用于生产重组腺病毒伴随病毒的包装细胞系及应用

摘要

能用于生产重组腺病毒伴随病毒(AAV)的包装细胞系AE1201,是用EB病毒复制子载体pEB－AAV转染人肺癌细胞系A549,经抗性筛选构建的AAV结构基因以多拷贝附加子形式稳定存在并自主复制的AAV反式包装细胞系。EB病毒复制子载体pEB－AAV含有AAV基因组编码所有病毒蛋白基因的191～4484核苷酸序列元件、EB病毒质粒型复制子及其反式作用因子、真核细胞抗性选择标志、以及带大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性基因的大肠杆菌质粒骨架。细胞系AE1201在辅助的腺病毒或单纯疱疹病毒诱导时,能表达AAV基因组编码的蛋白,以提供反式功能用于包装携带外源基因的AAV基因组,用于生产重组AAV病毒颗粒。

说明书

本发明涉及一种能用于生产重组腺病毒伴随病毒(Adeno-associated virus，AAV)的包装细胞系及其用途，特别涉及将AAV全基因组但不包含其两端反向重复序列(Inverted terminalrepeats，ITRs)的191～4484核苷酸共约4.3kb序列，克隆于以EB病毒复制子为基础的自主复制型载体而产生的AAV-EBV嵌合质粒型载体转染细胞系A549，经抗性选择，所建立的细胞系AE1201。细胞系AE1201能表达AAV基因组编码的蛋白，以提供反式功能用于包装携带外源基因的重组腺病毒伴随病毒(recombrant adeno-associated virus，rAAV)的基因组，从而可用于生产rAAV。

AAV属于微小病毒科，它的基因组是单链DNA，由4682个核苷酸组成，两端各有145个核苷酸的反向重复序列，是AAV基因组的复制起点和与复制及整合相关的顺式序列元件的所在，病毒基因组的编码信息按蛋白的功能可分成两部分，左端(Rep区)编码与病毒复制、转录必需的蛋白，右端(Cap区)编码病毒结构蛋白。

AAV是非自主复制的病毒，它的产毒性复制需要有辅助病毒如腺病毒ADV或单纯疱疹病毒HSV的协助才能进行。当辅助病毒不存在时，AAV感染人细胞后，病毒DNA以很高的频率整合于宿主染色体的特定位置，建立隐性感染，不产生子代病毒；但当宿主细胞被腺病毒或单纯疱疹病毒感染时，可将AAV从整合于染色体的原病毒状态激活，并从中拯救出来，从而破坏了AAV的隐性感染，复制产生子代AAV毒粒。

AAV分子生物学的一个重要特点是，用克隆于大肠杆菌质粒的AAV全基因组，转染细胞，当有腺病毒或单纯疱疹病毒感染时，质粒中的AAV基因组也可被拯救出来，产生野生型的AAV毒粒。这一特性构成了制备重组AAV病毒载体的理论基础。

含AAV全基因组的质粒，通过遗传工程的方法，去除了基因组中用于编码病毒蛋白的部分或全部序列元件，仅保留AAV基因组中两端的ITRs，插入了相当于被删去AAV基因片段大小的外源DNA，可得到含外源基因的重组AAV病毒表达载体质粒(I)；同时，除去克隆化AAV全基因组两端的ITRs，保留其编码病毒蛋白的全部基因序列，可得到用于辅助重组AAV载体包装的助手包装质粒(II)，它转染细胞后，在辅助病毒如ADV或HSV存在时，可表达与AAV辅助和包装必需的病毒蛋白，但由于缺失了复制必需的顺式元件，不能进行复制和包装出野生型AAV毒粒。而当感染了辅助病毒的细胞共转染I和II这两种质粒时，(转染方法可以是磷酸钙共沉淀法或脂质体介导的转染)，助手包装质粒II表达的反式蛋白，识别重组AAV病毒表达载体质粒I中AAV的ITRs顺式作用元件，将重组AAV两端的ITRs连同外源基因一起从质粒I中拯救出来，进行复制和包装出重组AAV病毒颗粒。采用化学或物理手段除去和灭活辅助病毒，得到的重组AAV毒粒可作为一种转导性载体，通过病毒感染的方式将外源基因导入到细胞中，并可整合于宿主染色体中而得到稳定的表达。与逆转录病毒载体相比，重组AAV载体能转导有丝分裂后细胞和分化终端细胞，AAV具有超感染的特性，可进行重复感染，同时在人类至今还未发现与AAV直接相关的疾病，这些特点使它在人类疾病的基因治疗领域中具有应用前景。

目前制备重组AAV毒粒的方法基本上是按上述原理进行，也就是采用两种不同的AAV质粒共转染细胞，一种载体提供AAV的反式作用蛋白，另一种提供复制和包装必需的顺式序列元件和外源基因，在辅助病毒的协助下，获得携带外源基因的AAV毒粒。    

