰胺残基，Asp代表天冬氨酸残基，Cys代表半胱氨酸残基，Gln代表谷氨酰胺残基，Glu代表谷氨的酸残基，Gly代表甘氨酸残基，His代表组氨酸残基，Ile酸代表异亮氨酸残基，Leu代表亮氨酸残基，Lys代表赖氨酸残基，Met代表甲硫氨酸残基，Phe代表苯丙氨酸残基，Pro代表脯氨酸残基，Ser代表丝氨酸残基，Thr代表苏氨酸残基，Trp代表色氨酸残基，Tyr代表酪氨酸残基和Val代表缬氨酸残基。
如以上所述，本发明的破伤风毒素功能性片段抗原至少一种和由以下方法得到的片段实质上相同的片段，所述方法包括如下步骤：断裂至少一个选自在部分氨基酸序列中个别连接相互邻近氨基酸残基之肽键的肽键，其位于参与形成存在于整个破伤风毒素分子全部氨基酸序列N-末端的二硫键的两个半胱氨酸残基之间；断裂二硫键；和断裂破伤风毒素分子基团间的非共价键[如图2(b)所示]；
作为本发明的破伤风毒素功能性片段抗原的优选的实施方案，可以提及这样的破伤风毒素功能性片段抗原，其中每一个以上提及的至少一种片段分别具有选自由下列氨基酸序列(1)至(8)组成的组的N-末端氨基酸序列：
(1)KIIPPTNNIRENLYNRTASLTDLGGELCIK，
(2) IIPPTNNIRENLYNRTASLTDLGGELCIK，
(3) ENLYNRTASLTDLGGELCIK，
(4) NLYNRTASLTDLGGELCIK，
(5) NRTASLTDLGGELCIK，
(6) TASLTDLGGELCIK，
(7) SLTDLGGELCIK，和
(8) GGELCIK。
此外，可以用固定液稳定化本发明的破伤风毒素功能性片段抗原。
为了进一步说明本发明的主要特征，通过解释本发明的研制过程来描述本发明的技术特征。
具有高的产生毒素能力的破伤风杆菌菌株的分离：
在本发明中，使用了高的产生毒素能力的破伤风杆菌的菌株。本发明发明人通过单菌落分离法从Harvard H47菌株中分离出了具有高的产生毒素能力的次代株(substrain)。Harvard H47菌株是已知的破伤风杆菌菌株，其来源于已知的称为Harvard菌株的破伤风杆菌菌株[ATCC(美国典型培养物保藏中心)保藏号10779]，他把获得的次代株命名为“破伤风杆菌Harvard H47菌株Biken次代株”(下文简称为“Biken次代株”)。而且本发明发明人发现破伤风毒素的产生是在破伤风杆菌细胞中的质粒DNA携带的遗传信息控制之下的(Biken杂志，20，105-115，1977)。此外，通过利用基于上述发现的培养方法，本发明发明人通过培养Biken次代株成功地大量生产出破伤风毒素和高纯度的破伤风毒素。
这样，在本发明中首先需要挑选出具有高生产毒素能力的破伤风杆菌菌株作为种子培养物。作为种子培养可以利用微生物转化体的培养方法，如酵母、大肠杆菌和枯草杆菌等，其是通过下面提及的编码FFA的DNA利用遗传工程技术获得的。
破伤风毒素的致毒性形成方式：
在破伤风杆菌细胞中，破伤风毒素首先是以具有大约150,000的分子量的一种单一多肽链(非切口的完整形式的整个破伤风毒素分子)形式产生的(下文经常称为“胞内毒素”)。其后，通过细胞的自体溶解，破伤风毒素从细胞内释放到细胞外培养基中(在下文，释放到细胞外培养基中的毒素经常称为“细胞外毒素”)。当毒素从细胞中释放出来时，至少一个在部分氨基酸序列中个别连接相互邻近氨基酸残基之肽键(其位于参与形成存在于整个破伤风毒素分子全部氨基酸序列N-末端的二硫键的两个半胱氨酸残基之间)中的键被破伤风杆菌产生的蛋白酶裂解，从而形成至少两个多肽链。然而，这两条多肽链通过存在于整个破伤风毒素分子的完整氨基酸序列N-末端的二硫键连接到一起。也就是说这些多肽链采取带切口的形式[参见图1(a)和(b)，生物化学和生物物理学研究通信，57，1257-1262，1974；ibid.68，668-674，1976；ibid.77，268-274，19771]，进一步地说，两多肽链通过非共价键结合在一起[参见图2(b)]。破伤风毒素分子从完整形式转化为带切口的形式使破伤风毒素的致毒性提高了几倍，切口对产生毒素是必要的。因此，为了在制备功能性片段抗原时节省劳动量，最好是利用细胞外破伤风毒素(已经转化为带切口的形式，参见图1.(b))等作为初始材料。
破伤风毒素的亚单元结构和破伤风毒素的致毒性的表现机制：
作为本发明独特的研究结果，从整个破伤风毒素分子中获得了两种功能互补多肽链，即L(轻)链和H(重)链。也就是，本发明发明人成功地分离和纯化了这些片段(L和H链)，由此分别获得了L链和H链。虽然每一个单独获得的L链和H链不具有毒性，当L链和H链重新构建形成整个破伤风毒素分子时，L链和H链能够自然地重现整个破伤风毒素分子的致毒性。
另外，本发明发明人成功地分离和纯化了以下三个片段：H链的的C末端一半(片段C)、从整个破伤风毒素分子切除片段C获得的一个片段(片段A-B)和从纯化的片段A-B分离片段A得到的片段(片段B)。
进而，在制备出整个破伤风毒素分子和以上所提到的片段A、B、C、A-B和B-C以及破伤风毒素的全部的三个亚单元和邻近的亚单元的复合物之后，本发明发明人检验了这些功能性片段在功能上的不同、破伤风毒素的亚单元结构之间的关系和破伤风毒素致毒性的机制，并且提出了“三重[A-B·C]分子模型”[参见图1(C)；Biken杂志，26，133-143，1983；“Botulinum神经毒素和破伤风毒素”，L.L.Simpson编辑，pp.69-92(第4章)，学院出版社，1989]。
在第8届国际破伤风会议(1988)上，三重分子模型被认为是破伤风毒素最合适的分子模型。按照三重[A-B·C]模型，片段C具有把破伤风毒素分子携带到中枢神经系统的功能(字母“C”代表“载体”)；片段B具有把破伤风毒素分子结合到神经细胞的前突触膜和把破伤风分子运输到细胞质的作用(字母“B”代表“结合”)；片段A具有在酶活性基础上表现致毒性的功能(字母“A”代表“活性”)(参见第8届国际破伤风会议，G.Nistco等编辑，pp.170-171，Phythagora出版社，罗马-米兰，1989；感染和免疫，57，3588-3593，1989；Toxicon，27，385-392，1989；ibid.28，737-741，1990)。
各种破伤风毒素片段：
直到1989年，在世界范围的研究者中，还没有对每个破伤风毒素片段长度、分子量和命名法统一起来，在这种情况下，给研究者交流信息、讨论破伤风毒素亚单位结构和功能关系带来了困难。因此需要建立一种普通的基准来利用统一的定义研究破伤风毒素。
在这样一种情况下，本发明发明人第一次提出了上述的三重分子模型。也就是，本发明发明人指出缺乏对破伤风毒素片段的长度、分子量和命名法统一性的缺点，本发明发明人强调统一定义片段的必要性，并且提出了以上的模型[参见以上提到的“Botulinum神经毒素和破伤风毒素”，L.L.Simpson编辑，pp.69-92(第4章)]。
已经知道为什么有整个破伤风毒素分子残基获得的各种片段不仅在不同的研究者利用的破伤风杆菌的种子菌株的遗传方面有差异，而且在研究者为得到破伤风毒素和其片段运用的操作条件也有细微的差别，操作条件如种子菌株的培养条件、为获得细胞外毒素(已经转化为带切口的形式)而培养的细胞的自体溶解条件和提取的细胞外毒素的处理条件(也就是用蛋白酶消化提取的细胞外毒素形成带切口的形式的条件)，并且用还原剂、变性剂或增溶剂等处理提取的细胞外毒素的操作条件也有些不同，其中提取的细胞外毒素的处理条件包括酶和试剂的类型、处理时间、酶和试剂的浓度、处理溶液的pH值和处理提取的细胞外毒素的物理条件(如搅拌、振荡或保持静止状态等)。
本发明的“ FFA”的定义：
本发明的功能性片段抗原(FFA)是一种破伤风毒素功能性片段抗原，其包含至少一种和由以下方法得到的片段实质上相同的片段，所述方法包括如下步骤：断裂至少一个选自在部分氨基酸序列中个别连接相互邻近氨基酸残基之肽键的肽键，其位于参与形成存在于整个破伤风毒素分子全部氨基酸序列N-末端的二硫键的两个半胱氨酸残基之间；断裂二硫键；和断裂破伤风毒素分子基团间的非共价键[如图2(b)所示]；
破伤风毒素功能性片段抗原具有：
(a)经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测量的90,000至110,000的分子量；
(b)经等电聚焦法测量的7.25±0.5的等电点；和
(c)与整个破伤风毒素类毒素分子实质上相同的免疫力。
作为本发明发明人研究的结果，已经发现可以获得FFA的各种类型N-末端氨基酸的序列[参见图2(a)]。在本发明中，优选的是破伤风毒素功能性片段抗原具有选自由8种氨基酸序列(如图2(a)所示)组成的组的N-末端氨基酸序列。而且本发明的破伤风毒素片段抗原(FFA)具有和整个破伤风毒素类毒素实质上相同的免疫力。此外，本发明的破伤风毒素片段抗原(FFA)和常规的整个破伤风毒素类毒素相比能极其有效地减少不利副作用。术语“免疫力”指预防破伤风症状发生的能力。在本发明中术语“具有和整个破伤风毒素类毒素实质上相同的免疫力”指FFA显示了它的1±0.2的相对效力(相对于整个破伤风毒素类毒素FFA的效力率)，这种相对效力是通过这样一种方法测量的，即利用平行线分析方法对包含FFA的疫苗和包含通过在参考实施例14中描述的方法制备的整个破伤风毒素类毒素的疫苗测量免疫力，在平行线分析方法中利用了已知的效力国际单位作为参考，也利用了实施例1(5)中描述的已知的LD50(半致死量)激发毒素。利用参考实施例15中描述的计分方法分析结果。
这样，本发明也提供了包含FFA作为活性组分的单一抗原破伤风疫苗(如简易制剂、吸附(adsorbed)制剂或冻干制剂)和包含FFA作为许多活性组分之一的组合疫苗(如DPT组合疫苗、DT组合疫苗)或包含FFA和至少一种选自由以下不同于FFA的疫苗抗原组成的组的疫苗抗原的组合疫苗，所述疫苗抗原包括如流感B疫苗抗原、失活的小儿麻痹症脊髓炎疫苗抗原、失活的肝炎B疫苗抗原、失活的日本脑炎疫苗抗原等。本发明也提供了大量生产以上疫苗的方法。
下文说明了制备本发明的FFA、利用制备的FFA制备疫苗和评估制备的疫苗的检验方法等。
(1)种子微生物：
就用作本发明的功能性片段抗原(FFA)的种子培养物的微生物而言，没有什么特殊的限制，只要微生物具有高的毒素产生能力。这样的微生物的例子包括破伤风杆菌Harvard菌株的次代株和其它具有和Harvard菌株实质上相同或更高产生破伤风毒素能力的破伤风杆菌菌株。具体地说，优选的是利用具有高的产生毒素能力(参考实施例1)的Biken次代株。此菌株是利用单菌落分离从Harvard H47菌株(从Harvard菌株衍生的已知的破伤风杆菌)中获得的[保藏在ATCC(美国典型培养物保藏中心)保藏号10779]。
此外，作为种子微生物，可以利用通过基因工程技术用编码FFA的基因转化微生物(如酵母、大肠杆菌、枯草杆菌等)获得的转化体微生物。具体地说，作为种子微生物，可以利用通过具有可操作连接的编码FFA的DNA的大量表达载体转化的大肠杆菌，其中转化的大肠杆菌是按照下文的参考实施例2中所描述的方法获得的。
(2)培养基：
可以使用常规培养基培养用于获得FFA的种子微生物。例如，可以把培养厌氧微生物的常规液体培养基用于培养上述种子微生物。这样的液体培养基的例子包括庖肉培养基、PYG(胨、酵母抽提物、葡萄糖)、GAM(Gifu厌氧培养基)肉汤、牛肉浸渍培养基、肝脏-肝脏肉汤(liver-1iver broth)、RCM(增强的梭菌培养基)肉汤DRCM(特异的增强梭菌培养基)。如有必要，为了改进微生物的生长特征和/或保持低的氧化-还原潜力，可以通过代替、添加或除去其中的组分或改变其组分的量从而改变培养基。在这些培养基中，肝脏-肝脏肉汤可以优选地用于制备种子培养物，由本发明发明人设计的一种改变的Latham培养基(参考实施例3)可以优选地用于由种子培养物产生破伤风毒素。
(3)培养条件：
至于为获得FFA而使用的种子微生物的培养条件，没有特殊的限制。例如，在以下的培养条件下培养了具有高的产生毒素能力破伤风杆菌菌株，在这种培养条件中，培养温度由大约30℃至大约37℃，优选的是从大约34℃至36℃，培养时间从大约1天至8天，特殊地，为提取胞内毒素的培养时间从大约1天至大约2天，为收获细胞外毒素的培养时间从大约4天至大约7天。
(4)制备FFA的初始材料：
在本发明中，从以上所述的培养细胞获得的整个破伤风毒素分子制备FFA。制备FFA的初始材料的例子包括以上所述的培养微生物的细胞提取物(包含胞内破伤风毒素)和培养物上清液或培养物过滤液(每种液体中包含带切口的形式的细胞外破伤风毒素)，后者是使培养细胞进行自体溶解，通过离心或过滤除去未裂解的细胞和包含生成的自体溶解产物的细胞碎片获得的。当需要从胞内破伤风毒素制备FFA时，必需用蛋白酶(如胰蛋白酶或者胰凝乳蛋白酶)裂解胞内破伤风毒素，这样，把胞内破伤风毒素转化成为带切口的形式。因此，为了在制备过程中减少劳动量和获得高的产量，优选的是使用包含带切口的形式的细胞外破伤风毒素的培养物上清液或者培养物滤液作为初始材料。
(5)破伤风毒素的初步纯化：
通过常规方法可以对初始材料中的整个破伤风毒素分子进行粗提纯。这种常规方法的实例包括利用铵硫酸盐的盐析、乙醇沉淀、吸附凝胶吸附和利用商业上获得的膜进行超滤作用。在本发明中，通过这些初步纯化方法获得的整个破伤风毒素分子称为“部分纯化的整个破伤风毒素”。
(6)破伤风毒素的高度纯化：
在以上第(5)项中所描述的方法获得的部分纯化的整个破伤风毒素可以通过以下方法进行高度纯化，这些方法如利用密度梯度超速离心法和平衡密度梯度超速离心法(参见未审查日本专利申请公开说明书07-89951)或把常规的方法适当地组合使用(如超速离心法、凝胶过滤、离子-交换层析和高效液相色谱)等。在本发明中，通过这些纯化方法获得的高度纯化的整个破伤风毒素分子(下文经常简称为“高度纯化的破伤风毒素”)可以作为制备本发明的FFA的材料。至于高度纯化的破伤风毒素是否适合用作整个破伤风毒素分子，这需要验证。可以通过测定MLD(最小致死量，参考实施例4)、LF单位(絮凝单位，参考实施例5)和蛋白质含量(参考实施例6)等进行适合性验证。
(7)FFA的制备：
在本发明中，FFA是通过上述的高度纯化的破伤风毒素制备的。当利用胞内破伤风毒素制备用于产生FFA的高度纯化的破伤风毒素时，首先需要用蛋白酶(如如胰蛋白酶或者胰凝乳蛋白酶)温和地消化或裂解胞内破伤风毒素以便使之转化为带切口的形式。可以通过包含以下步骤的方法制备破伤风毒素的两种功能性片段，用还原剂断裂存在于纯化的带切口的形式的破伤风毒素中的N-末端的二硫键；通过变性剂断裂破伤风毒素分子基团间的非共价键。还原剂的例子包括常规的还原剂如巯基乙酸钠、二硫苏糖醇(下文简称“DTT”)、谷胱甘肽、巯基乙醇、硫化氢，氢硼化钠、硫化钠、硫化铵等。至于变性剂，可以使用常规的变性剂。这些试剂的实例包括胍硫氰酸、胍盐酸硫胺素、尿素、十二烷磺酸钠等。在本发明中，优选的是DTT和尿素。关于DTT优选的使用方式，例如，在含有大约1至10mg/ml毒素蛋白质的溶液中，DTT的最终浓度一般范围在10至200mM，优选的为50至150mM，反应在15℃至35℃进行20至180分钟。关于尿素的优选使用方式，例如，在含有大约1至10mg/ml毒素蛋白质的溶液中，尿素的最终浓度一般范围是在0.5至10mM，优选的为1至5mM，反应在5℃至35℃进行10秒钟至15分钟。每种这样的试剂加入到初始材料中以使试剂的浓度在以上提到的各自浓度范围内。在本发明中，DTT是以溶液的形式使用的(参见参考实施例8；在下文这种溶液被称为“DTT Tris缓冲液”)，把这种溶液以5至50倍初始材料体积的量加入到初始材料中，使DTT和破伤风毒素反应。尿素是以饱和溶液的形式或者直接的晶体形式使用的。
作为用上面提及的DTT和尿素处理的结果，断裂了带切口的形式的整个破伤风毒素分子并获得了FFA溶液。通过洗脱包含FFA的溶液以降低尿素浓度，经采用在280nm的吸收率为指示分级分离或分离可以以高纯度的破伤风毒素片段获得FFA(参见参考实施例7)。可以利用例如密度梯度离心和平衡密度梯度超速离心法(参见未审查日本专利申请07-89951)、SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)、凝胶过滤、膜过滤、离子-交换色谱、高效液相色谱等组合方法进行纯化。通过这些纯化方法，得到了不同的分子量的两个组份，相应的两个峰出现在280nm，并且发现FFA在较大分子量的组份中。包含FFA的组份用作FFA破伤风疫苗的活性组分。可以根据如下描述的方法制备整个破伤风毒素分子(参考实施例13)。可以经例如SDS-PAGE(参考实施例10)、凝胶沉淀反应(实施例11)和利用肽序列分析(参考实施例12)的方法测定每一整个破伤风毒素分子和FFA的分子量、抗原特异性、氨基酸序列等。