为提高重组AAV载体的包装效率，Samulski将克隆化野生型AAV基因组的两端ITRs用腺病毒5型基因组两端的重复序列所取代，获得AAV包装质粒pAd8(Samulski et al：Helperfree stocks of recombinant adeno-associated virus：normal intergration does not require viral geneexpression.J.Virology 63：3822-3828)，虽然ADV的末端重复能允许被导入已感染ADV的细胞中的pAd8按腺病毒复制的机制进行有限的扩增，但还未能离开上述的工作模式，尽管这过程相对简单，但操作起来仍较为繁琐。表现为由于没有获得一种能支持重组AAV复制和包装的细胞系的存在，每次操作都需要将两种载体共转染细胞，由于共转染两种载体同时到大量的细胞个体的频率较低，因此也影响到产生重组AAV病毒的效率。

Lebkowski等人(Applied Immune Science，Inc.)提出了一种改进，将带外源基因的重组AAV载体克隆于自主复制的EB复制子载体中，转化细胞后，细胞内可维持多拷贝的重组AAV载体的存在，该转化细胞感染上一种将AAV全基因组的蛋白编码序列重组于腺病毒E3区的重组腺病毒时，该重组腺病毒不仅能提供辅助病毒的功能，同时也表达出AAV包装所必需的反式蛋白，使细胞中多拷贝存在的，位于EB载体上的带外源基因的重组AAV基因组可被包装出重组AAV病毒颗粒(US5173414，US5354678)。这过程看起来相当简化，但使用起来对于克隆不同外源基因的重组AAV载体，都需要分别转染细胞，获得不同的转化细胞系后，才能进一步用重组腺病毒感染来包装出重组病毒。

将AAV基因组的所有编码病毒蛋白的序列元件转化到细胞，构建出一种能提供包装重组AAV的反式包装细胞系，能提供一种可行的包装重组AAV的简单通用的包装体系，Vincint等将AAV的基因组转化Hela细胞，获得整合了AAV基因组的包装细胞系，但包装重组病毒的效率很低，可能是受制于该转化细胞系中AAV基因组的低拷贝数和整合于受体细胞染色体中的AAV基因组的低效率表达所致(Vincint et al：Replication and packaging ofHIV envelope genes in a novel adeno-associated virus vector，Vaccine 90：353-359)。

本发明的目的是，提供一种能用于生产重组腺病毒伴随病毒的包装细胞系，它含有不包括两端包装信号ITRs的AAV全基因组编码序列，在辅助病毒存在时，能支持携带外源基因的重组AAV载体包装成重组AAV病毒颗粒。它的构建是由载体pEB-AAV转染细胞A549后，在潮霉素B选择压力下获得一种能高效提供反式包装重组AAV病毒的所有病毒蛋白的包装细胞系，我们将其命名为细胞系AE1201。AAV的全基因组蛋白编码信息在AE1201细胞染色体外以多拷贝的附加子形式稳定存在并自主复制，当此包装细胞系感染辅助病毒后，自主复制载体上的AAV的编码蛋白基因就能表达，如再转染进该细胞系含外源基因的重组AAV载体质粒，就能从质粒中拯救出来并包装成重组病毒。

本发明的特点是，包装细胞系AE1201中所含的自主复制载体pEB-AAV是采用EB病毒复制子载体荷载AAV的基因组序列。EB病毒复制子载体能游离于人细胞染色体外自主复制，能以较高的频率转染细胞，很容易通过抗药性筛选得到转化细胞系，只要培养液中加以抗生素压力，就能维持EB复制子载体在细胞中稳定存在，这样，AAV的基因不需整合到宿主细胞的染色体上，作为载体上目标基因，其表达由于处于附加子的环境，能保证AAV基因组中所有编码蛋白质的表达，不受细胞染色体的影响。

本发明的用于生产重组腺病毒伴随病毒包装细胞系所使用的自主复制载体，由以下DNA元件组成：

1，AAV病毒蛋白编码序列：AAV基因组191--4484核苷酸。

2，EB病毒质粒型复制子OriP及其反式作用因子EBNA-I。

3，真核细胞抗性选择标志(潮霉素B磷酸转移酶基因)。

4，大肠杆菌质粒骨架(包括大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性β内酰胺酶基因)。

本发明用于构建可生产重组腺病毒伴随病毒的包装细胞系的原始质粒有：

pEB-AAV：颜子颖等，中国专利申请号：96 105366.6，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号为CGMCC NO.0266)。

本发明用于构建可生产重组腺病毒伴随病毒的包装细胞系的原始细胞有：

人肺癌细胞系A549(ATCC CCL185)。

用质粒pEB-AAV转染人肺癌细胞系A549，经潮霉素选择，挑取克隆，扩大培养，即可建立能实施AAV包装功能的细胞系。我们将由此建立的细胞系命名为AE1201。此细胞系细胞可用含潮霉素100-400μg的1640或DMEM培养液培养，并维持其对重组AAV的包装功能。