(8)FFA的稳定性：
本发明的FFA中缺少整个或者大部分片段A区(表现毒性的活性位点)，那么这样本发明的FFA不具有毒性。因此，这样的FFA能用作类毒素，而不需解毒。然而，为了稳定FFA的立体化学结构并把它作为抗原，优选的是进行破伤风毒素FFA的稳定化(固定化)。固定液(固定或稳定剂)的例子包括常规解毒试剂如福尔马林、戊二醛、β-丙炔内脂等。例如，当福尔马林用作为固定液时，优选的是福尔马林和FFA溶液的体积比大约在0.0004至0.7％(V/V)范围内。稳定温度大约在3℃至37℃范围之内，稳定时间大约在5至180天范围内。FFA的抗原性具有被稳定作用破坏的危险，通过降低固定液的浓度、降低稳定时间或加入中性氨基酸(如甘氨酸和丝氨酸)或碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)使稳定条件适中。在稳定结束后，如果需要的话，可以通过加入和甲醛等量的亚硫酸氢钠中和溶液中剩下的自由甲醛或通过利用膜过滤或透析除去甲醛。经过稳定处理之后，把FFA溶液储存在4℃下以备以后作为用于制备破伤风疫苗的破伤风毒素疫苗的批量溶液。在稳定处理之后，把处理的整个破伤风毒素分子和处理的FFA分别称为“整个破伤风毒素类毒素”和“FFA类毒素”。
(9)FFA破伤风疫苗的制备：
可以稀释以上第(8)项中所获得的FFA类毒素批量溶液以便获得一种包含有效致免疫量的FFA类毒素的疫苗。例如，以等渗盐溶液或用于组织培养的缓冲液或培养基稀释批量溶液，这样疫苗中的单一抗原类毒素的蛋白质含量为20至200μg之间，或吸附的类毒素的蛋白质含量为8至80μg。
当把批量溶液稀释为以上所述的状态时，就可以把为增加疫苗的抗热性或一种作为辅助剂的佐剂以增加免疫力的稳定剂加入疫苗溶液。优选的是加入疫苗的稳定剂的量为0.01至10％(W/V)，佐剂的量为每ml疫苗中加入0.1至50ml。稳定剂的例子包括糖化物、氨基酸、明胶水解物、人类清蛋白等。佐剂的例子包括能使抗原持续释放的凝胶(例如磷酸钙、磷酸铝、硫酸铝、氧化铝、皂土等)、抗体产物诱导剂(如胞壁酰肽(muramylpeptide)衍生物、Krestin、Picibanil等)。
其后，将单一抗原疫苗或吸附疫苗分装到小容器中(如安瓿或药水瓶)，然后，将容器密封，例如通过融合密封，密封的疫苗可以作为普通的或者吸附制剂。疫苗在分装之后用低压冷冻，疫苗就可以作为低压冷冻制剂。进而可以把疫苗制成组合疫苗制剂的形式，如DT二元疫苗、DPT三元疫苗、四元疫苗等。
把每种这样的制剂进行各种检验以验证作为类毒素或疫苗的合格性。也就是，对每种这样的制剂在功效、安全、均一性依据日本健康和福利部的通报217中：“Seibutsugakuteki Seizai Kijun(生物产品最小需求)”有关规定进行各种检验(如称为“破伤风类毒素”的规定、称为“吸附破伤风类毒素”的规定、称为“白喉-破伤风结合类毒素”的规定或称为“白喉-百日咳-破伤风结合疫苗”的规定)，进而检验它作为疫苗合格性。只有检验过的制剂才能在实践中应用。关于施用方式，制剂以皮下或者肌肉注射每人0.5ml的量的方式施用。如果是低压冷冻制剂，使用前在无菌蒸馏水中溶解以得到具有冻干之前的原来体积的溶液。
(10)FFA破伤风疫苗免疫力的测量：
利用免疫动物(天竺鼠或者小鼠)采用已知LD50(半致死量）的激发毒素分析方法或抗血清中和毒素活性分析方法，按照日本健康和福利部的通报217：“Seibutsugakuteki Seizai Kijun(生物产品最小需求)”名称为“破伤风类毒素”或“吸附破伤风类毒素”的规定经效力测定测量本发明的FFA破伤风疫苗的免疫力。另外在本发明中以上提及的测验中，利用激发毒素进行进一步的效力分析测定了对于整个破伤风毒素的FFA的相对免疫力，其中的使用了计分方法(参考实施例15)。
(11)FFA破伤风类毒素不利副作用的动物检验：
可以依据常规方法进行本发明的FFA破伤风类疫苗不利副作用的动物检验。可以用来评估破伤风类毒素不利副作用的动物检验的实例包括利用基于即刻型变态反应之大鼠的被动皮肤过敏反应(PCA)试验(参考实施例17)、利用基于延迟型变态反应之小鼠的footpad反应试验(相关的实施例18)和利用基于延迟型变态反应之天竺鼠的真皮内反应试验(参考实施例19)。
实施本发明的最好方式
在下文中通过参照下面的实施例和参考实施例更详细地描述了本发明，但是它们不构成对本发明的范围的限制。
在下列参考实施例中，具体地显示了实施本发明的方法。
[参考实施例1]具有高的产生毒素能力的破伤风杆菌菌株的单菌落的分离：
在Zeissler血液琼脂[把葡萄糖和去纤维蛋白牛血液加入到从商业途径得到的未改变琼脂培养基中，使最后的葡萄糖浓度和去纤维蛋白牛血液浓度分别为2％(W/V)和20％(V/V)，之后混合]平板上形成破伤风杆菌Harvard A47菌株的菌落，将形成的菌落分别接种到改进的Latham培养基中(参见以下的参考实施例3)培养以获得培养物。对获得的每种培养物，按照以下的参考实施例5中所描述的方法测量Lf值。从上述的菌落中，把具有最高Lf值的用于培养的菌落作为菌落破伤风杆菌HarvardA47菌株(具有高的产生毒素能力)的Biken次代株。
[参考实施例2]FFA的具有高的毒素产生能力的转化体的制备：
用限制性内切酶消化破伤风毒素基因的DNA[参见EMB0杂志，5(10)，2495-2502，1986；核酸研究14(19)，7809-7812，1986]获得编码FFA的2.7kb DNA片段(Stu I-Bsp HI)。把获得的DNA片段插入并连接到pSN508[其是能在大肠杆菌中大量表达的载体(参见美国专利4,703,005)]，获得重组表达载体。然后把获得的重组体表达载体引入到大肠杆菌菌株CSH26形成FFA的具有高的产生毒素能力的转化体。当通过培养上述转化体产生FFA产物时，就不必要进行下面的处理，如利用蛋白酶消化整个破伤风毒素分子；利用DTT或尿素处理等，但是还需要纯化。
[参考实施例3]改进的Latham培养基组成(每1升培养基)：多聚蛋白胨 20g牛心脏提取物 10g葡萄糖 8.0g氯化钠 2.5g硫酸镁(七水合物) 0.1g胱氨酸 0.125μg泛酸钙 1.0mg尿嘧啶 1.25mg烟酸 0.25mg硫胺素 0.25mg核黄素 0.25mg吡哆醇 0.25mg生物素 2.5μg维生素B12 0.05μg叶酸 100μg氯化铁(III)(六水合物) 32mg硫酸铁(七水合物) 0.2g
(用7N NaOH调整pH值为7.0)
[参考实施例4]MLD(最小致死量)：
将通过以100.5对数间隔连续地稀释破伤风毒素制备的0.1至0.5ml每种包含破伤风毒素的稀释液分别皮下注射或肌肉注射到OF1小鼠的左后腿股上(重20至25g)。在剂量(剂量的对数)-反应(死亡的时间)曲线的基础上测定MLD[参见“第6届国际破伤风会议论文集(Lyon，1981)”pp.21-32]。
[参考实施例5]Lf单位(絮凝单位)：
可以通过Ramons方法测量毒素溶液的Lf值(Biken杂志，7，137-152，1964)。测量了1 Lf(和1个单位抗毒素进行反应的毒素的量)的毒素。而且，也可以利用SRID(单一散射免疫扩散)进行上述的Lf值的测量(参见免疫化学，2，235-254，1965)。
[参考实施例6]蛋白质含量的测量：
按照“Lowry等的改进的方法”测量蛋白质含量，在这种方法中利用色度评价蛋白质的显色反应和酚试剂。在下文，这种方法简称为“酚试剂法”。
[参考实施例7]蛋白质片段的鉴定和蛋白质片段间的蛋白质浓度的比较：
通过测量样品在280nm波长紫外线吸收进行蛋白质片段的鉴定和蛋白质片段间的蛋白质浓度的比较(在下文称为“在280nm吸收”)。
[参考实施例8]DTT-Tris缓冲液(100mM)的制备：
通过混合50mM Tris(羟甲基)三羟甲基氨基甲烷-HCl(在下文简称为“Tris”)、1m乙二胺四乙酸(在下文简称为EDTA)和100 mMDTT制备DTT-Tris缓冲液。用1/10M HCl把DTT-Tris缓冲液的pH值调整到8.2。
[参考实施例9]磷酸缓冲液的制备：
通过混合等摩尔量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钾溶液制备磷酸缓冲液。适当地选择将要混合的溶液的量以便使产生的磷酸缓冲液有一个理想的pH值。
[参考实施例10]利用SDS-PAGE测量蛋白质的分子量：
在SDS-PAGE中，可以利用具有7.5％(W/V)、7.0％(W/V)(包含2M尿素)、5.0％(W/V)等的SDS-PAGE凝胶。例如作为缓冲液，可以利用10mMTris-77mM甘氨酸缓冲液(pH值为8.6)。在进行电泳后利用考马斯亮兰对凝胶染色。由样品蛋白质的迁移距离对标记染料或已知分子量的蛋白质的迁移距离的比率分别测定每个蛋白质的分子量。作为按照以上方法产生的测量结果，发现FFA的分子量(X104)和整个破伤风毒素分子的分子量分别为100,000和150,000。
[参考实施例11]利用双免疫扩散测定抗原的特异性
通过Ouchterlony的方法在50mM Tris-0.6M甘氨酸缓冲液(包含1mMEDTA，pH值为8.5)和除去了非特异性抗体的马-抗破伤风毒素血清中利用1％(W/V)琼脂糖测定抗原的特异性。
观察在FFA和整个破伤风毒素分子之间的抗原性交叉反应。
[参考实施例12]FFA的氨基酸序列的测定：
利用自动氨基酸序列分析仪(如美国Perkin Elmer制造和出售的应用生物系统Procise 492)进行FFA的氨基酸序列测定。在下面的实施例1获得的FFA具有图2(a)所示的N-末端氨基酸序列(7)，同时下面的实施例7获得的FFA具有图2(a)所示的N-末端氨基酸序列(4)。进而，通过适当选择破伤风杆菌的培养条件，可以获得具有图2(a)的N-末端氨基酸序列(8)的FFA。可以由胞内破伤风毒素通过适当地选择消化条件(如酶浓度、反应时间和反应温度等)用胰蛋白酶消化胞内破伤风毒素分子使之转化成为带切口的形式的毒素分子，制备分别具有图2(a)的N-末端氨基酸序列(1)至(3)和(6)的FFA。通过胰凝乳蛋白酶消化胞内破伤风毒素分子使之转化成它的带切口的形式可以制备图2(a)的N-末端氨基酸序列(5)的FFA。因此，在本发明中，可以得到分别具有图2(a)的N-末端氨基酸序列(1)至(8)的8种不同类型的FFA。这8种类型的FFA可以分别或以组合形式作为破伤风疫苗的活性组分。
[参考实施例13]FFA的等电点的测定：
利用商业上可获得的凝胶(例如，由瑞典Pharmacia生物技术公司制造和出售的商标名为“Phast Gel IEP 3-9”的一种凝胶)经等电聚焦法可以测定FFA的等电点。作为按照上述的方法在实施例中产生的测量结果，发现本发明的FFA具有在7.25±0.5范围内的等电点。
[参考实施例14]整个破伤风毒素分子的制备：
把参考实施例1中获得的破伤风杆菌菌株的种子培养物接种在参考实施例3中描述的培养基上培养44小时，并且通过在4℃10,000xg下离心25分钟收获细菌细胞。用细胞培养物1/30体积的量加入含有0.1M柠檬酸钠的1M NaCl溶液并进行温和振荡以便提取胞内毒素。产生的混合物在4℃搅拌过夜以提取破伤风毒素，然后在4℃10,000xg下离心30分钟除去细胞和细胞碎片。利用生成的上清液作为初始材料，按和以下实施例1中实质上相同的方式纯化毒素以获得整个破伤风毒素制剂。
[参考实施例15]用于评价免疫力的计分方法：
利用计分方法评价破伤风类毒素的相对功效。例证性地说明，已经注射了破伤风疫苗的免疫学实验动物由毒素激发，观察破伤风症状一周以上。利用计分方法按照下列标准评价症状的严重程度：
结果 计分
在第1天死去的动物： 0
在第2天死去的动物： 1
在第3天死去的动物： 2
在4至7天间死去或表现严重症状的(如强直
性惊厥、行走困难和呼吸痛苦等)的动物：3
经过一周以后具有轻度症状[如注射面的对面
的腹肌局部麻痹(通过悬起动物尾巴来观
察检查症状)]存活的动物： 4
一周后没有任何症状存活的动物： 8
通过计算机利用统计分析软件平行线分析方法分析获得的分数，其中根据均匀性、线性、平行性评价破伤风类毒素的相关免疫力(相对于已知国际单位的标准破伤风整个毒素类毒素)，从而得出分数的相关分析。
[参考实施例16]天竺鼠的真皮内反应：
通过对每个天竺鼠真皮内注射1ml的破伤风疫苗使三组天竺鼠致敏，其中上述三组天竺鼠分别用(1)商业途径得到的部分纯化的整个毒素类毒素，(2)纯化的整个毒素类毒素和(3)FFA疫苗致敏。从致敏后四周刮除各个天竺鼠的后背的毛，然后分别在天竺鼠后背真皮内注射0.1ml上述的破伤风类毒素。破伤风毒素溶液的蛋白质浓度依据每个组的天竺鼠而变化(32.0、10.0和3.2μg)。在注射后的24小时，检查注射蛋白质的每个天竺鼠是否发生皮肤反应、红斑、硬结和/或坏死。当观察到发生红斑时，测量红斑的直径。
实施例1
(1)整个破伤风毒素分子(带切口的形式)的产生和纯化
把破伤风杆菌Harvard A473。菌株(参见参考实施例1)的Biken次代株的种子培养物5ml接种在20根管中，每根管(直径：6cm；高度：38cm)包含450ml改进的Latham培养基(参见参考实施例3)。把管用松散的棉花塞塞住，并在35℃培养5天直到培养物变得清晰。把这些培养物在4℃10,000xg离心30分钟以获得清洁的培养物上清液。把获得的8.5升培养物上清液作为初始材料，过滤后用于纯化整个破伤风毒素分子(带切口的形式)。
加入硫酸铵饱和溶液(在25℃；pH值为7.0)并在冰-水浴中和初始材料混合以盐析出具有20％至40％硫酸铵饱和溶液组份。把获得的组份悬浮在65ml的0.06M磷酸缓冲液(pH值7.5，4℃)(参见参考实施例9)中以获得具有40％硫酸铵饱和悬浮液。获得的悬浮液在4℃15,000xg进行离心30分钟以便获得沉淀。利用在22ml上述的磷酸缓冲液中悬浮洗涤获得沉淀物，在上述提到的相同的离心条件下对该沉淀进行离心。把洗涤过的沉淀物溶解在0.1M磷酸缓冲液(pH值为7.5，4℃)中，并且在4℃100,000xg超速离心2小时以除去沉淀残余物，由此获得了20ml上清液。利用Acrodisc膜(孔径：0.2)(德国Gelman有限公司制造和出售)过滤获得的上清液，把生成的部分纯化的毒素滤液通过用0.1M磷酸缓冲液(pH值7.5)平衡的Ultrogel AcA 34柱(内径：2.5cm，长度：100cm)(瑞典LKB-Pharmacia制造和出售)进行凝胶过滤。
在凝胶过滤中，在4℃利用上述的磷酸缓冲液进行洗脱(流速率：9ml/小时)，形成的洗脱物分级分离为1ml组分，测量每个组分在280nm的吸收率(参见参考实施例7)。收集具有高吸收率的组分，由此获得了总体积为5ml的凝胶过滤洗脱物。
按照酚试剂法(参见参考实施例6)测量获得的洗脱物的蛋白质含量，并且进行每1mg蛋白质的最小致死量的测量(参见参考实施例4)和每1mg蛋白质的Lf的测量(参见参考实施例5)。结果，洗脱物的蛋白质含量是60mg/毫升，Lf为400，最小致死量为3.5×107。
此外，通过用0.1M磷酸缓冲液(pH值6.8)平衡的TSK(HPLC)G3000 SW柱(内径：0.75cm，长度：60cm)(日本Tosoh公司制造并出售)进行高效液相色谱分析0.2ml的洗脱物，其中利用上述磷酸缓冲液(流速率：0.6ml/分钟)进行洗脱，由此获得各组分。测定每个组分在280nm的吸收率。结果，观察到了一个明显的单峰，这表明整个破伤风毒素分子是高度纯化的。在以下描述的FFA的制备中，以上获得的洗脱物用作高度纯化的整个长度破伤风毒素分子(带切口的形式)的溶液(即高度纯化的破伤风毒素溶液)。
(2)FFA的制备