细胞系AE1201中由于含有自主复制载体pEB-AAV，因而在辅助病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒诱导时，能表达AAV基因组编码的蛋白，并用于包装携带外源基因的重组AAV基因组，产生重组AAV病毒颗粒。此细胞系细胞已于1997年1月9日保存于中国典型培养物保存中心，登记如册的编号为CCTCC：C97001。

以下实施例对本发明的用于生产重组腺病毒伴随病毒的包装细胞系的制备和用途作了详细说明，但不意味着限制本发明的内容。在实施例中，所用的重组AAV载体质粒pAAVlac是AAV原始质粒pSub201(J.Virology，63：3822-3828，1989)AAV编码病毒蛋白部分4.3kb XbaII片段为一片段大小相同的β半乳糖苷酶的表达单位所取代，A549细胞是人肺癌细胞系(ATCC CCL185)。

荷载AAV的结构基因的自主复制型载体pEB-AAV是将AAV的基因组中191-4484的序列克隆于EB病毒复制子载体中。

实施例1：质粒的制备。

大肠杆菌DH5α/pEB-AAV接种于200ml LB培养液，37℃培养24小时，离心收菌体，加5ml溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/LEDTA，pH8.0)重悬菌体，冰浴下加10ml溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，5分钟后加7.5ml溶液III(100ml中含5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml)混匀，15000rpm离心1 5分钟，上清加0.6倍体积异丙醇沉淀。沉淀以2ml TE溶液(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH5.0)溶解，等体积酚-氯仿-异戊醇(24∶24∶1，v/v)抽提除蛋白质，然后在Sepharose 4B柱(15.0×1.0cm)凝胶过滤，收集流出的质粒峰，经乙醇沉淀和洗盐后，溶于纯水中即可。

实施例2：AAV反式包装细胞系AE1201的建立。

A549细胞以加10％的DMEM培养液培养，传代于100mm培养皿，当细胞呈70％汇片时，pEB-AAV采用Lipofectin试剂(BRL公司)，以脂质体转染法导入细胞，2-3天后，按1∶4稀传细胞于含200μg潮霉素B的培养液中，期间隔2、3天换新鲜的含潮霉素的培养液，除去死细胞，2-3周后长出细胞集落，挑出细胞集落扩增，获得质粒pEB-AAV在其中以附加子形式存在，并随细胞分裂周期自主复制的AAV反式包装细胞系AE1201。这个细胞系的传代培养应使用含100-400μg潮霉素B的1640或DMEM培养液，以确保质粒在细胞传代过程的维持。

实施例3：利用构建的反式包装细胞系AE1201制备重组AAV病毒颗粒。

实施例2所获的细胞系在使用时不加潮霉素B，传代于100mm培养皿，当细胞呈40％汇片时，接种5型腺病毒(ADV5)，接种的感染复数(multiplicity of infection，mio)可在1-5，感染2-4小时后，将10μg重组质粒采用Lipofectin试剂(BRL公司)，以脂质体转染法导入细胞，或以磷酸钙共沉淀法导入细胞，1天后，更换新鲜培养液继续培养，2-3天后，当细胞出现明显的细胞毒效应时，可收获混合了辅助病毒ADV5的重组AAV。收毒时，细胞培养液和细胞都回收，反复冻融或以超声处理使细胞完全裂解，离心去掉细胞碎片，56℃加热1小时以灭活腺病毒，再经0.22μm醋酸纤维膜过滤除菌，得到可用于转导细胞的重组AAVlac。

实施例4：重组AAV病毒颗粒转导培养人细胞系。

实施例3所获的带报道基因β半乳糖苷酶的重组腺病毒伴随病毒颗粒AAVlac可用于感染培养细胞系，在培养的A549细胞感染AAVlac，48小时后，以细胞化学的方法检测β半乳糖苷酶的表达，(Somatic Cell Mol.Genet.，13(3)，253-265，1987)，细胞以磷酸钠缓冲液洗涤2遍，加入含X-Gal的染色液，30分钟或更长时间后观察，可见被感染细胞因外源基因的表达而呈蓝色，其典型的转导效率为当病毒滴度为10⁷时，感染培养有10⁶个细胞的培养皿，可见培养皿的细胞全部变蓝。

实施例5：含质粒pEB-AAV的包装细胞系AE1201用于扩增重组AAV。

实施例2所获的细胞系AE1201在使用时不加潮霉素B，传代于100mm培养皿，当细胞呈80％汇片时，感染从实施例3所获的带报道基因β半乳糖苷酶的重组腺病毒伴随病毒颗粒AAVlac，24小时后，感染接种5型腺病毒(ADV5)，接种的感染复数(multiplicity ofinfection，mio)可在1-5，再过24-72小时后，当细胞出现明显的细胞毒效应时，可收获混合了辅助病毒ADV5的重组AAVlac。收毒时，细胞培养液和细胞都回收，反复冻融或以超声处理使细胞完全裂解，离心去掉细胞碎片，56℃加热1小时以灭活腺病毒，再经0.22μm醋酸纤维膜过滤除菌，得到可用于转导细胞的重组AAVlac，经此过程，可使AAVlac的滴度进一步提高。