把18ml的DTT-Tris缓冲液(参见参考实施例8)加入到2ml的高度纯化的破伤风毒素溶液中，然后进行混合。生成的混合物在25℃反应60分钟以减少存在于整个破伤风毒素分子中的二硫键。通过在混合物中加入4.8g固体尿素处理形成的混合物，接下来通过混合来溶解混合物中的固体尿素(尿素的最终浓度：4M)。在混合物中加入20ml的50mM Tris缓冲液(包含0.6M甘氨酸、1mMEDTA和1mM DTT；pH值8.5)，并且用Amicon超滤系统将形成的混合物浓缩，由此获得了3ml的浓缩液。通过用50mM磷酸缓冲液(包含0.6M甘氨酸、1mM EDTA、1mM DTT和2M尿素；pH值8.5)平衡的Ultrogel AcA 44柱(内径：1.5cm，高度：90cm)把获得的浓缩液进行凝胶过滤。在凝胶过滤中，利用上述的50mM Tris缓冲液(流速率：5ml/小时)进行洗脱，并且把形成的洗脱物分级分离为1.2ml的组分。对每种组分测定在280nm的吸收率。结果，观察到了2个峰(峰1和峰2)。从获得的组分(包括两种组分，其中每一种具有在280nm峰值，即峰1组分和峰2组分，其中的峰1组分比峰2组分得到的要早一些)中，收集了由连续地从峰1组分获得的5个组分(总量6ml)组成的一组组分和另外的连续地从峰2组分获得的5个组分(总量6ml)组成一组组分，由此分别获得了收集组分1和收集组分2。
将每个高度纯化的破伤风毒素溶液、收集组分1和收集组分2进行SDS-PAGE(参见参考实施例8)以测定近似的分子量；并进行凝胶沉淀反应(参见参考实施例9)以测定抗原性。结果，纯化的破伤风毒素、收集组分1和收集组分2的分子量分别为大约150,000、100,000和50,000。至于抗原性，观察到在高度纯化的破伤风毒素溶液和每个收集组分1和收集组分2之间的抗原性交叉反应，然而没有观察到收集组分1和收集组分2之间的交叉反应，这表明这两种类型的收集组分具有完全不同的抗原性。进而，通过酚试剂法测定了收集组分1和收集组分2的蛋白质含量。收集组分1和收集组分2的蛋白质含量分别为15mg/ml和8mg/ml。从以上结果可以确定收集组分1包含FFA。在如下描述的操作中，把收集组分1作为FFA溶液。
(3)FFA的稳定性
将4ml的FFA溶液在4℃的1/15M磷酸缓冲液(pH值7.8)中透析过夜。在透析完成之后，把上述的磷酸缓冲液与透析的FFA溶液混合，由此获得了总量为380ml的溶液。把20ml的500mM赖氨酸溶液加入到上述FFA溶液中，所以FFA溶液的蛋白质含量变成600μg/ml。
把生成的FFA溶液加入一定量的福尔马林，使最终的福尔马林浓度为0.2％(V/V)，把生成的混合物在37℃培养14天以稳定FFA。然后，稳定后的FFA在4℃0.85％(W/V)的NaCl溶液中透析过夜以除去甲醛和赖氨酸，把透析液通过Acrodisc膜(管孔直径：0.22μm)过滤用于灭菌。获得的滤液贮存在4℃的条件下，并且作为以下描述的批量FFA破伤风疫苗溶液。
(4)样品FFA破伤风疫苗的制备
用0.85％(W/V)的NaCl溶液稀释批量FFA破伤风疫苗溶液以获得具有50μg/ml的最终蛋白质浓度的稀释液。把等体积的AL(OH)3凝胶悬液[AL(OH)3含量：2mg/ml]加入到以上形成的溶液中，然后混合，获得稀释液。把形成的混合物置于4℃下过夜，这样，FFA被吸附在AL(OH)3上，由此获得了样品疫苗。对获得的样品疫苗，通过下面描述的方法评价其活性(免疫力)和安全性(其毒性或者不利副作用)。
(5)样品FFA破伤风疫苗的免疫力
通过利用小鼠的实验进行样品FFA破伤风疫苗的免疫力评价。制备和以上第3(项)和4(项)实质上相同的另外一种疫苗(除参考实施例14中制备的整个破伤风毒素分子溶液外)用作对照，对每一种样品疫苗和对照疫苗，用0.85％的(W/V)NaCl溶液进行的连续的2.5倍稀释从而获得具有不同稀释比的稀释液，按照下文所述的方法施用于小鼠，其中至少三种稀释液具有稀释比，其能使稀释液表现出在剂量反应曲线的线性区域内的剂量反应关系。
利用获得的疫苗稀释液(即样品疫苗稀释液和对照疫苗稀释液)，按照如下方法对小鼠实施免疫。样品疫苗的稀释液(每个具有0.5ml)通过皮下注射到左后腿的大腿内侧分别施用到10只随机选择的ddy/S雌性小鼠(每个22至26g)。注射后四周，每个免疫小鼠皮下注射100L D50标准的毒素(LotTA-4B)(由日本健康状况的国家研究所提供)。利用对照疫苗稀释液代替样品疫苗稀释液也进行以上的操作。在上述操作完成后，一周后观察小鼠是否存活，观察存活小鼠的症状。利用计分方法评价(参见参考实施例15)观察的结果。利用计算机统计分析软件分析获得的分数的变异和相关性。在统计分析的结果中，计算了样品FFA破伤风疫苗的相关免疫力(相对于包含整个破伤风毒素类毒素的疫苗的免疫力，样品疫苗的免疫力的比率，其中对照疫苗的免疫力定义为1.0)。上述试验重复四次，利用计算机统计分析获得的相关免疫力的值。结果如表1所示。
样品FFA破伤风疫苗的免疫力实质上和包含整个破伤风毒素类毒素的对照疫苗的免疫力相同。
(6)利用天竺鼠来评价样品FFA破伤风疫苗的真皮内反应引起的不利副反应程度的实验
按照参考实施例16中的描述利用天竺鼠实施真皮内反应，(std.Hartley，重量为300至350g，5周龄，峰性)(从日本SLC，Inc.得到)。下面进行了天竺鼠的致敏过程。至于使天竺鼠致敏的抗原，使用的是由样品FFA破伤风疫苗(FFA)、商业上可得到的可能包含整个破伤风毒素类毒素(常规类毒素)的破伤风类毒素和包含纯化的整个破伤风毒素类毒素(整个毒素类毒素)制成的抗原。
利用0.85％(W/V)的NaCl溶液稀释每个这种抗原以使蛋白质最终浓度和AL(OH)3最终浓度分别为10μg ml和0.2mg/ml，进而获得三种类型的抗原稀释液。把天竺鼠随机地分为九组，每组有三只天竺鼠，把上述获得的三种类型的抗原稀释液分别施用到九组中的每一组的三个天竺鼠上。当致敏阶段(4周)完成后，通过以下的方法利用上述抗原激发(challenge)致敏的天竺鼠。对上述的每种抗原，使用的是利用0.85％(W/V)的NaCl溶液制剂备分别具有3.2、1.0和0.32μg/ml的最终蛋白质浓度的三种类型稀释液。把产生的九种类型的稀释液(FFA的三种类型的稀释液、常规类毒素的三种类型的稀释液和整个毒素类毒素的三种类型的稀释液组成的)施用到天竺鼠上，属于相同的组的天竺鼠施用相同类型的稀释液，其中每种稀释液的剂量为0.1ml。把0.1ml的0.85％(w/v)NaCl溶液皮内注射到分别用上述抗原实质上和以上相同的方式致敏的三只天竺鼠的每一只上作为对照。结果如表2所示。将每只施用样品FFA破伤风疫苗的天竺鼠与施用常规疫苗的天竺鼠及施用包含整个破伤风毒素类毒素的疫苗的天竺鼠比较，发生的真皮内反应或者不能检测到，或者症状比较轻微。
实施例2
(1)部分FFA破伤风疫苗溶液的制备
将0.5升的破伤风杆菌HarvardA47菌株的Biken次代株的种子培养物接种在具有100升容积的不锈钢水槽(直径：60cm，高：50cm)中的80升改进Latham培养基中。把水槽用一种硅树脂薄片密封，把种子培养物在35℃培养6天获得一种培养物，将获得的培养物用硅藻土-过滤纸过滤以便灭菌。所获得的滤液利用“pericon盒系统”(由美国Milllipore出售和制造)离心。由此获得了7升的浓缩液。利用获得的浓缩液作为初始材料，以和实施例1中实质上相同的方式进行纯化整个破伤风毒素分子、制备FFA和固定FFA，由此获得了450ml的具有600μg/ml蛋白质浓度的批量FFA破伤风疫苗溶液。
(2)FFA破伤风简易疫苗制剂的产生
利用1/75M磷酸缓冲液(pH值6.5)稀释以上所获得的批量FFA破伤风疫苗溶液，以便疫苗制剂的最终蛋白质浓度将成为60μg/ml。把形成的稀释液分别以下列顺序加入一定量的蔗糖、L-精氨酸和Haemaccel(由德国Hoechst Aktiengesellschaft制造并出售)，使蔗糖、L-精氨酸和Haemaccel的最终浓度分别为3％(W/V)、1％(W/V)和2％(W/V)，接着，混合溶液以获得单一抗原疫苗制剂。获得的制剂分装在具有1ml体积的玻璃瓶中，使得每瓶含有0.6ml的制剂，然后把瓶密封。把获得的单一抗原疫苗制剂按照日本健康和福利部的通报217：“Seibutsugakuteki SeizaiKijun(生物产品最小需求)”标题为“破伤风类毒素”的规定进行各种检验。结果证明获得的制剂是合格的疫苗。
实施例3
吸附FFA破伤风疫苗的产生
利用1/40M磷酸缓冲液(pH值6.0)稀释在实施例2中获得的批量FFA破伤风疫苗溶液，以便疫苗制剂的最终蛋白质浓度为60μg/ml。把形成的稀释液加入一定量的磷酸铝凝胶，使疫苗制剂的最终磷酸铝凝胶浓度为0.2ml/ml，从而获得混合物。获得的混合物在4℃搅拌5小时以便吸附在磷酸铝凝胶上的FFA。形成的混合物在4℃2000rpm离心20分钟以收集凝胶。把收集的凝胶是悬浮在1/75M磷酸缓冲液(pH6.5)中。把形成的悬浮液分别以下列顺序加入一定量的蔗糖、L-精氨酸和Haemaccel(德国Hoechst Aktiengesellschaft制造并出售)，使蔗糖、L-精氨酸和Haemaceel的最终浓度分别为3％(W/V)、1％(W/V)和2％(W/V)，之后混合溶液以获得吸附的FFA破伤风疫苗制剂。获得的制剂分装在具有1ml体积的玻璃瓶中，使得每瓶含有0.6ml的制剂，然后把瓶密封。把获得的吸附FFA破伤风疫苗制剂按照日本健康和福利部的通报217：“SeibutsugakutekiSeizai Kijun(生物产品最小需求)”标题为“吸附破伤风类毒素”的规定进行各种检验。结果证明获得的制剂是合格的疫苗。
实施例4
利用FFA破伤风疫苗产生吸附的DPT组合疫苗制剂
除了吸附FFA破伤风疫苗的最终蛋白质浓度变为180μg/ml外，按照和实施例3中实质上相同的方式制备吸附FFA疫苗。分别制备吸附百日咳疫苗和吸附白喉类毒素，使每种类毒素浓度和疫苗浓度变为起作用浓度的3倍。把吸附FFA破伤风疫苗、吸附白喉类毒素和吸附百日咳疫苗混合在一起以获得吸附DPT组合疫苗制剂。把获得的制剂分装在具有10ml体积的玻璃瓶中，以便每瓶含有10ml的制剂，然后把瓶密封。把获得的吸附的DPT组合疫苗制剂按照日本健康和福利部的通报217：“SeibutsugakutekiSeizai Kijun(生物产品最小需求)”标题为“吸附白喉-百日咳-破伤风组合疫苗”的规定进行各种检验。结果证明获得的制剂是合格的组合疫苗。
实施例5
利用FFA破伤风疫苗产生吸附DT组合疫苗制剂
除了吸附FFA破伤风疫苗的最终蛋白质浓度变为120μg/ml外，按照和实施例3中实质上相同的方式制备吸附FFA破伤风疫苗。制备吸附白喉类毒素，使类毒素浓度变为起作用浓度的2倍。把吸附FFA破伤风疫苗和吸附白喉类毒素混合在一起以获得吸附DPT组合疫苗制剂。把获得的制剂分装在具有1ml体积的玻璃瓶中，使得每瓶含有0.6ml的制剂，然后把瓶密封。把获得的吸附DT组合疫苗制剂按照日本健康和福利部的通报217：“Seibutsugakuteki Seizai Kijun(生物产品最小需求)”标题为“吸附白喉-破伤风组合疫苗”的规定进行各种检验。结果证明获得的制剂是合格的组合疫苗。
实施例6
干燥的FFA破伤风疫苗制剂的产生
按照和实施例2中实质上相同的方式制备FFA破伤风疫苗制剂。把获得的FFA破伤风疫苗制剂分装在具有1ml体积的玻璃瓶中，以便每瓶含有0.6ml的制剂，之后，把制剂冷冻干燥以获得干燥的FFA破伤风疫苗制剂。然后把瓶密封。把其中的一个瓶开封，用无菌蒸馏水溶解干燥的FFA破伤风疫苗制剂，由此得到0.6ml的疫苗溶液，把获得的疫苗溶液按照日本健康和福利部的通报217：“Seibutsugakuteki Seizai Kijun(生物产品最小需求)”标题为“破伤风类毒素”的规定进行各种检验。结果证明获得的制剂是合格的组合疫苗。
实施例7
样品FFA破伤风疫苗的产生和评价其免疫力
除了使用的条件有如下变化外，以实质上与实施例1相同的方式通过利用细胞外毒素产生疫苗和评价产生疫苗的免疫力。变化的条件是：
在35℃时破伤风杆菌的种子培养物的培养时间变为6天。按照如下方法从通过凝胶过滤利用Ultrogel AcA 34柱获得的整个破伤风毒素分子(带切口的形式)溶液制备FFA。把DTT-Tris缓冲液(参见参考实施例8)加入到上述的整个破伤风毒素分子溶液中，加入的量为每2mg的整个破伤风毒素分子溶液加入1ml，之后混合。然后在25℃反应60分钟以减少毒素分子中二硫键，其后，通过加入一定量(使尿素的最终浓度为4M)固体尿素的尿素处理产生的反应混合物。将反应混合物加入到用缓冲液A平衡的(包含2mM尿素溶液和1mM DTT的Tris-HC1，pH7.0)PD10柱(瑞典Pharmacia生物技术公司制造并出售)中，并且利用缓冲液A进行洗脱以便用缓冲液A代替形成的混合物中的DTT-Tris缓冲液。将包含游离(dissociated)毒素的形成的洗脱物通过用缓冲液A平衡的Mono Q柱进行柱色谱，其中利用FPLC((瑞典Pharmacia生物技术公司制造并出售)和缓冲液B(把NaCl加入缓冲液A形成的，其中的NaCl浓度以0-0.5的线性梯度增加)进行洗脱。按照与实施例1中相同的方式对获得的洗脱物进行分析。结果发现洗脱物组分中具有在280nm的峰，并且最早获得的组分为FFA。
通过在包含0.2％(V/V)福尔马林和0.025M赖氨酸(在35C混合2周)的0.067M磷酸缓冲液(Na-K，pH值为7.8)的混合物中培养FFA溶液固定FFA。获得的固定过的FFA用于制备FFA破伤风疫苗。
以与实施例1第(6)项实质上相同的方式用小鼠通过4组试验来评价样品FA破伤风疫苗的免疫力。结果如表3所示。从表3可以明显看出，样品FFA破伤风疫苗具有和包含整个破伤风毒素类毒素的对照疫苗实质上相同水平的免疫力。
表1样品类毒素 相对免疫力 置信界限(P＝0.95)纯化的整个毒素类毒素 1.0FFA： 0.970 0.636-1.478
纯化的整个毒素类毒素：包含整个破伤风毒素类毒素的疫苗
FFA：包含FFA的破伤风疫苗
表2
通过真皮内注射施用 用于致敏的抗原和真皮内反应的程度的抗原量(μg)
常规类毒素 纯化的整个破伤风类毒素 FFA常规类毒素 3.2 +6 +6+3
1.0 +6 +5+2
0.32 +5 +5 +1纯化的整个 3.2 +6 +6 +1破伤风类毒素 1.0 +4 +5 +1
0.32 +5 +5 *0FFA 3.2 +5 +5 +1
1.0 +3 +3 *0
0.32 +1 +2*0对照 0 *0 *0 *0
常规类毒素：商业途径可以得到的破伤风类毒素
纯化的整个破伤风类毒素：包含整个破伤风毒素类毒素的疫苗
FFA：包含FFA的破伤风疫苗
用选自7种指示(*0-+6)的指示表明真皮内反应程度，依据下列标准，基于红斑的大小(E)，其中的E是下式的值：
红斑的大直径(mm)×红斑的小直径(mm)：*0：(0≤E＜1)，+1：(1≤E＜20)，+2：(20≤E＜40)，+3：(40≤E＜60)，+4：(60≤E＜80)，+5：(80≤E＜100)，和+6：(100≤E)。
表3样品类毒素 相对免疫力 置信界限(P＝0.95)纯化的整个毒素类毒素：1.0FFA： 1.158 0.563-2.382纯化的整个毒素类毒素：包含整个破伤风毒素类毒素的疫苗FFA：包含FFA的破伤风疫苗
序列表SEQ ID：1序列长度：1315序列类型：氨基酸拓扑结构：线性分子类型：肽序列描述Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn1 5 10 15Asn Asp Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu
20 25 30Asp Ile Iyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile
35 40 45Val Pro Glu Arg Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn
50 55 60Pro Pro Ser Ser Leu Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro
65 70 75Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr
80 85 90Met Val Lys Leu Phe Asn Arg Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu
95 100 105Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile Asn Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn
110 115 120Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe Asp Thr Asn Ser Asn Ser Val
125 130 135Ser Phe Asn Leu Leu Glu Gln Asp Pro Ser Gly Ala Thr Thr Lys
140 145 150Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe Gly Pro Gly Pro Val
155 160 165Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu Arg Val Asp Asn
170 175 180Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser Ile Met Gln
185 190 195Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Val Pro Thr Phe Asp Asn Val Ile
200 205 210Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe Gln
215 220 225Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His
230 235 240Gly Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Ser His Glu Ile Ile Pro Ser
245 250 255Lys Gln Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu
260 265 270Glu Leu Phe Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile
275 280 285Asp Ile Lys Asn Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys
290 295 300Ala Ile Ala Asn Lys Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro
305 310 315Asn Ile Asp Ile Asp ger Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr
320 325 330Gln Phe Asp Lys Asp Ser Asn Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp
335 340 345Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn Ser Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu
350 355 360Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn Ile Lys Thr Arg Leu Ser Tyr
365 370 375Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys Ile Pro Asn Leu Leu Asp
380 385 390Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe Asn Ile Glu Ser Lys
395 400 405Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met Arg Val Asn Thr
410 415 420Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Val Ser Lys Leu
425 430 435Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile Arg Glu
440 445 450Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly Glu
455 460 465Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Thr Phe Ile Ala Glu
470 475 480Lys Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Ile Val Ser
485 490 495Tyr Asn Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp
500 505 510Lys Ile Ile Val Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro
515 520 525Leu Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr Val Asn Thr Gln Phe Gln
725 730 735Lys Arg Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Val Asp
740 745 750Ala Ile Lys Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly
755 760 765Pro Asp Lys Glu Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn
770 775 780Lys Leu Glu Glu Lys Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile
785 790 795Phe Met Arg Glu Ser Ser Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile
800 805 810Asn Glu Ala Lys Lys Gln Leu Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys
815 820 825Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
830 835 840Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu Ser Lys Ile Asn Lys Val Phe
845 850 855Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser Lys Asn Leu Asp Cys Trp
860 865 870Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile Leu Lys Lys Ser Thr
875 880 885Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile Ser Asp Ile Ser
890 895 900Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala Gln Leu Val
905 910 915Asn Asp Arg Thr Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro
530 535 540Glu Tyr Lys Ser Asn Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile
545 550 555Asp Asp Asn Thr Ile Tyr Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser Pro
560 565 570Thr Thr Leu Gln Arg Ile Thr Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala
575 580 585Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile
590 595 600Ser Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln Gly Ile Leu Phe Leu Gln Trp
605 610 615Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu Ser Ser Gln Lys
620 625 630Thr Thr Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser Thr Ile Val Pro Tyr
635 640 645Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly Tyr Glu Gly Asn
650 655 660Phe Ile Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gly Val Val Leu Leu Leu Glu
665 670 675Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu Ser Ile
680 685 690Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile Asp
695 700 705Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys
710 715 720Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn Glu Ser
920 925 930Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn Asp
935 940 945Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys
950 955 960Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Gly Thr Asn Glu Tyr Ser
965 970 975Ile Ile Ser Ser Met Lys Lys His Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly
980 985 990Trp Ser Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys
995 1000 1005Asp Ser Ala Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Pro
1010 1015 1020Asp Lys Phe Asn Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr
1025 1030 1035Ile Thr Asn Asp Arg Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly
1040 1045 1050Val Leu Met Gly Ser Ala Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg
1055 1060 1065Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn
1070 1075 1080Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala
1085 1090 1095Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser
1100 1105 1110Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp
1115 1120 1125Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Ser Ser Ser Lys Asp Val
1130 1135 1140Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr Asn Ala Pro
1145 1150 1155Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg Leu Tyr
1160 1165 1170Asn Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn Glu
1175 1180 1185Ile Asp Ser Phe Val Lys Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val
1190 1195 1200Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly
1205 1210 1215Asn Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn
1220 1225 1230Ala Pro Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu
1235 1240 1245Arg Asp Leu Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp
1250 1255 1260Lys Asn Ala Ser Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile
1265 1270 1275Gly Asn Asp Pro Asn Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr
1280 1285 1290Phe Asn His Leu Lys Asp Lys Ile Leu Gly Cys Asp Trp Tyr Phe
1295 1300 1305Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp Thr Asn Asp
1310 1315
工业适用性
按照本发明，本发明提供了用于破伤风疫苗的FFA(破伤风毒素功能性片段抗原)，其不仅和常规毒素类毒素相比对于减少不利副作用是极其有利的，而且具有与常规的破伤风类毒素实质上相同的免疫力。
通过利用本发明的FFA作为破伤风疫苗的活性组分，可以提供一种破伤风疫苗，这种疫苗不仅和常规毒素类毒素疫苗相比对于减少不利副作用是极其有利的，而且具有与常规的破伤风类毒素疫苗实质上相同的免疫力。
此外，也可以以组合疫苗形式提供上述破伤风疫苗，这种组合疫苗包含破伤风疫苗和至少一种不同于破伤风疫苗的疫苗(如百日咳疫苗和白喉疫苗)。
机译： 破伤风毒素的功能性抗原片段和破伤风疫苗
机译： 破伤风毒素和破伤风疫苗的功能性片段抗原
机译： 破伤风毒素和破伤风疫苗的功能性片段抗原
